CC BY
14ЭФФЕКТИВНОЕ август
ЖИВОТНОВОДСТВО
УДК 575.22
Широкова Н. В., кандидат биологических наук
ФГБОУ ВО Донской государственный аграрный университет
Гетманцева Л. В., кандидат с.-х. наук
Бакоев Н.Ф., младший научный сотрудник
Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени Л. К. Эрнста
ИЗУЧЕНИЕ МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО ПОЛИМОРФИЗМА У ОВЕЦ САЛЬСКОЙ ПОРОДЫ
В последние годы изучение молекулярной генетики внесло свой вклад в более глубокое признание использования генетической информации сельскохозяйственных животных. Это привело к созданию междисциплинарных программ геномов разных видов животных. Исследования генетического разнообразия отечественных пород овец становится необходимым условием для их сохранения, дальнейшего совершенствования и использования для нужд современного агропромышленного комплекса РФ.
икросателлиты — особый класс ДНК-маркеров. Они представляют собой фрагменты ДНК с большим количеством — до сотни и даже выше — тандемно повторяющихся идентичных «мотивов», обычно называемых «повторами»: короткими последовательностями из нескольких (как обычно принято считать — от одной до шести) пар нуклеотидов [1, 2, 7].
Микросателлиты высокополиморфны, с десятками аллелей в каждом локусе и высокими темпами мутирования. Аллели микросателлитного локуса отличаются друг от друга длиной, в основном числом повторов. Небольшие размеры микросателлитных локусов позволяют применить метод полимеразной цепной реакции в целях генотипирования и обеспечить высокую воспроизводимость результатов в различных лабораториях.
В настоящее время в исследованиях генофонда различных пород и популяций, установления их генетической структуры и разнообразия применяют различные подходы, в том числе и молекулярно-ге-нетические методы, основанные на использование микросателлитных локусов [3, 4].
Полиморфизм микросателлитных локусов зависит от видовых, породных и индивидуальных особенностей животных. В связи с этим объединенный анализ микросателлитных данных, полученных в независимых исследованиях, крайне желателен, но редко возможен [1, 5].
Целью работы было изучить полиморфизм микросателлитных локусов ОагСР549, СБРР247, РСБ20 и МДР65 у овец сальской породы и оценить целесообразность их включения в панель ДНК-маркеров для оценки генетического разнообразияи достоверности происхождения сальской породы овец.
Материалы и методы исследования. Исследования полиморфизма микросателлитных локусов
Oar CP549,CSRD247,FCB20 и MAF65 проводили в лаборатории молекулярных основ селекции отдела биотехнологии и молекулярной диагностики животных ВИЖ им. Эрнста. Для получения геномной ДНК были взяты образцы ткани у овец сальской породы (n=95) (ПЗ «Белозерное», Ростовская обл.). Выделение ДНК проводили набором Экстран 2 (ОАО «Синтол», Россия) согласно рекомендациям производителя. Анализ микросателлитов выполняли на шестнадцати капиллярном генетическом анализаторе АВ!3130х! Genetic Analyzer.
Для оценки полиморфизма локусов OarCP549, CSRD247, FCB20 и MAF65 учитывали количество аллелей на локус (NA); наблюдаемую (Но) и ожидаемую (Не) гетерозиготность, эффективное число аллелей на локус (Ае). Связь между индивидуальными особями и популяцией в целом определяли на основе индекса фиксации (Fis). Все расчеты были выполнены с использованием программы GenAlex.
Результаты исследований. Развитие ДНК-технологий послужило росту разнообразия молеку-лярно-генетических маркеров, используемых для изучения сельскохозяйственных животных. Все большую популярность сегодня завоевывают SNP-маркеры, однако для оценки генетического разнообразия большинство исследователей останавливают свой выбор на микоросателлитных локусах [7-9]. Среди списка локусов, предложенных сегодня для изучения генетического разнообразия овец, нами были выбраны локусы OarCP49,CSRD247, FCB20 и MAF65, последовательности которых представлены в международной базе данных (GenBankNCBI) под номерами U15702.1, EU009450.1,L20004.1 и M67437.1 соответственно.
Референсная последовательность локуса OarCP49 (GenBank: U15702.1) состоит из 88 пар нуклеотидов (gtggggatga atattccttc ataaggacat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgcgtttag ttgctaagcc gtgtctgt).
