CC BY
41
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2017, том 52, № 5, с. 1004-1011
УДК 582.736:579.26:577.21 doi: 10.15389/agrobiok>gy.2017.5.1004rus
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ МИКРОСИМБИОНТОВ
КОПЕЕЧНИКА ЩЕТИНИСТОГО Hedysarum gmelinii subsp. setigerum, ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО В ПРИБАЙКАЛЬЕ*
А.Л. САЗАНОВА, И.Г. КУЗНЕЦОВА, В.И. САФРОНОВА, А.А. БЕЛИМОВ, Ж.П. ПОПОВА, Н.Ю. ТИХОМИРОВА, Ю.С. ОСЛЕДКИН
Одна из актуальных задач современной микробиологии и биотехнологии состоит в изучении механизмов взаимодействия бобовых растений с клубеньковыми бактериями (ризобиями) — обширной группой микроорганизмов, способных вступать в азотфиксирующий симбиоз с растением-хозяином. Знание этих механизмов необходимо для проведения научно обоснованной селекции высокоэффективных бобово-ризобиальных систем. Для понимания эволюции специфичности растительно-микробных взаимоотношений особое значение имеют симбиотические системы с участием реликтовых бобовых растений, представляющих собой промежуточное звено между исчезнувшими и современными видами. К таким уникальным объектам относится плейстоценовый реликт — копеечник щетинистый Hedysarum gmelinii Ledeb. subsp. setigerum (Turcz. ex Fischer et Mey.) Kurbatsky, произрастающий в Прибайкальском регионе. В представленной работы получена первая в мире коллекция микросимбионтов копеечника щетинистого. Изучение таксономического положения 19 полученных изолятов проводили с помощью RFLP-анализа ITS региона (ITS-RFLP) и секвенирования гена 16S рРНК (rrs). Филогенетический анализ микросимбионтов копеечника щетинистого показал их значительное генетическое разнообразие. Четырнадцать ризобиальных изолятов принадлежали к трем родам: Rhizobium (сем. Rhizobiaceae), Phyllobacterium (сем. Phyllobacteriaceae) и Bosea (сем. Bradyrhizobiaceae). В клубеньках копеечника щетинистого присутствовали несимбиотические ризобиальные виды, представители которых самостоятельно не формируют симбиоз с бобовыми растениями (Phyllobacterium endophyticum, Phyllobacterium loti и Bosea sp.). Кроме того, были выделены 5 изолятов, не являющихся клубеньковыми бактериями и относящихся к родам Acinetobacter, Stenotrophomonas, Sphingomonas и Agromyces. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что реликтовые бобово-ризо-биальные симбиозы, формируемые, в частности, копеечником щетинистым, представляют собой прообраз современных симбиотических систем и отражают пути эволюции в направлении рекрутирования симбиотических генов разных микроорганизмов и повышения специфичности растительно-микробных взаимоотношений. Штаммы несимбиотических ризобиальных видов, возможно, присутствуют в клубеньках как носители генов, не участвующих непосредственно в формировании симбиоза, но влияющих на его активность. Такие штаммы после соответствующего генетического и фенотипического изучения могут быть использованы для производства биопрепаратов с повышенной эффективностью симбиотической азотфиксации.
Ключевые слова: бобовые растения Прибайкалья, копеечник щетинистый Hedysarum gmelinii subsp. setigerum, систематика ризобий, секвенирование генов рибосомальных РНК.
Ризобии — обширная, генетически разнородная группа грамотри-цательных микроорганизмов, обитающих в почве, способных вступать во внутриклеточный симбиоз с бобовыми растениями и осуществлять фиксацию атмосферного азота, образуя на корнях растений-хозяев клубеньки, из-за которых эти микроорганизмы известны также как клубеньковые бактерии. Изучение механизмов (в том числе молекулярных), обеспечивающих взаимодействие бобовых растений с ризобиями, считается одной из актуальных задач современной микробиологии и биотехнологии и необходимо для проведения научно обоснованной селекции высокоэффективных растительно-микробных систем (1). Для понимания эволюции специфических растительно-микробных взаимодействий особое значение имеют сим-биотические системы с участием реликтовых бобовых растений, представляющих собой промежуточное звено между исчезнувшими и современными видами. К таким уникальным объектам относится копеечник щетини-
* Работа выполнена в рамках Программы ФАНО России по развитию и инвентаризации биоресурсных коллекций научными организациями (№ ИСГЗ 0664-2016-0018). Секвенирование гена ITS региона микросимбионтов выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 16-16-00080).
