CC BY
221
БИОХИМИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДСТВО
УДК 663.051:631.811.98
Зав. лаб. вирусологии Л.Л. Бунцевич, мл. науч. сотрудник Е.Н. Беседина, мл. науч. сотрудник М.А. Костюк
(ФГБНУ «Северо-Кавказский зональный научно-
исследовательский институт садоводства и виноградарства») лаборатория вирусологии, тел. 8-961-533-61-47 E-mail: leobun@mail.ru
Heard of Laboratory L.L. Buntsevich, Junior Research Associate E.N. Besedina, Junior Research Associate M.A. Kostyuk
(Federal State Budget Scientific Organization «North Caucasian Regional Research Institute of Horticulture and Viticulture») Laboratory of Virology, tel. 8-961-533-61-47 E-mail: leobun@mail.ru
Изучение препарата Л-1, янтарной кислоты и её солей в качестве стимуляторов роста эксплантов растений in vitro
The studying preparations L-l, amber acid and its salts as growth stimulants of plantlets in vitro
Реферат. Препараты янтарной кислоты (янтарная кислота, сук-цинат калия, сукцинат натрия) используются в пищевой промышленности как регуляторы кислотности, а также как БДДы. В сельском хозяйстве их используют как регуляторы роста. Целью исследований стало изучение рострегулирующих свойств названных соединений и синтезированного в КубГТУ препарата Л-1 в культуре in vitro плодовых растений. Задача исследований заключалась в том, чтобы сравнить воздействие опытных стимуляторов роста на экспланты сливы сорта Стенли in vitro и выявить препараты, обеспечивающие выход здоровых развитых микропобегов, пригодных для дальнейшего укоренения и адаптации. Исследования выполнены согласно методикам В.А. Высоцкого, Е.Н. Джигадло. Статистическая обработка данных проведена по Б.А. Доспехову. Полученные экспериментальные данные по результатам клонального микроразмножения эксплантов сливы сорта Стенли на питательных средах, содержащих изучаемые стимуляторы роста, позволяют считать, что сукцинат калия и сукцинат натрия в концентрации 4 мг/л стимулируют линейный рост (вытягивание) микропобегов; янтарная кислота (4 мг/л) стимулирует регенерацию листочков у микропобегов и их размножение (мультипликацию); все три ростовых вещества (янтарная кислота, сукцинат калия и сукцинат натрия) улучшают
© Бунцевич Л.Л., Беседина Е.Н., Костюк М.А., 2015
общее состояние микропобегов, в т.ч. снижают уровень витрификации и хлороза тканей микропобегов; природа ростовой активности б-БАП и экспериментальных препаратов янтарная кислота, сукцинат калия, сукцинат натрия носит антагонистический характер; препарат Л-1 проявил себя как ретардант ростовых процессов у эксплантов сливы in vitro.
Summary. Derivatives of amber acid (amber acid, potassium succinate, sodium succinate) are used in the food industry as acidity regulators and as dietary supplements, in agriculture they are used as growth regulators. The aim of our researches is to study the growth-regulatory properties of these compounds and synthesized in KubSTU substance L-l in an in vitro culture of fruit plants. The objective of the study is to compare the effects of growth factors on the experimental plum explants Stanley variety in vitro and identify substances to ensure development of healthy microshoots suitable for further rooting and adaptation. The studies were performed according to the methods of V.A. Vysotsky, E.N. Dzhigadlo. Statistical data processing was conducted by B.A. Dospehov. The experimental data on the results of micropropagation plum plantlets variety Stanley on nutrient media containing growth factors studied suggest that potassium succinate and sodium succinate at a concentration of 4 mg / L stimulates linear growth (pulling) microshoots; amber acid (4 mg / 1) stimulates the regeneration of leaves at microshoots and reproduction (multiplication); all three growth substances (amber acid, potassium succinate and sodium succinate improves overall state of microshoots, including lower levels of vitrification and chlorosis tissue of microshoots; the nature of the growth activity of 6-BAP and experimental drugs amber acid, potassium succinate, sodium succinate is antagonistic, the drug L-l showed himself as a retardant growth processes in plum plantlets in vitro.
