CC BY
43
Кострома И. И., Сидорова Ж. Ю., Грицаев С. В., Тиранова С. А., Свитина С. П., Дрижун Ю. С., Мартынкевич И. С., Капустин С. И., Чечеткин А. В.
ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства», г. Санкт-Петербург
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ АБЕРРАНТНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ПРОМОТОРНЫХ ОБЛАСТЕЙ ГЕНОВ SOX7, P15INK4B И АНТАГОНИСТОВ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ WNT У БОЛЬНЫХ МИЕЛОДИСПЛАСТИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ.
Kostroma I.I., Sidorova Zh.Yu., Gritsaev S. V., Tiranova S. A., Svitina S. P., Drizhun J. S., Martinkevitch I. S., Kapustin S. I., Chechetkin A. V.
Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology, Saint-Petersburg
STUDY OF THE ROLE OF ABERRANT METHYLATION OF PROMOTER REGIONS OF SOX7, P15INK4B AND PATHWAY ANTAGONIST GENES IN PATIENTS WITH MYELODYSPLASTIC SYNDROME.
Резюме. Метилирование генов-супрессоров опухоли рассматривают как один из ключевых механизмов развития миелодиспластического синдрома (МДС).
С целью выявления ассоциации статуса метилирования генов SOX7, p15INK4b, SFRP1, SFRP4 и SFRP5 с отдельными клинико-гематологиче-скими показателями и общей выживаемостью (ОВ) проанализированы данные 46 больных МДС, установленного по классификации ВОЗ. Медиана возраста больных 67,5 года. Статус метилирования генов изучали методом метилспе-цифичной ПЦР.
Аберрантное метилирование одного и более генов обнаружено у 43 больных (93,5 %). С наибольшей частотой выявлялось метилирование SOX7 (84,8 % больных), SFRP1 (71,7 % больных) и p15INK4b (54,3 % больных). Метилирование одного, двух, трех, четырех и пяти генов одновременно имело место у 10,9 %, 28,3 %, 26,1 %, 19,6 % и 8,7 % больных, соответственно.
Доли больных с аберрантным метилированием SFRP1, SFRP4, SOX7 и p15INK4b в группах, выделенных по процентному содержанию бла-стов в костном мозге, не различались. Метилирование гена SFRP5 было более частой находкой у больных рефрактерной анемией с избытком бластов (РАИБ): 43,5 % против 13,0 % у больных без избытка бластов; OR = 5,1, 95 %CI: 1,2-22,3, p = 0,047. У больных без бластоза чаще выявлялись случаи с 0-1 метилированным геном: 26,1 % против 8,7 % у больных РАИБ. В то же время, в группе больных РАИБ увеличение содержания костномозговых бластов сопровожда-
Abstract. Epigenetic aberrations, including hypermethylation of CpG islands in tumor-suppressor genes, are supposed to be a key mechanism of myelodysplastic syndrome (MDS) development.
To find out the association between methylation status of SOX7, pl5INK4b, SFRP1, SFRP4 and SFRP5 genes and some hematological features and overall survival (OS), the data of 46 MDS patients with median age of 67.5 years were analyzed. MDS was diagnosed according to WHO classification. Methylation-specific PCR was used to study the methylation status.
Aberrant methylation of 1 and more genes was found in 43 patients (93.5 %). The most frequent findings were SOX7 (84.8 %), SFRP1 (71.7 %) and p15iNK4b (54.3 o%) genes methylation. Methylation of 1, 2, 3, 4 and 5 genes simultaneously was detected in 10.9 %, 28.3 %, 26.1 %, 19.6 % and 8.7 % ofpatients, respectively.
There was no difference in the number of patients with SFRP1, SFRP4, SOX7 andp15INK4b methylation in the groups with different bone marrow blast counts. Methylation of SFRP5 gene was more frequently seen in patients with refractory anemia with excess of blasts (RAEB): 43.5 %% vs 13.0 %% in patients without excess of blasts; OR = 5.1, 95 %/oCI: 1.2-22.3, p = 0.047. The patients without excess of blasts were characterized by methylation of 0-1 genes: 26.1 % vs 8.7 % of RAEB patients, although the difference was not significant. At the same time, there was the tendency to increased number of cases with 3-5 methylated genes in patients with 10-19 % blasts compared to patients with 5-9 % blasts. In the
лось увеличением числа случаев с 3-5 метилированными генами.