Спецвыпуск Золотая осень
www.agroyug.ru
Ж
Тандемные повторы представлены двумя нуклео-тидами д^ расположенными в последовательности в позиции 30-62. По данным !5ДС [6], общая длина последовательности варьируется от 72 до 132 п.н.
Результаты анализа локуса ОагСР49 у овец саль-ской породы показали наличие аллельных вариантов длиной 72-74, 80-96, 100-104, 110, 130 и 132 п.н. (табл. 1). В результате были определены 17 аллелей. Однако из них только 7 аллелей имели частоту более 0,05. Число эффективных аллелей по локусу у исследуемой группы овец было равно 7,0; наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность составили 0,85 и 0,84 соответственно (табл. 2).
Таблица 1. Аллельные варианты микроса-теллитных локусов ОагСР49, СБРР247, РСВ20, МАР65 у овец сальской породы
Размер (п.н.) Частота аллелей Размер (п.н.) Частота аллелей Размер (п.н.) Частота аллелей Размер (п.н.) Частота аллелей
ОагСР49 СБВ0247 РСВ20 МДР65
72 0,005 217 0,058 90 0,089 119 0,005
74 0,005 219 0,068 92 0,353 121 0,000
76 0,000 221 0,037 94 0,158 123 0,000
78 0,021 223 0,005 96 0,089 125 0,011
80 0,021 225 0,000 98 0,042 127 0,295
82 0,295 227 0,000 100 0,005 129 0,347
84 0,153 229 0,042 102 0,047 131 0,205
86 0,079 231 0,047 104 0,121 133 0,011
88 0,005 233 0,358 106 0,005 135 0,005
90 0,005 235 0,153 108 0,042 137 0,095
92 0,021 237 0,037 110 0,000 139 0,026
94 0,058 239 0,105 112 0,005
96 0,000 241 0,005 114 0,000
98 0,116 243 0,026 116 0,042
100 0,053 245 0,042
102 0,105 247 0,005
104 0,000 249 0,000
106 0,000 251 0,011
108 0,011
110 0,000
112 0,000
114 0,000
116 0,000
118 0,000
120 0,000
122 0,000
124 0,000
126 0,000
128 0,021
130 0,016
132 0,011
Последовательность локуса СБЯЭ247 (СепВапк: Е11009450.1) состоит из 217 п.н. (ддасИдсса да^йдсаа Идсйдадс сааИсШа сад1ааа1с1 сШсИйс Шасасаса сасасасаса сасасасаса сасасадМ Идс^даас сааИсШа са11ааа1сс ^дйсШа сасаааса1а сааасасаса сада!дса^ ^дИддйд Шсс^дда даасс^дас 1аа1дсааас сасад1д). Тандемные повторы динуклеотидов ас расположены в позиции 64-95 п.н. Длина последовательности варьируется от 209 до 261 п.н. [6].
У овец сальской породы по локусу СБЯЭ247 было установлено 15 аллелей, длина которых составила 217-223, 229-247 п.н. Среди них аллели длиной 221, 229, 231, 237, 243, 245 п.н. имели частоту менее 0,05 и 223 и 243 п.н. — менее 0,01 (табл. 1). Результаты оценки наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготно-сти, которые составили соответственно 0,684 и 0,820, указывают на дефицит гетерозигот по локусу СБЯЭ247 у овец сальской породы (табл. 2). Число эффективных аллелей по данному локусу у исследуемого поголовья составило 5,56.
Локус РСВ20 (СепВапк: 1.20004.1) в базе данных представлен последовательностью из 94 п.н. (ддаааасссс са!а!а!асс 1а1асаа1д1 д!д1д1д1д! gtgtgtgtgt д!д!д1д1а1 асасааасас atgtatggaa ^Иааасас аШ). Тандемные повторы ди-нуклеотидов gt расположены в позиции 29-58 п.н. Длина последовательности варьируется от 92 до 118 п.н. [6].
По локусу РСВ20у овец сальской породы было определено 12 аллелей, длина которых варьировалась в пределах 90-116 п.н. (табл. 1). В представленном диапазоне у изучаемой группы овец отсутствовали аллели длиной 110 и 114 п.н. и только 5 аллелей (90-96 и 104 п.н.) имели частоту больше 0,05. Наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность составили 0,832 и 0,812, эффективное число аллелей — 5,33 (табл. 2).
