CC BY
50
50 ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ
УДК 616.5:612.014.44:615.831
N.B. Morozova1, R.I. Yakubovskaya1, V.I. Chissov1,
V.M. Mizin2
G.M. Pleshkov2
STUDY OF SKIN PHOTOSENSITIVITY OF PHTHALOCYANINE SULPHONATED DERIVATIVES
IHertsen Moscow Research Institute of Oncology 2 State Research Center of Organic Products and Dyes Moscow
ABSTRACT
Skin photosensitivity of Phthalosens and Photosens, of the original preparations based on phthalocyanine sul-phonated derivatives, has been studied in intact mice. It has been revealed that Phthalosens photosensitivity decreased 4.5-5.9 times 7 days after its administration in 1.0 mg/kg and 0.5 mg/kg therapeutic doses versus Photosens photosensitivity that decreased only 1.6-2.5 times when administered in therapeutic doses of 5.0 mg/kg and 2.0 mg/kg. No necrotic scab is being formed 7 days after the irradiation with Phthalosens injected in therapeutic doses while after the administration of Photosens in 5.0 mg/kg dose a necrotic scab is being formed in the irradiated area and remains for more than 5 days. This means that Phthalosens skin photosensitivity is lower than that of Photosens.
Key words: skin photosensivity, phototoxicity, photodynamic therapy, a photosensitizer, biodistribution, Phthalosens, Photosens, a level of the normalized fluorescence.
Н.Б. Морозова1, Р.И. Якубовская1, В.И. Чиссов1,
В.М. Мизин2
2
Г.М. Плешков
ИЗУЧЕНИЕ КОЖНОИ ФОТОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ СУЛЬФИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ФТАЛОЦИАНИНА
ІФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Росздрава», Москва 2ФГУП ГНЦ РФ «НИОПИК», Москва
РЕЗЮМЕ
В работе изучали кожную фоточувствительность сульфированных фталоцианинов: нового оригинального препарата фталосенс и препарата фотосенс у здоровых мышей. Исследования показали, что через 7 сут после введения фталосенса его кожная фоточувствительность снижается в 4,5-5,9 раза при использовании терапевтических доз 1,0 и 0,5 мг/кг, а кожная фоточувствительность фотосенса в терапевтических дозах 5,0 и
2,0 мг/кг - только в 1,6-2,5раза. Образования некротического струпа через 7 сут после облучения с фтало-сенсом в терапевтических дозах не происходит, а с фотосенсом в дозе 5,0 мг/кг у мышей в зоне облучения образуется некротический струп, который сохраняется более 5 сут. Фталосенс обладает менее выраженной кожной фоточувствительностью, чем фотосенс.
Ключевые слова: фоточувствительность кожи, фототоксичность, фотодинамическая терапия, фотосенсибилизатор, биораспределение, фталосенс, фотосенс, уровень нормированной флюоресценции.
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы фотодинамическая терапия (ФДТ) привлекает все больший интерес как новая перспективная технология лечения онкологических больных, обладающая большими потенциальными возможностями для терапии злокачественных опухолей. При ранних или поверхностно расположенных опухолях регрессия может достигать 95-100 % [4]. Однако этот метод имеет недостаток, который ограничивает его использование в клинической практике. Это - кожная фототоксичность (КФТ), связанная с длительным удержанием фотосенсибилизаторов (ФС) в коже.
Фотосенсибилизаторы, разрешенные к применению в настоящее время (Photofrin, фотогем) и находящиеся на различных стадиях клинических испытаний (фотосенс и др.), обладают длительной кожной фототоксичностью [1; 2; 3; 7; 8], из-за которой пациенты вынуждены продолжительное время после окончания лечения соблюдать световой режим. Поэтому большое внимание в развитии метода ФДТ уделяется поиску и разработке новых сенсибилизаторов с низкой кожной токсичностью и путям ее снижения. В связи с этим актуальным является изучение КФТ красителей на стадии доклинического исследования.
В литературе описаны различные подходы к оценке повреждения кожи в рамках изучения кожной фоточувствительности ФС. В качестве объектов исследования используются экспериментальные животные: мыши, хомяки, крысы, свиньи. В отдельных случаях чувствительность кожи оценивают у пациентов, принимающих участие в I и II фазах клинических испытаний новых ФС [7; 8; 9; 10]. Для облучения используют, как правило, модулированный различными способами солнечный свет в интервале от 200 до 2500 нм с плотностью энергии 44,4-167 Дж/см2. Освещение проводят через 1-10 сут после введения препарата как в терапевтических дозах (ТД), так и в дозах, превышающих ТД в 3-5 раз [7]. Критериями оценки КФЧ может являться отек [7], эритема кожи [8; 9], морфологические изменения в коже, оцененные гистологическими методами [10].