Ключевые слова: регуляторы роста, клональное микроразмножение, слива сорта Стенли, янтарная кислота, сукцинат калия, сукцинат натрия, коэффициент размножения.
Keywords: growth regulators, micropropagation, plum variety Stanley, amber acid, potassium succinate, sodium succinate, coefficient of multiplication.
В пищевой промышленности в качестве регуляторов кислотности используются такие препараты, как янтарная кислота, сукцинат калия, сукцинат натрия. Они также применяются как БАДы [1, 2] и регуляторы роста в сельском хозяйстве [4]. Нами поставлена цель - изучить рострегулирующие свойства названных соединений и синтезированного в КубГТУ препарата Л-1 в культуре in vitro плодовых растений. Задача исследований заключалась в том, чтобы сравнить воздействие опытных стимуляторов роста на экспланты сливы сорта Стенли in vitro и выявить препараты, обеспечивающие выход здоровых развитых микропобегов, пригодных для дальнейшего укоренения и адаптации.
Исследования выполнены согласно методикам В. А. Высоцкого (1980), Е.Н. Джигадло (2005). Статистическая обработка данных проведена по Б.А. Доспе-хову (1985). Были испытаны следующие препараты: янтарная кислота, сукцинат калия, сукцинат натрия, Л-1 (табл. 1). В качестве контроля использовали среду МС с БАП 1 мг/л.
Таблица 1
Характеристика химических соединений
Шифр или тривиальное название Состав
Л-1 (разработан в КубГТУ) 2- Метил-2,5-диэтокси-2,5-дигидрофуран
Янтарная кислота 97,5 %-ная 1,4-бутандиовая кислота
Сукцинат калия Дикалиевая соль янтарной кислоты
Сукцинат натрия Динатриевая соль янтарной кислоты
Для введения в культуру in vitro отбирались верхушечные почки с черенков сливы сорта Стенли. В культуру in vitro вводились экспланты размером 1-2 мм, которые располагали в культивационных сосудах так, чтобы они соприкасались абак-сиальной частью со средой.
При приготовлении питательных сред применяли минеральные основы по прописи Мурасиге-Скуга [3]. Среды автоклавировали при температуре 120 °С и давлении 1 атм в течение 20 мин в вертикальных автоклавах ВК-30. Все работы по стерилизации и плановые пересадки растительного материала осуществляли в ла-минар-боксе С-1,2 (код 110.120).
Культивирование микропобегов осуществляли в условиях стандартного фотопериода 16/8 (день - 16 ч, ночь - 8 ч), освещенности 2500-3000 люкс, при температуре плюс (23±3) °С и влажности 50-60 %. Каждые 30-40 сут проводили субкультивирование новых побегов на свежую питательную среду. Экспериментальные ростовые вещества были испытаны как самостоятельно в качестве единственного регулятора роста в среде в течение двух пассажей, так и в сочетании со стандартным регулятором роста 6-БАП при введении их в питательную среду через пассаж.
При оценке результативности микроклонирования учитывали коэффициент размножения (отношение суммы всех сформированных побегов в каждом варианте к числу исходных эксплантов), наличие стебля, интенсивность окраски листьев (хлороз или здоровая интенсивно-зелёная окраска листьев), число листьев у экс-планта, наличие корней, образование раневого каллуса, уровень витрификации тканей, общее состояние мериклонов по 5-балльной шкале, длину микропобегов (табл. 2).