стый Hedysarum gmelinii Ledeb. subsp. setigerum (Turcz. ex Fischer et Mey.) Kurbatsky, произрастающий в Байкальском регионе (2). Ботанико-гео-графический анализ показал принадлежность этого вида к плейстоценовым петрофитно-степным реликтам южносибирского происхождения (3, 4).
В литературе имеются данные о том, что из клубеньков копеечника колючейшего (Hedysarum spinosissimum subsp. capitatum) и некоторых других видов этого рода (H. pallidum, H. carnosum), произрастающих в Средиземноморском регионе, выделяются бактерии, принадлежащие к классу Gammaproteobacteria, — Pantoea agglomerans, Enterobacter kobei, Enterobacter cloacae, Leclercia adecarboxylata, Escherichia vulneris и Pseudomonas sp. (5). Копеечник венечный H. coronarium нодулируется штаммами Rhizobium sul-lae (6). По данным китайских исследователей (7), из клубеньков видов копеечника H. scoparium и H. polybotrys, произрастающих на северо-западе Китая, выделяются представители рода Rhizobium. В 2011 году было показано, что растения копеечника альпийского H. alpinum нодулируется представителями рода Mesorhizobium (8).
Микросимбионты копеечника щетинистого ранее никогда не выделялись. В настоящей работы мы создали и описали первую в мире коллекцию ризобиальных микросимбионтов этого реликтового бобового растения, произрастающего в Прибайкальском регионе.
Цель нашей работы состояла в выделении микросимбионтов Hedysarum gmelinii subsp. setigerum и определении таксономического положения штаммов с помощью ITS-RFLP метода и секвенирования последовательностей 16S рДНК.
Методика. Объектом исследования были 19 штаммов, изолированных с помощью традиционной методики (9) из корневых клубеньков копеечника щетинистого, произрастающего на мысе Зундук (материковое побережье байкальского пролива Малое море, координаты 53.383333, 107.41666753°23'00" с.ш. 107°25'00" в.д.). Микроорганизмы выращивали на модифицированном маннитно-дрожжевом агаре YMSA с добавлением 0,5 % янтарной кислоты (10) при 28 °С. Все изоляты депонированы в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) и размещены на Станции низкотемпературного автоматизированного хранения биологических образцов (Liconic Instruments, Лихтенштейн) (11). Информация о штаммах доступна в Интернет-базе данных ВКСМ (12).
При первичной оценке внутривидового разнообразия штаммов проводили RFLP (restriction fragment length polymorphism) анализ последовательности между генами 16S и 23S рРНК (ITS-RFLP метод). Для этого амплифицированный фрагмент ДНК обрабатывали рестриктазой MspI («Promega», США) и разделяли рестрицированные ДНК-фрагменты электрофорезом в стандартном режиме (13). Для определения видовой принадлежности штаммов использовали нуклеотидную последовательность гена 16S рРНК (rrs).
Для амплификации ITS региона (800 п.н.) использовали прайме-ры FGPS1490-72 (5'-TGCGGCTGGATCCCCTCCTT-3') и FGPL-132 (5'-CCGGGTTTCCCCATTCGG-3'), для амплификации 16S рДНК (около 1500 п.н.) - праймеры fD1 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и rD1 (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'). Полученный ПЦР-продукт выделяли из геля и очищали (14) для последующего RFLP-анализа или секвенирования на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500xl («Applied Biosystems», США). Поиск гомологичных последовательностей выполняли с помощью базы данных NCBI GenBank и программы BLAST (15). Для конструирова-
ния филогенетического дерева применяли программу MEGA5 и метод Neighbor-Joining (16). Пары последовательностей сравнивали по числу различающихся нуклеотидов. Для оценки уровней поддержки кластеров был проведен бутстреп-анализ на основе 1000 повторов. Полученные последовательности депонированы в базе данных GenBank под номерами KY290459-KY290467, KY290469, KY290470 и KY290472-KY290474.