Все эти методы позволяют оценить степень повреждения кожи при использовании различных сенсибилизаторов, визуально и гистологически, но не дают информации о фотоповреждении окружающей ткани во время сеанса ФДТ и сроках, в течение которых исчезают проявления кожной фототоксичности.
Цель данной работы - разработка простого доступного метода оценки кожной фоточувствительности на мышах для ФС на основе фталоцианинов.
Задачами исследования являлись: отработка скрининговой методики оценки кожной фототоксичности на здоровых мышах и изучение с помощью этого метода кожной токсичности нового препарата фталосенс в сравнении с его ближайшим аналогом - препаратом фотосенс, успешно применяемым в настоящее время в клиниках.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Описание препаратов
Препарат фталосенс на основе безметального сульфофталоцианина со средним содержанием суль-фогрупп, равным 2,5, и препарат фотосенс, на основе смеси ди-, три- и тетрасульфопроизводных фталоциа-нина алюминия (производство ФГУП «ГНЦ НИО-ПИК», Россия).
Животные
В работе использовали мышей-гибридов BDFl, здоровых самок весом 22-25 г, полученных из питомника «Столбовая».
Источники оптического излучения
Использовали 2 светодиодных источника оптического излучения. Источник оптического излучения для препарата фотосенс состоит из 1 светодиода с максимумом излучения 674-682 нм, диаметр светового пятна 10 мм. Источник оптического излучения для препарата фталосенс состоит из 3 светодиодов, имеющих угол расходимости выходного излучения 8° с максимумом излучения 685 нм. Световые пятна светодиодов совмещаются на расстоянии 25 мм от торцов их линз и имеют диаметр 10 мм. Плотность мощ-
ности контролировали с помощью измерителя ИПМО (НПО «Полюс», Москва).
Методика исследования кожной фоточувствительности
Кожную фоточувствительность оценивали у мышей, которым за 7 сут до облучения шерсть в месте облучения (правое бедро) удаляли с помощью крема-депилятора. Препараты вводили внутривенно в терапевтических дозах (ТД) (0,5 и 1,0 мг/кг - фталосенс,
2,0 и 5,0 мг/кг - фотосенс) [5]. В качестве анестезии применяли 0,25%-ный раствор droperidoli в дозе 0,25 мг/мышь, который вводили внутрибрюшинно за 15 мин до облучения.
Облучение проводили с использованием светодиодных источников красного света, длина волны которых соответствовала максимуму поглощения красителей: фотосенс - 674-682 нм и фталосенс - 685 нм. Плотность энергии составляла 90 Дж/см2 при плотности мощности 50 мВт/см2 и диаметре светового пятна 10 мм. Используемая плотность мощности на порядок больше плотности мощности солнечного излучения в спектральном диапазоне, соответствующем поглощению ФС.
Облучение депилированного участка бедра мыши проводили в течение 30 мин через различные интервалы времени (At) после введения красителей: 2 ч (фталосенс), 4 ч (фотосенс) - сроки максимального накопления в коже, а также 1 и 7 сут после их введения.
Состояние облученного участка кожи животных и размеры отека оценивали сразу после и через каждые 24 ч после облучения до полного исчезновения проявлений кожной токсичности. Проводили визуальную оценку состояния кожи (наличие или отсутствие струпа), а также измеряли толщину бедра в 2 взаимно перпендикулярных проекциях с помощью электронного цифрового кронциркуля STORM хм 3С301 «Central».
Критериями оценки кожной фоточувствительности являлись объем отека V и время его сохранения (Tv), наличие или отсутствие струпа и время его сохранения. Объем отека рассчитывали по формуле:
V = di х $2 х d^,
где di, d2 - 2 взаимно перпендикулярных толщины бедра мыши;
d3 - длина части бедра мыши, соответствующая диаметру светового пятна.
Рассчитывали также относительный объем отека (W) по формуле:
W = (V2 - V1) / Vi х 100 %,
где Vi и V2 - объемы отека до и через различные интервалы времени после облучения соответственно.
Время сохранения отека относительно контроля (т) рассчитывали по формуле:
т = (Tv0 - TvK) / TvK х 100 %,
где Tv0 и TvK - время сохранения отека в опытной и контрольной группах соответственно.
Статистическая обработка
Статистическую обработку проводили с помощью статистических программ с использованием критерия
Стьюдента. Достоверными считали отличия при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На начальном этапе исследования необходимо было выбрать и отработать методику исследования кожной фототоксичности сульфированных фталоциа-нинов (препаратов фталосенса и фотосенса) на здоровых мышах-гибридах BDF i.
В ходе работы решали следующие вопросы: обоснование выбора доз ФС; подбор адекватных источников облучения, плотности мощности и плотности энергии; определение интервалов времени между введением ФС и облучением (At); установление критериев качественной и количественной оценки кожной фототоксичности.