Таблица 2
Качественный анализ регенерированных микропобегов сливы сорта Стенли на средах с различными регуляторами роста после двух пассажей
Испыт. компоненты сред Коэффициент размножения, ед. Наличие стволика, % от общего числа Хлороз. % Число листьев, шт. Наличие корней, % Наличие каллуса, % Витрпфпкацпя, % Общ. сост-е по 5-балльной, шкале Длина микропобегов (высота) в мм
1. Стандарт: 6-БАП 1 мг/л 1-2 пассаж 3,7 100 27 6,3 - 64 9 4,2 20,9
2. Янтарная кислота 4 мг/л 1-2 пассаж 1,7 100 5 7,7 - 37,5 0 4,4 22,
3. Сукцпнат калия 4 мг/л 1-2 пассаж 1,0 100 30 4,7 - 0,0 0 4,3 24,7
4. Сукцинат натрия 4 мг/л 1-2 пассаж 1,0 100 25 4,9 - 0,0 0 4,2 23,9
5. Л-1 4 мг/л 1-2 пассаж 2,5 100 63 4,3 30, 0 3,1 17,3
6. 1-й пассаж - янтарная кислота 4 мг/л, 2-й пассаж - БАП 1 1,5 100 0 5,5 33,0 0 3,9 17,3
мг/л
7. 1-й пассаж - сукцинат калия 4 мг/л, 2-й пассаж - БАП 1 мг/л 1,5 100 20 5,6 - 17,0 0 3,9 17,8
8. 1-й пассаж - сукцинат натрия 4 мг/л, 2-й пассаж - БАП 1 мг/л 2,0 100 17 6,2 - 50,0 7 4,0 20,7
9. 1-й пассаж - Л-1 4 мг/л, 2-й пассаж - БАП 1 мг/л 1,7 100 15 5,8 - 30 11, 0 4,0 17,4
НСРоз 0,7 0,8 0,4 2,3
Из табл. 2 видим, что общее состояние микропобегов незначительно улучшается в сравнении со стандартом (4,2 балла) при культивировании на питательной среде, содержащей янтарную кислоту (4,4 балла) или сукцинат калия (4,3 балла, рис. 1). Воздействие сукцината натрия на общее состояние микропобегов сливы равнозначно стандарту (4,2 балла, табл. 2). Несмотря на несущественные колебания оценки общего состояния до 0,2 баллов от стандарта можем говорить о близости эффекта воздействия янтарной кислоты, сукцината калия и натрия в концентрации 4 мг/л к эффективности 6-БАП 1 мг/л среды.
На питательной среде, содержащей препарат Л-1, микропобеги развиваются слабее (3,1 балл), чем на среде с 6-БАП (4,2 балла, НСР 0,4, рис. 1).
При чередовании в питательных средах экспериментальных стимуляторов роста и 6-БАП показатели общего состояния во всех вариантах (с янтарной кислотой, сукцинатом калия, натрия) несущественно ниже стандарта (соответственно 3,9, 3,9, 4,0 балла) и ниже значений для вариантов самостоятельного использования янтарной кислоты, сукцината калия, натрия (соответственно 4,4, 4,3, 4,2 балла, табл. 2). Налицо эффект замещения ростовой активности 6-БАП и экспериментальных стимуляторов роста в отличие от ожидаемого эффекта аккумулирования ростовой активности БАП и янтарной кислоты, сукцината калия, натрия. Подобный результат может свидетельствовать о различной или даже антагонистической природе ростовой активности 6-БАП и изучаемых янтарной кислоты, сукцината калия, натрия.
г*
I
i
а
б
в г
Рис. 1. Микропобеги сливы на средах: а - с Л-1 4 мг/л; б - с сукцинатом калия 4 мг/л; в - с янтарной кислотой 4 мг/л; г - с 6-БАП 1мг/л
По воздействию на линейный рост микропобегов сливы in vitro сукцинат калия и натрия существенно опережают стандарт (соответственно 24,7, 23,9 и 20,9 мм, НСР 2,3). Янтарная кислота также способствует некоторому усилению роста микропобегов по сравнению с 6-БАП (соответственно 22 мм и 20,9 мм, табл. 2).