В общей группе не обнаружено корреляции числа метилированных генов с возрастом, уровнем бластных клеток в костном мозге и вариантом кариотипа. Увеличение числа метилированных генов не влияло на ОВ.
Сделано заключение об увеличении объема эпигенетических нарушений по мере прогрессии МДС с повышением числа генов с аберрантным метилированием, в частности, гена SFRP5.
Ключевые слова: миелодиспластический синдром, метилирование, ген, SOХ7, р151Ш4ь, SFRP1, SFRP4, SFRP5.
whole MDS group, there was no correlation between the number of methylated genes and patient's age, number of bone marrow blasts or karyotype. Increased number of methylated genes did not influence the OS in the group of MDS patients.
We conclude that MDS progression is associated with enhancement of epigenetic disturbances leading to increase of the number of methylated genes, in particular, SFRP5
Key words: myelodysplastic syndrome, methylation, gene, SOX7, p15INK4b, SFRP1, SFRP4, SFRP5.
Развитие миелодиспластического синдрома (МДС) — многоэтапный процесс сложного взаимодействия генетических и эпигенетических нарушений в стволовых клетках костного мозга с поврежденным гемопоэтическим микроокружением [1, 2]. Одним из принципиальных эпигенетических механизмов лейкозогенеза является метилирование островков CpG промо-торных областей генов-супрессоров опухоли, в норме находящихся в неметилированном состоянии. Участие аберрантного метилирования ДНК в формировании патологического клона опосредовано транскрипционной инактивацией генов [2, 3]. Отличительным свойством эпигенетических повреждений является их обратимость, что делает привлекательной идею внедрения в клиническую практику ингибиторов ДНК-метилтрансфераз или так называемых азану-клеозидов (например, 5-азацитидина). Поэтому вполне обоснованным представляется интерес гематологов к изучению статуса метилирования генов как возможного механизма прогрессии МДС, самостоятельного фактора прогноза заболевания и перспективного маркера оценки эффективности гипометилирующих препаратов.
Данные литературы свидетельствуют о наличии аберрантного метилирования в целом ряде генов у больных МДС [4-7]. В отдельных исследованиях было установлено, что частота гиперметилирования ДНК ассоциирована с возрастом, количеством бластных клеток в костном мозге (КМ), цитогенетическими поломками, вариантом прогноза по шкале IPSS [4-8]. В ряде публикаций было продемонстрировано значение
аберрантного метилирования как предиктора общей (ОВ) и безлейкозной выживаемости [4, 5, 7]. Отдельным авторам удалось обнаружить сопряженность ОВ и эффективности терапии с числом метилированных генов [9, 10]. Так, М. Grovdal et al. [9] констатировали отсутствие ответа на стандартную цитостатическую терапию у больных острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) и МДС, у которых до начала курса было выявлено одновременное метилирование генов p15INK4b, CDH и HIC. В свою очередь, М. Abaigar et al. [10] установили значимое снижение ОВ больных МДС, получавших терапию 5-азацитидином, в случае обнаружения 2 и более генов с метилированием островков CpG.
Непосредственное участие сигнального пути Wnt в регуляции процессов выживаемости, пролиферации и дифференцировки гемопоэтиче-ских стволовых клеток дает основание рассматривать его повреждения, включая метилирование отдельных генов, в качестве потенциального механизма лейкозогенеза, в том числе у больных ОМЛ и МДС [11-13]. Функционирование сигнального пути Wnt осуществляется в тесном контакте с генами семейства SOX. В частности, при их взаимодействии осуществляется контроль над экспрессией опухоль-ассоциированных генов, таких как c-Myc и Cyclin D. В свою очередь, продукт гена SOX7, относящегося к подсемейству F, подавляет активность сигнального пути Wnt/p-cathenin [14].