Последовательность локуса МДР65 (СепВапк: М67437.1) представляют 125 п.н. (сса^сйсс tgagaatata acatgtttct саНИсссд taaaacacca сасасасаса сасасасаса сасасасаса сасасаса^ cctttgaaat с^^ааИд catactctgg ссШ). Тандемные повторы динуклеотидов са расположены в позиции 49-89. Длина последовательности варьируется от 121 до 159 п.н. [6].
У овец сальской породы, в отличии от данных, представленных !5ДС, длина последовательности локуса МДР65 составила от 119 до 139 п.н. (табл. 1).
Таблица 2. Показатели генетического разнообразия овецсальской породы
о л Наблюдаемая гетерозиготность (Но) -и з ц_
ей Ожидаемая гетере готность (Не) и
Локус ле л л го о т с о ъи Эффективное ч аллелей ^ а с и ф с к е д н
ОагСР49 17 7,00 0,850 0,842 -0,010
СБВ0247 15 5,56 0,684 0,820 0,165
РСВ20 12 5,33 0,831 0,812 -0,020
МДР65 9 3,85 0,544 0,740 0,264
ЭФФЕКТИВНОЕ август
ЖИВОТНОВОДСТВО
Таким образом, изучение микросателлитных локусов OarCP49, CSRD247, FCB20 и MAF65y овец сальской породы показало наличие полиморфизма данных локусов. Наибольшее количество аллельных вариантов и эффективных аллелей было определено по локусу OarCP49. Дефицит гетерозигот в популяции отмечен по локусам CSRD247 и MAF65. В среднем по четырем локусам индекс фиксации составил 0,094, что можно рассматривать как тенденцию к повышению гомозиготности в стаде за счет использования родственного спаривания. Однако, недостаток гетерозигот в популяции можно интерпретировать и как один из критериев подразделенности, характеризующий уровень биологической организации популяции как целого. Для более достоверных выводов о гетерози-готности популяции, а также о генетическом разнообразии сальской породы овец, необходимо проводить дальнейшие исследования на основе широкого спектра генетических маркеров. Результаты представленной работы показали наличие полиморфизма микросателлитных локусов OarCP49, CSRD247, FCB20 и MAF65 и целесообразность их включения в панель ДНК-маркеров для оценки генетического разнообразия и достоверности происхождения сальской породы овец.
Работа выполнена при поддержке гранта Президента Российской Федерации от 22 февраля 2017 года №14.W01.17.1030-MK.
Литература:
1.
FAO. Guideline for Molecular Genetic Characterisation of Animal Genetic Resources. FAO Animal Production and Health Commission on Genetic Resources for Food and Agriculture — 2011 — № 9 — р. 100.
2. Денискова Т.Е., Селионова М.И., Гладырь Е.А., Доцев А.В., Бобрышова Г.Т., Костюнина О.В., Брем Г., Зиновьева Н.А. Изменчивость микросателлитов в породах овец, разводимых в России // Сельскохозяйственная биология — 2016 — Т.51. №6. — С. 801-810.
3. Gorlov I.F.,KolosovYu.A., Shirokova N.V., Getmantseva L.V., Slozhenkina M.I., Mosolova N.I., Bakoev N.F., Leonova M.A., Kolosov A.Yu., Zlobina E.Yu. Association of the growth hormone gene polymorphism with growth traits in Salsk sheep breed. Small Ruminant Research — 2017 — №150 — Р. 11-14.
4. Колосов Ю.А., Широкова Н.В., Карабиневский А.Н., Приступа В.Н., Орлова О.Н., Дмитриева Л.С., Скрыпник Л.В. Повышение эффективности овцеводства // Все о мясе — 2016 — №5 — С. 52-55.
5.
Guang-Xin E., Zhong T., Ma Y.-H., Gao H.-J., He J.-N., Liu N., Zhao Y.-J., Zhang J.-H., Hu Y.-F. Conservation genetics in Chinese sheep: diversity of fourteen indigenous sheep (Ovis aries) using microsatellite markers. Ecology and Evolution — 2016 — Vol.6 — №3 — P. 810-817. Kawçcka A., Gurgul A., Miksza-Cybulska A. The use of SNP microarrays for biodiversity studies of sheep — a review. Ann. Anim. Sci. — 2016 — Vol.16 — №4 —P. 975-987.
+7 (495) 2 20 32116,8(905) 5 M
www.bmvs.fu
email: bmu$< bmvî.ru