Препарат Л-1 оказывает существенное негативное влияние на рост микропобегов - микропобеги на среде с Л-1 в среднем на 3,6 мм короче стандарта (НСР 2,3 мм, табл. 2, рис. 1).
При чередовании в питательных средах экспериментальных стимуляторов роста и 6-БАП показатели прироста микропобегов хуже во всех изученных вариантах в сравнении со стандартом - янтарная кислота + БАП 17,3 мм, сукцинат калия + +БАП 17,8 мм, сукцинат натрия + БАП 20,7 мм, Л-1 + БАП 17,4 мм, стандарт 6-БАП 20,9 мм (табл. 2), что подтверждает предположение о различной или даже антагонистической природе ростовой активности 6-БАП 1 мг/л питательной среды и изучаемых янтарной кислоты, сукцината калия, натрия в концентрации 4 мг/л среды.
Одной из основных характеристик ростовых процессов является формирование облиственности, важной для микрорастения как аппарат фотосинтеза, с учётом пазушных почек, формирующихся в основании каждого листа, в качестве потенциала последующего побегообразования. Установлено, что янтарная кислота при добавлении в питательную среду способствует развитию существенно большего числа листьев (в среднем 7,7 шт) по сравнению с 6-БАП (6,3 шт, НСР 0,8, табл. 2, рис. 1). Сукцинат калия, сукцинат натрия и Л-1, наоборот, угнетают функцию заложения пазушных почек на микропобегах и формирование листовых зачатков -на питательных средах с перечисленными препаратами микропобеги сливы формируют 4,7, 4,9, 4,3 листочка, что существенно меньше, чем в стандарте (6,3 листочка, НСР 0,8, табл. 2). Для сукцината калия и сукцината натрия выявленная эффективность носит закономерный характер с учётом их стимулирующего влияния на линейный рост (вытягивание) микропобегов сливы in vitro.
Чередование в питательных средах экспериментальных стимуляторов роста и 6-БАП повысило уровень заложения листочков на микропобегах до уровня, близкого к стандарту на среде с сукцинатом калия до 5,6 шт, с сукцинатом натрия -6,2 шт, с Л-1 - 5,8 шт в среднем (стандарт 6,3, НСР 0,8, табл. 2). На среде с янтарной кислотой проявился эффект антагонизма с БАП - микропобеги регенерировали только 5,5 листочков в среднем (стандарт 6,3, НСР 0,8, табл. 2).
Негативной особенностью некоторых ростовых веществ, в т.ч. и 6-БАП, является способность вызывать витрификацию тканей эксплантов in vitro. В нашем исследовании уровень витрификации тканей микропобегов сливы в стандарте (6-БАП 1 мг/л среды) составил 9 % (табл. 2). У микропобегов, развившихся на питательных средах с янтарной кислотой, сукцинатом калия, натрия, препаратом Л-1, витрифи-кация отсутствует полностью (табл. 2).
Другим негативным следствием некомплементарности питательных сред и эксплантов является хлороз тканей. В наших исследованиях в стандартном варианте (6-БАП 1 мг/л) хлоротизировали 27 % микропобегов, что наносит значительный ущерб технологии клонального микроразмножения (табл. 2). При добавлении в питательную среду янтарной кислоты (4 мг/л) количество хлоротизировавших побегов существенно снижается и составляет только 5 % (табл. 2). При сочетании одного пассажа с янтарной кислотой и следующего пассажа с 6-БАП хлоротичные побеги отсутствуют вовсе (табл. 2).
Остальные испытанные препараты (сукцинат калия, сукцинат натрия, Л-1) незначительно влияют на уровень хлорозов микропобегов сливы in vitro (табл. 2).