Ранее нами было обнаружено аберрантное метилирование генов SOX7 и p15INK4b у значительного числа больных ОМЛ и МДС [8]. Цель
данного исследования, в котором расширена панель изучаемых генов за счет анализа статуса метилирования промоторных областей трех генов антагонистов сигнального пути Wnt (SFRP1, SFRP4 и SFRP5),— выявить ассоциативную связь между числом генов с аберрантным метилированием и отдельными клинико-гематоло-гическими показателями, а также ОВ в группе больных МДС. Полученные данные планируется использовать для последующего обоснования назначения 5-азацитидина больным МДС низкого риска и возможной комбинации 5-азацитидина с другими лекарственными средствами больным высокого риска.
Материалы и методы.
Для решения поставленной цели были использованы данные 46 больных, диагноз МДС у которых был верифицирован или подтвержден в гематологической клинике ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России по результатам морфологического, цитохимического, гистологического, цитоге-нетического и иммунологического обследования. Отдельные варианты МДС были диагностированы согласно критериям классификации ВОЗ [15]. Критерием включения в анализ явилось отсутствие в анамнезе больного указания на терапию азануклеозидами в течение 6 месяцев, предшествующих заготовке образца периферической крови. Вариант прогноза МДС определяли по шкале IPSS-R [16].
После подписания больным информированного согласия осуществляли забор периферической крови. Геномную ДНК выделяли стандартным способом [17]. До проведения исследования образцы ДНК хранили при температуре -20оС. Статус метилирования генов SOX7, p15INK4b, SFRP1, SFRP4 и SFRP5 изучали посредством метилспецифической полимеразной цепной реакции (methylation-specific PCR, MSP) [4,13,18].
Статистическую обработку данных осуществляли по точному методу Фишера. Для описания межгрупповых различий использовали показа-
тель «отношение шансов» (OR) с 95 % доверительным интервалом (CI) и ^-значение. Кривые Каплан-Майера были использованы для расчета показателей ОВ.
Результаты.
Среди обследованных больных было 20 мужчин и 26 женщин в возрасте от 24 до 88 лет, медиана составила 67,5 лет. Распределение по отдельным вариантам МДС было следующим: 4 больных рефрактерной анемией (РА), 3 рефрактерной анемией с кольцевыми сидеробластами (РАКС), 6 с изолированной del(5q), 10 рефрактерной цитопенией с мультилинейной дисплази-ей (РЦМД) и 23 рефрактерной анемией с избытком бластов (РАИБ). В группе РАИБ у 7 больных содержание бластных клеток в КМ было в диапазоне от 5 до 9 % (РАИБ-1) и у 16 больных от 10 до 19 % (РАИБ-2).
Кариотип был изучен у 44 больных. Из них у 18 (40,9 %) выявлен нормальный кариотип, у 8 (18,2 %) изолированная del(5q), у 8 (18,2 %) комплексный кариотип, т.е. 3 и более хромосомные аберрации, и у 10 (22,7 %) больных детектировались другие варианты цитогенетических поломок.
По результатам MSP, метилирование одного и более генов было обнаружено у 43 из 46 обследованных больных (93,5 %). Отсутствие признаков аберрантного метилирования промо-торных областей исследованных генов наблюдалось у одного больного с изолированной del(5q) и двух больных РЦМД. Встречаемость аберрантного метилирования исследованных генов была следующей: SOX7 у 39 больных (84,8 %), SFRP1 у 33 (71,7 %), p15INK4b у 25 (54,3 %), SFRP4 у 13 (6,5 %) и SFRP5 у 13 больных (6,5 %). Таким образом, аберрантное метилирование в генах SOX7, SFRP1 и p15INK4b было более частой находкой, чем в генах SFRP4 и SFRP5.
Частота аберрантного метилирования генов в зависимости от варианта МДС представлена в таблице 1.
Таблица 1.