Результаты. Изоляты, относящиеся к клубеньковым бактериям, представлены в таблицах 1 и 2.
1. Гомология (%) гена 16S рРНК у быстрорастущих изолятов, выделенных из клубеньков копеечника щетинистого Hedysarum gmelinii subsp. setigerum в Прибайкальском регионе, и у типовых штаммов родов Phyllobacterium и Rhi-zobium
Типовой штамм Изолят
Rhizobium sp. Ph. loti Ph. endophyticum Phyllobacterium sp.
Hse-26 Hse-9 |Hse-19 |Hse-30 Hse-10 | Hse-24 Hse-13 | Hse-14 | Hse-17 | Hse-20 |Hse-29
1 95,7 98,3 98,3 98,2 97,4 97,1 99,9 96,9 98,6 98,3 98,7
2 94,5 99,6 99,6 99,5 97,9 97,7 99,6 97,4 98,9 99,7 98,9
3 94,9 99,1 99,1 99,0 97,1 96,8 99,9 96,6 98,1 99,2 98,1
4 94,6 98,6 98,6 98,6 96,6 97,1 99,2 96,1 97,7 98,6 97,7
5 94,3 98,6 98,1 98,6 99,9 99,6 99,4 99,3 98,8 98,6 98,9
6 95,1 98,5 98,6 98,4 98,5 98,2 99,6 98,0 99,3 98,6 99,3
7 95,1 99,8 99,8 99,8 98,5 98,3 99,6 98,0 99,0 99,8 99,1
8 98,9 94,4 94,4 94,3 93,5 93,3 95,0 93,1 94,8 94,4 94,8
9 96,4 93,5 93,5 93,5 92,5 92,3 93,4 92,2 93,8 93,6 93,8
Примечание. 1 — Ph. myrsinacearum STM 948T, 2 — Ph. trifolii PETP02T, 3 — Ph. ifriqiyense 4 — Ph. catacumbae CSC19T, 5 — Ph. endophyticum PEPV15T, 6 — Ph. brassicacearum STM 196T S658T, 8 — Rh. giardinii NBRC 107135, 9 — Rh. alamii GBV016T.
STM 370T, 7 — Ph. loti
2. Гомология (%) гена16S рРНК у медленнорастущих изолятов, выделенных из клубеньков копеечника щетинистого Hedysarum цщяИпИ subsp. setigerum в Прибайкальском регионе, и у типовых штаммов рода Bosea
Типовой штамм Изолят Bosea sp.
Hse-21 | Hse-22 | Hse-32
B. vaviloviae Vaf-18T 98,5 98,0 98,5
B. massiliensis 63287T 98,4 97,5 98,4
B. eneae 34614T 98,6 97,7 98,6
B. vestrisii 34635T 98,6 97,7 98,6
По скорости роста все исследованные изоляты разделились на две группы: у трех штаммов видимые колонии образовывались на среде YMSA на 4-5-е сут, у остальных — на 3-и сут. Поскольку каждый изолят генерировал уникальный ITS-RFLP профиль (данные не приведены), все исследуемые штаммы стали объектом идентификации с помощью секвенирова-ния гена rrs.