Ранее в исследованиях in vivo на животных-опухоленосителях нами показано, что терапевтические дозы фталосенса (0,5-1,0 мг/кг) в 4-8 раз ниже, чем фотосенса (2,0-5,0 мг/кг). Противоопухолевая активность при использовании ТД у фталосенса выше, чем у фотосенса [10]. Вследствие этого оценку кожной токсичности препаратов, а также фотоповреждение здоровой кожи после сеанса ФДТ проводили при использовании терапевтических доз: 0,5 и 1,0 мг/кг (фталосенс) и 2,0 и 5,0 мг/кг (фотосенс).
Максимум спектра поглощения фталосенса наблюдается при Х=685 нм, фотосенса - при Х=675 нм. Соответственно облучение проводили, используя светодиодные источники с максимумом излучения 685 нм (фталосенс) и 674-682 нм (фотосенс), плотность мощности - 50 мВт/см2, плотность энергии - 90 Дж/см2 (оптимальные условия облучения для исследуемых ФС). Учитывая, что фотоповреждение кожи происходит как во время сеанса ФДТ (характерная местная реакция кожи), так и после сеанса ФДТ (общая реакция кожи при несоблюдении светового режима), для одновременной оценки этих параметров были выбраны жесткие условия облучения. Метод позволяет оценить повреждение кожи в зоне облучения через различное время после инъекции ФС.
Интервалы времени между введением ФС и облучением (At) были подобраны с учетом их флюоресценции в коже [6]. С целью определения уровня мономерной, то есть фотоактивной формы ФС, проводили динамическое исследование флюоресценции в коже, которое для обоих препаратов оказалось дозозависимым.
Максимальное значение нормированной флюоресценции (ФН) фталосенса в коже наблюдается в интервале от 5 мин до 24 ч после введения. Оптимальным временем проведения ФДТ с препаратом фталосенсом является 2 ч. Максимальное значение нормированной флюоресценции фотосенса в коже наблюдается через 1-4 ч после введения. Оптимальным временем проведения ФДТ с фотосенсом является 4-24 ч. Поэтому облучение кожи проводили при максимальном накоплении ФС в коже в сроки, соответствующие срокам проведения ФДТ - 2 ч для фта-лосенса и 4 ч для фотосенса, а также после сеанса облучения через 24 ч и 7 сут после введения препаратов.
За основу критериев оценки кожной фоточувствительности были выбраны: эритема кожи (наличие или отсутствие струпа) - качественный критерий, объем отека (V) и время его сохранения (Ту) - количественный критерий.
Результаты проведенных исследований показали, что у всех животных после облучения в течение 1-х сут развивался отек, причем интенсивность отека зависела от дозы препарата для всех исследованных интервалов времени (рис. 1, А, Б и 2, А, Б).
Относительный объем отека (Щ) для всех интервалов времени с увеличением дозы красителей в 2-2,5 раза увеличивался в 1,5-2 раза. В последующий период времени отеки во всех группах медленно уменьшались. Фотоповреждение кожи во время сеанса ФДТ для препаратов фталосенса и фотосенса в ТД одинаково.
В то же время имеются существенные различия. Так, при увеличении интервала времени А1 между введением фталосенса и облучением до 7 сут т (время сохранения отека относительно контроля) пропорционально уменьшалось. Это свидетельствовало о снижении кожной фоточувствительности фталосенса
Рис. 1. Относительный объем отека (^) после облучения интактных мышей, получивших различные дозы фталосенса в зависимости от интервала между введением препарата и облучением:
Рис. 2. Относительный объем отека (^) после облучения интактных мышей, получивших различные дозы фотосенса в зависимости от интервала между введением препарата и облучением:
| - 7 сут.
через 7 сут после введения в 5,9 раза при использовании дозы 0,5 мг/кг и в 4,5 раза при использовании дозы 1,0 мг/кг. Для фотосенса при увеличении интервала до 7 сут т снижалась в 2,5 раза при использовании дозы 2,0 мг/кг и в 1,6 раза - при использовании дозы
5.0 мг/кг (см. таблицу).
У животных после введения фталосенса и облучения через 2 и 24 ч в течение 3 сут образовывался некротический струп, причем при облучении через 2 ч время сохранения струпа не зависело от дозы. При облучении через 7 сут после введения струпы отсутствовали. У животных после введения фотосенса некротический струп образовывался при использовании дозы
2.0 мг/кг только после облучения через 4 ч, а при использовании дозы 5,0 мг/кг струп образовывался после облучения через все интервалы времени. При облучении через 4 ч время сохранения струпа с увеличением дозы препарата увеличивалось. С увеличением интервала от 4 ч до 7 сут при использовании фотосенса в дозе 5 мг/кг время сохранения струпа уменьшалось.
Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что препарат фталосенс обладает менее продолжительной и менее выраженной кожной фоточувствительностью, чем применяемый в настоящее время препарат фотосенс.