Частота аберрантного метилирования изученных генов при различных вариантах заболевания
Вариант МДС Доля лиц с аберрантным метилированием гена, n > %)
SFRP1 SFRP4 SFRP5 SOX7 p15INK4b
РА 3(75,0) 2(50,0) 0 (0,0) 4(100,0) 3(75,0)
del(5q) 5(83,3) 0 (0,0) 0 (0,0) 4(66,7) 2(33,3)
РАКС 3(100,0) 3(100,0) 2(66,7) 3(100,0) 3(100,0)
РЦМД 7(70,0) 1(10,0) 1(10,0) 7(70,0) 2(20,0)
РАИБ-1 5(71,4) 1(14,3) 2(28,6) 5(71,4) 4(57,1)
РАИБ-2 10(62,5) 6(37,5) 8(50,0) 16(100,0) 11(68,8)
Продолжение страницы
Вариант МДС Доля лиц с аберрантным метилированием гена, n > %)
SFRP1 SFRP4 SFRP5 SOX7 p15lNK4b
< 5 % бластов в КМ: РА, РАКС, РЦМД, del(5q) 18 (78,3) 6(26,1) 3(13,0) 18(78,3) 10(43,5)
> 5 % бластов в КМ: РАИБ-1, РАИБ-2 15(65,2) 7(30,4) 10(43,5) 21(91,3) 15(65,2)
Учитывая незначительное число больных с отдельными вариантами МДС, для установления возможной прогностической значимости статуса метилирования изученных генов были сформированы 2 равные группы в зависимости от процентного содержания бластных клеток в КМ: < 5 % (23 пациента) и > 5 % (23 пациента).
Число больных с аберрантным метилированием генов SFRP1, SFRP4, SOX7 и p15INK4b в указанных группах не различалось. В то же время, метилирование гена SFRP5 значительно чаще обнаруживалось у больных РАИБ, чем при других вариантах МДС: 43,5 % против 13,0 %, соответственно; OR=5,1, 95 % CI: 1,2-22,3; p = 0,047 (рис. 1).
Рисунок 1. Статус метилирования генов в группах больных с разным бластозом в костном мозге
Примечание: По вертикали — отдельные больные
Для установления прогностической значимости количества метилированных генов дополнительно были выделены группы больных с 0-1 и 2-5 метилированными генами (табл. 2). Осно-
ванием для выбора разграничительного уровня послужили данные литературы о снижении эффективности азануклеозидов в случае обнаружения 2 и более метилированных генов [10].
Таблица 2.
Количество метилированных генов у больных с различными вариантами заболевания
Варианты МДС Количество метилированных генов, n ( %)
0 1 2 3 4 5
РА 1(25,0) 2(50,0) 1(25,0)
del(5q) 1(16,7) 1(16,7) 2(33,3) 2(33,3)
РАКС 1(33,3) 2(66,7)
РЦМД 2(20,0) 2(20,0) 3(30,0) 2(20,0) 1(10,0)
Продолжение страницы
Варианты МДС Количество метилированных генов, п ( %)
0 1 2 3 4 5
РАИБ-1 5(71,4) 1(14,3) 1(14,3)
РАИБ-2 2 (12,5) 2(12,5) 5(31,3) 5(31,3) 2(12,5)
< 5 % бластов в КМ: РА, РАКС, РЦМД, Се!(5д) 6 (26,1) 17 (73,9)
> 5 % бластов в КМ: РАИБ-1, РАИБ-2 2 (8,7) 21 (91,3)
Независимо от морфологических вариантов, преимущественной находкой в обеих группах было метилирование 2 и более генов: у 73,9 % больных с < 5 % бластов и у 91,3 % больных с > 5 % бластов. Следует отметить, что случаи с метилированием 0-1 генов в 3 раза чаще встречались в группе больных с благоприятными морфологическими вариантами, нежели у больных РАИБ: 26,1 % против 8,7 %, соответственно (ОЯ=3,7 95 %С1: 0,7-20,1;р = 0,24).
Наряду с этим, обращает внимание тот факт, что у всех больных РАКС число генов с метилированием промоторных областей было > 4, в отличие от больных другими благоприятными морфологическими вариантами, у которых аберрантное метилирование одновременно в 4 генах было представлено лишь единичными наблюдениями. Что касается больных с избытком бластных клеток, то нарастание бластоза сопровождалось тенденцией к увеличению случаев с 3-5 метилированными генами: 75,0 % больных РАИБ-2 против 28,5 % больных РАИБ-1; ОЯ=7,5 95 %С1:1,0-55,2; р = 0,066.
При корреляционном анализе не выявлено ассоциации числа метилированных генов с возрастом больных, количеством бластных клеток (< 5 % против > 5 %) и вариантами кариотипа. Увеличение числа метилированных генов с 0-1 до 2-5 также не влияло на ОВ обследованных больных МДС; р = 0,433. Вместе с тем, уровень бластных клеток в КМ (< 5 % против > 5 %), так же, как варианты кариотипа и прогноза по шкале IPSS-R, позволяли стратифицировать больных на группы, значимо различающиеся по показателям ОВ: р = 0,0004; р = 0,048 и р = 0,003 соответственно.