Анализ последовательности, показал, что 11 быстрорастущих штаммов принадлежат к родам Phyllobacterium и Rhizobium и формируют 3 статистически достоверно различающиеся кластера с уровнем поддержки 100 % (рис. 1). Первый кластер включал штаммы Hse-14, Hse-24 и Hse-10, а также типовой штамм Ph. endophyticum PEPV15T. Штаммы Hse-24 и Hse-10 были идентифицированы как Ph. endophyticum, показаd высокую гомологию гена rrs с таковым у типового штамма PEPV15T (соответственно 99,6 и 99,9 %). Штамм Hse-14 был описан как Phyllobacterium sp. (табл. 1). Второй кластер объединил штаммы Hse-29, Hse-17, Hse-20, Hse-30, Hse-19, Hse-9, Hse-13 и типовые штаммы Ph. sophorae CCBAU03422T, Ph. bour-gognense STM201T, Ph. brassicacearum STM 196T, Ph. loti S658T, Ph. trifolii PETP02T, Ph. catacumbae CSC19T, Ph. myrsinacearum STM 948T и Ph. ifriqiyense STM 370T (рис. 1). Штамм Hse-20 идентифицировали как Phyllobacterium sp., поскольку по гену rrs он был наиболее близок к двум видам
61
92 100
31
100
39
59
-Hse-14 (KY290462)
-Hse-24 (KY290469)
— Hse-10 (KY290460) Phyllobacterium endophyticum PEPV15T (NR109517)
LPh. sophorae CCBAU 03422T (KJ685937) Ph. bourgognense STM 201T (NR043191) Ph. brassicacearum STM 196T (NR043190) Hse-29 (KY290472) lise-17 (KY290463) Ph, loti S658T (NR133818) Ph. trifolii PCTP02T (NR043193.1 Hsc-20 (KY290465) Hse-30 (KY290473) Hse-19 (KY290464) Hse-9 (KY290459) Ph. myrsinacearum STM 948T (AY785315) —Ph. catacumbae CSC19T (NR043055) - - Hse-13 (KY29046!)
Ph. ifriqiyense STM 370T (XR043192) 100 | Hse-26 (KY290470)
I-Rhizobium giardinii NBRC 107135T (AB682469)
Rh. alamii GBV016T (AM931436) rRh. leguminosarum USDA2370T (U29386) Rh. etli CPN 42 (U28916)
rRh. loessense CCIÎAU 7190BT (AP364069) Rh. mongolense USDA1844T (U89817) Rh. gallicum R602spT (U86343)
64 67
100
94
77
99 60
521 M. yanglingense SH22623T (AP003375)
0,01
Рис. 1. rrs-Филограмма быстрорастущих штаммов, выделенных из клубеньков копеечника щетинистого Hedysarum gmelinii subsp. setigerum в Прибайкальском регионе, а также представителей родственных видов Phyllobacterium и Rhizobium. Полученные изоляты обозначены как Hse, типовые штаммы отмечены литерой «Т».
(степень гомологии с типовыми штаммами Ph. trifolii PETP02T и Ph. loti S658T составляла соответственно 99,7 % и 99,8 %). Степень сходства гена rrs у штаммов Hse-9, Hse-19 и Hse-30 и типового штамма Ph. loti S658T достигала 99,8 %. На этом основании перечисленные штаммы были описаны как Ph. loti (см. табл. 1). Наиболее близким к изолятам Phyllobacterium sp. Hse-17 и Hse-29 оказался типовой штамм Ph. brassicacearum STM 196T (99,3 % гомологии по гену rrs). Изолят Hse-13 показал 99,9 % сходства с двумя типовыми штаммами Ph. myrsinacearum STM 948T и Ph. ifriqiyense STM 370T, поэтому был идентифицирован только до рода — Phyllobacterium sp. (см. табл. 1). Третий кластер сформировали штамм Hse-26 и типовой штамм Rhizobium giardinii NBRC 107135. На основании результатов секвенирования гена rrs (см. табл. 1) изолят Hse-26 был идентифицирован как Rhizobium sp. (степень сходства с типовым штаммом Rhizobium giardinii NBRC 107135 — 98,9 %).
На рисунке 2 представлена rrs-филограмма, отражающая таксономическое положение трех медленнорастущих ризобиальных изолятов в пределах семейства Bradyrhizobiaceae. По гену rrs штаммы Hse-21 и Hse-32
Рис. 2. rrs-Филограмма медленнорастущих штаммов, выделенных из клубеньков копеечника щетинистого Hedysarum gmelinii subsp. setigerum в Прибайкальском регионе, а также представителей родственных видов Bosea. Полученные изоляты обозначены как Hse, типовые штаммы отмечены литерой «Т».