ВЫВОДЫ
1. Разработан простой экономичный метод оценки кожной фоточувствительности, позволяющий в короткие сроки определить фототоксичность ФС в коже.
2. Проведено сравнение кожной фоточувствительности нового оригинального препарата фталосенс и препарата фотосенс в терапевтических дозах у здоровых мышей BDF1.
3. Показано, что фотоповреждение кожи во время сеанса ФДТ для фталосенса и фотосенса в ТД одинаково. Через 7 сут после введения препаратов в терапевтических дозах кожная фоточувствительность фталосенса ниже, чем фотосенса.
Время сохранения отека (Ту) и струпа после облучения мышей с фталосенсом и фотосенсом в зависимости от дозы препарата и времени после его введения. Световая доза 90 Дж/см2
Препарат Терапевтическая доза, мг/кг Интервал после введения препаратов, А1 Время сохранения отека Время сохранения струпа, сут
Ту, сутки т*, %
Фталосенс 0,5 2 ч 15,7±0,6 292,5 7,7±0,6
24 ч 12,7±1,3 217,5 4,3±2,0
7 сут 6,0±0,1 50,0 отсутствует
1,0 2 ч 19,0±1,9 375,0 7,7±2,1
24 ч 15,0±1,0 275,0 5,7±0,8
7 сут 7,3±0,6 82,5 отсутствует
Фотосенс 2,0 4 ч 18,0±0,9 300,0 6,0±0,9
24 ч 14,3±1,2 217,8 отсутствует
7 сут 10,0±1,9 122,2 отсутствует
5,0 4 ч 23,3±0,6 417,8 10,0±1,9
24 ч 19,9±1,9 322,2 6,7±2,1
7 сут 16,0±0.9 255,6 5,3±1,5
*Время сохранения отека относительно контроля, %
Работа выполнена в рамках Программы «Борьба со злокачественными новообразованиями» при финансовой поддержке мэрии г. Москвы и МКНТ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вакуловская Е.Г., Кувшинов Ю.П., Поддубный Б.К. Фотодинамическая терапия и флюоресцентная диагностика с фотосенсибилизатором фотосенс у больных раком желудка // РБЖ. - 2004. - Т. 3, № 4. -С. 61-5.
2. Вакуловская Е.Г., Летягин В.П., Погодина Е.М. Фотодинамическая терапия и флюоресцентная диагностика у больных раком молочной железы // РБЖ. - 2003. - Т. 2, № 4. - С. 57-60.
3. Новикова Е.Г., Трушина О.И., Соколов В.В., Филоненко Е.В. Флюоресцентная диагностика и фото-динамическая терапия предопухолевой патологии и начальной формы рака шейки матки // Российский онкологический журнал. - 2005. - № 6. - С. 28-33.
4. Избранные лекции по клинической онкологии. - Под ред. акад. РАМН В.И. Чиссова, проф. С.Л. Дарьяловой. - Москва, 2000. - С. 105-8.
5. Якубовская Р.И., Морозова Н.Б., Панкратов А.А. и др. Изучение фотоиндуцированной противоопухолевой активности препарата фталосенса у животных с опухолями различного гистогенеза // Российский онкологический журнал. - 2006. - № 3. - С. 26-32.
6. Якубовская Р.И., Морозова Н.Б., Чиссов В.И. и др. Биораспределение препарата фталосенса у ин-тактных животных и животных с опухолями различного гистогенеза // Российский онкологический журнал. - 2007. - № 1. - С. 37-42.
7. Anderson C.Y., Fristin K., Tubesing K.A. et al. A Comparative Analysis of Silicon Phthalocyanine Photosensitizers for in vivo Photodynamic Therapy of RIF-1 Tumors in C3H Mice // J. Photochemistry and Photobiology. - 1998. - Vol. 67(3). - P. 332-6.
8. Bellnier D.A., Greco W.R., Nava H. et al. Mild skin photosensitivity in cancer patients following injection of Photochlor (2-[1-hexyloxyethyl]-2-devinyl pyropheo-phorbide-a; HPPH) for photodynamic therapy // Cancer Chemother Pharmacol. - 2006. - Vol. 57(1). - P. 40-5.
9. Weersink R.A., Forbes J., Bisland S. et al. Assessment of cutaneous photosensitivity of TOO-KAD (WST09) in preclinical animal models and in patients // Photochem Photobiol. - 2005. - Vol. 81(1). - P.106-13.
10. Zellweger M., Padu A., Monnier P. et al. Fluorescence pharmacokinetics of Letetium Texaphyrin (PCI-0123, Lu-Tex) in the skin and in healthy and tumoral hamster cheek-pouch mucosa // J. Photochemistry and Photobiology. - 2000. - Vol. 55. - P. 56-62.
Поступила 28.12.2006.