Способность к индукции каллусогенеза, как одна из изучаемых характеристик экспериментальных стимуляторов роста, в целом не характерна для цитокининов, к которым относится 6-БАП. Однако экспланты сливы сорта Стенли на питательной среде, содержащей 6-БАП 1 мг/л, регенерировали каллус у 64 % микропобегов (табл. 2). Следует отметить, что каллусогенез при клональном микроразмножении растений является негативным фактором, ухудшающим питание микропобегов, их рост и развитие. Поэтому для этапа регенерации и мультипликации микропобегов желательно подбирать стимуляторы роста, не индуцирующие каллусогенез у эксплантов. Из экспериментальных ростовых веществ только сукцинат калия и натрия не индуцируют рост каллуса (табл. 2). Добавление в питательную среду янтарной кислоты значительно снижает уровень каллусообразования микропобегами
сливы как в чистом виде, так и в чередовании с 6-БАП (соответственно 37,5 и 33 %, табл. 2).
Известно, что основной характеристикой цитокининов, используемой в кло-нальном микроразмножении растений, является их способность индуцировать мультипликацию (ветвление) регенерировавших микропобегов. В нашем исследовании эта характеристика отражается коэффициентом размножения и составила в стандарте (6-БАП 1 мг/л) 3,7 ед. (табл. 2). Из экспериментальных препаратов незначительное размножение регенерировавших микропобегов получено на среде с янтарной кислотой (коэф. размножения 1,7) и Л-1 (коэф. размножения 2,5, табл. 2).
Таким образом, полученные экспериментальные данные по результатам кло-нального микроразмножения эксплантов сливы сорта Стенли на питательных средах, содержащих изучаемые стимуляторы роста, позволяют считать, что:
- сукцинат калия и натрия в концентрации 4 мг/л стимулируют линейный рост (вытягивание) микропобегов,
- янтарная кислота (4 мг/л) стимулирует регенерацию листочков у микропобегов и их размножение (мультипликацию),
- все три ростовых вещества (янтарная кислота, сукцинат калия и натрия) улучшают общее состояние микропобегов, в т.ч. снижают уровень витрификации и хлороза тканей микропобегов,
- природа ростовой активности 6-БАП и экспериментальных препаратов янтарная кислота, сукцинат калия, натрия носит антагонистический характер,
- препарат Л-1 проявил себя как ретардант ростовых процессов у эксплантов сливы in vitro.
ЛИТЕРАТУРА
1. Сукцинаты натрия, калия и кальция / Товароведение и экспертиза товаров [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.znaytovar.ru/new3140.html. 171. Загл. с экрана.
2. Деримедведь, Л.В. Бады на основе янтарной кислоты. Фармакологический анализ [Электронный ресурс] / Л.В. Деримедведь, В.А. Тимченко // Журнал «Провизор». - 2002. - Вып. 13. - Режим доступа: http://www.provisor.com.ua/archive/2002/N13/art_39. html. Загл. с экрана.
3. Ненько, Н.И. Применение регуляторов роста в питомниководстве косточковых и семечковых культур [Текст] / Н.И. Ненько, А.П. Кузнецова, А.А. Воронов // Садоводство и виноградарство. - 2009. - № 4. - С. 6-9.
4. Murashige, Т. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaceo tissue cultures [Text]/ T. Murashige, F. Skoog // Physiol Plant. - 1962. - V. 15. - № 95.
- P. 473-497.
REFERENCES
1. Sodium succinate, potassium succinate and calcium succinate / Commodity and examination of goods [Electronic resource]. - Access: http://www.znaytovar.ru/new3140.html. 171
2. Derimedved, L.V. Dietary supplements on the basis of amber acid. Pharmacological analysis [Electronic resource] / L.V. Derimedved, V.A. Timchenko / / Magazine "Pharmacist". - 2002 - Vol. 13. - Access: http://www.provisor.com.ua/archive/2002/N13/art_39. html.
3. Nenko, N.I. The use of growth regulators in seed and stone fruit nursery crops [Text] / N.I. Nenko, A.P. Kuznetsova, A.A. Voronov //Horticulture and viticulture.
- 2009. - No 4. - P. 6-9.
4. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaceo tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol Plant. - 1962. - V. 15, № 95.
- P. 473-497.