Обсуждение.
Результаты проведенного исследования свидетельствуют, прежде всего, о том, что метилирование генов-супрессоров лейкозной трансформации является ранним биологическим механизмом патогенеза МДС. Основанием для такого заключения является достаточно высокая частота аберрантного метилирования изученных генов у больных с низким содержанием бласт-ных клеток в КМ (табл. 1, 2; рис. 1).
Обнаружение гена SFRP5 в метилированном состоянии преимущественно у больных с избытком бластов и, прежде всего, в группе РАИБ-2, в совокупности с выявлением аберрантного статуса генов SFRP1 и SFRP4 в группах больных с разным процентом бластов в КМ (табл. 1, 2; рис. 1), позволяет сформулировать следующие предположения. Во-первых, о важности аберрантного метилирования гена SFRP5 как позднего эпигенетического события, возникновение которого сопряжено со значительным объемом бластных клеток. Во-вторых, о наличии ассоциативной связи между прогрессией МДС и увеличением числа метилированных генов-антагонистов сигнального пути Wnt. Косвенным подтверждением данного предположения является обнаружение случаев с метилированием единичных генов преимущественно у больных без избытка бластов и отчетливая тенденция к увеличению числа генов с аберрантным метилированием до 3-5 у больных РАИБ-2.
Несмотря на указанные находки, не удалось выявить четкой корреляции между числом метилированных генов и уровнем бластных клеток в КМ. Отчасти это может быть обусловлено объединением в одну группу больных РАИБ-1 и РАИБ-2 вследствие их малочисленности. Другая возможная причина заключается в обособленности группы больных РАКС, в которой число метилированных генов во всех случаях достигало 4-5. Является ли это случайной находкой или закономерным явлением для данного варианта МДС, предстоит выявить по мере накопления достаточного объема клинико-лабо-раторных данных.
Не удалось обнаружить корреляции числа метилированных генов с вариантами кариотипа больных МДС. Возможно, это явилось следствием выбранного метода распределения пациентов по группам. В отличие от большинства исследователей, которые сравнивали группы больных с нормальным кариотипом и остальными цито-генетическими вариантами, нами были выделены 4 группы: с нормальным и комплексным кариотипом, с изолированной del(5q) и другими
аберрациями. В то же время, не исключено, что метилирование генов и хромосомные перестройки — два независимых биологических феномена, хотя некоторые авторы отмечают тот факт, что неблагоприятные цитогенетические поломки нередко сопровождаются более частым выявлением аберрантного метилирования генов-супрессоров [6]. По всей видимости, следствием вышеназванных находок явилось отсутствие корреляции между количеством метилированных генов и ОВ обследованных больных. Вместе с тем, был подтвержден статус прогностических маркеров таких показателей, как количество бластов в КМ, вариант кариотипа и вариант по шкале IPSS-R.
Обнаружение метилирования островков CpG у больных МДС с благоприятным прогнозом позволяет рассматривать азануклеозиды как возможную лечебную опцию при неэффективности эритропоэзстимулирующих, иммуномодулиру-ющих или иммуносупрессивных препаратов. Подтверждением могут быть данные о достижении ответа у 30-60 % больных МДС низкого риска при назначении 5-азацитидина [19]. Однако вопрос об ассоциации эффективности
5-азацитидина со статусом метилирования опре-деленного(-ых) гена(-ов) и/или числом генов с аберрантным метилированием в этой группе больных МДС остается открытым. В свою очередь, увеличение числа генов с метилированием островков CpG у больных РАИБ-2 может сопровождаться снижением эффективности азанукле-озидов [10]. Этим больным оправданной может быть лечебная тактика, которая подразумевает не отмену 5-азацитидина в случае отсутствия ответа после 6 стандартных курсов терапии, а добавление нового препарата, в частности, малых доз цитарабина [20].
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о возрастании объема эпигенетических нарушений по мере прогрессии МДС, связанного с увеличением числа генов с аберрантным метилированием, в частности, путем дополнительного метилирования островков CpG в гене SFRP5. Полученные данные о характере метилирования генов на разных этапах развития МДС обосновывают модификацию терапии аза-нуклеозидами этой сложной категории онкоге-матологических больных.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гематология. Под ред. проф. Рукавицина О. А.— ГЭОТАР-Медиа, 2015.— 776 с.
2. Baylin S. B. DNA methylation and gene silencing in cancer. Nat Clin Pract Oncol 2005; 2 (Suppl 1): 4-11.
3. Issa J. P. CpG island methylator phenotype in cancer. Nat Rev Cancer 2004; 4 (12): 988-993.
4. Fan R., Zhang L. Y., Wang H., et al. Methylation of the CpG island near SOX7 gene promoter is correlated with the poor prognosis of patients with myelodysplastic syndrome. Tohoku J Exp Med 2012; 227 (2): 119-128.
5. Wang H., Wang X. Q., Xu X. P., Lin G. W. ID4 methylation predicts high risk of leukemic transformation in patients with myelodysplastic syndrome. Leuk Res 2010; 34 (5): 598-604.
6. Yang Y., Zhang Q., Xu F. et al. Aberrant promoter methylation of Dab2 gene in myelodysplastic syndrome. Eur J Haematol 2012; 89 (6): 469-477.
7. Aggerholm A., Holm M. S., Guldberg P. et al. Promoter hypermethylation of P15ink4b, HIC1, CDH1 and ER is frequent in myelodyplastic syndrome and predicts poor prognosis in early stage patients. Eur J Haematol 2006; 76 (1): 23-32.
8. Грицаев С. В., Сидорова Ж. Ю., Капустин С. И. и др. Анализ статуса метилирования генов р^шгав и SOX7 у больных миелодиспластическим синдромом и острым миелоидным лейкозом. Гематология и трансфузиология 2015; 60 (1): 12-17.
9. Grovdal M., Khan R., Aggerholm A. et al. Negative effect of DNA hypermethylation on the outcome of intensive chemotherapy in older patients with high-risk myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia following myelodysplastic syndrome. Clin Cancer Res 2007; 13 (23): 7107-7112.
10. Abaigar M., Ramos F., Benito R. et al. Prognostic impact of the number of methylated genes in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias treated with azacytidine. Ann Hematol 2013; 92 (11):1543-1552
11. Valencia A., Roman-Gomez J., Cervera J. et al. Wnt signaling pathway is epigenetically regulated by methylation of Wnt antagonists in acute myeloid leukemia. Leukemia 2009; 23 (9): 1658-1666.
12. Wang Y., Krivtsov A. V., Sinha A. U. et al. The Wnt/beta-catenin pathway is required for the development of leukemia stem cells in AML. Science 2010; 327 (5973): 1650-1653.
13. Wang H., Fan R., Wang X. Q. et al. Methylation of Wnt antagonist genes: a useful prognostic marker for myelodysplastic syndrome. Ann Hematol 2013; 92 (2): 199-209.
14. Guo L., Zhong D., Lau S. et al. Sox7 is an independent checkpoint for beta-catenin function in prostate and colon epithelial cells. Mol Cancer Res 2008; 6 (9): 1421-1430.
15. Vardiman J. W., Thiele J., Arber D. A. et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood 2009; 114 (5): 937-951.
16. Greenberg P. L., Tuechler H., Schanz J. et al. Revised international prognostic scoring system for myelodysplastic syndromes. Blood 2012; 120 (12): 2454-2465.
17. Miller S. A., Dykes D. D., Polesky H. F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucl Acid Res 1988; 16 (3): 1215-1218.
18. Herman J. G., Graff J. R., Myohanen S. et al. Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands. PNAS1996; 93 (18): 9821-9826.
19. Fili C, Malagola M., Follo M. Y. et al. Prospective phase II study on 5-days azacitidine (5d-AZA) for treatment of symptomatic and/or erythropoietin unresponsive patients with low/int-1 risk myelodysplastic patients. Clin Cancer Res 2013; 19 (12): 3297-3308.
20. Radujkovic A., Dietrich S., Bochtler T. et al. Azacitidine and low-dose cytarabine in palliative patients with acute myeloid leukemia and high bone marrow blast counts — a retrospective singlecenter experience. Eur J Haematol 2014; 93 (2): 112-117.