показали 98,5 % гомологии с типовым штаммом Bosea vaviloviae Vaf-18T и 98,6 % — с типовыми штаммами B. eneae 34614T и B. vestrisii 34635T (см. табл. 2). Сходство по гену rrs у изолята Hse-22 и наиболее близкого типового штамма B. vaviloviae Vaf-18T составляло 98,0 % (см. табл. 2). На этом основании штаммы Hse-21, Hse-22 и Hse-32 были идентифицированы как Bosea sp. Следует отметить, что вид B. vaviloviae описан совсем недавно (в 2015 году) для трех штаммов-микросимбионтов реликтового бобового растения Vavilovia formosa, произрастающего в Северной Осетии (10). Кроме того, из клубеньков других видов копеечника, произрастающих в Средиземноморье, северо-западных районах Китая и средней полосе России, микроорганизмы родов Bosea и Phyllobacterium не выделялись (5-8).
Способность каких-либо представителей рода Bosea формировать азотфиксирующий симбиоз ранее не подтверждалась, хотя штаммы четырех видов (B. lupini, B. lathyri, B. robiniae и B. vaviloviae) были изолированы из клубеньков бобовых растений соответственно родов Lupinus, Lathyrus, Robinia и Vavilovia (10, 17). Однако по крайней мере два вида рода Phyllobacterium (Ph. sophorae и Ph. trifolii) описаны как эффективные микросимбионты рас-
тений Sophorae flavescens (18), Trifolium repens и Lupinus albus (19). Поэтому байкальские изоляты, принадлежащие роду Bosea и имеющие высокую степень сходства с видом B. vaviloviae, а также бактерии рода Phyllobacte-rium представляют большой интерес для дальнейшего изучения.
Анализ последовательностей гена rrs у пяти неризобиальных изоля-тов, выделенных из клубеньков копеечника щетинистого, показал их принадлежность к родам Acinetobacter, Stenotrophomonas, Sphingomonas и Agro-myces (данные не приведены). Бактерии рода Stenotrophomonas были изолированы и из других бобовых растений Байкальского региона (2G). По данным литературы, представители этих родов могут присутствовать в клубеньках бобовых, а также быть обитателями ризосферы и филлосферы различных видов растений (21-25).
Таким образом, в настоящей работе мы впервые получили коллекцию штаммов, изолированных из реликтового бобового растения копеечника щетинистого Hedysarum gmelinii Ledeb. subsp. setigerum, произрастающего в Байкальском регионе. В результате нашего исследования было показано, что среди микросимбионтов этого растения встречаются штаммы симбиотических видов клубеньковых бактерий (Rhizobium sp.), а также нетипичные виды, представители которых не формируют симбиоз (Phyllobac-terium endophyticum, Ph. loti и Bosea sp.). Штаммы несимбиотических ри-зобиальных видов, возможно, присутствуют в клубеньках как носители генов, не участвующих непосредственно в формировании симбиоза, но влияющих на его эффективность. Дальнейшее фенотипическое и генетическое исследование выделенных микроорганизмов может внести существенный вклад в понимание путей эволюции и становления растительно-микробных взаимодействий в бобово-ризобиальной системе.
Авторы благодарят A.B. Верхозину (СИФИБР СО РАН) за помощь в организации экспедиции в Прибайкальский регион.
ЛИТЕРАТУРА
1. Тихонович И.А., Борисов А.Ю., Цыганов В.Е. Интеграция генетических систем растений и микроорганизмов при симбиозе. Успехи современной биологии, 2005, 125(3): 227-238.
2. Электронный каталог сосудистых растений Азиатской России. Режим доступа: http://www-sbras.nsc.ru/win/elbib/atlas/flora/27i.html. Без даты.
3. Мулдашев А.А., Галеева А.Х., Маслова Н.В., Елизарьева О.А. О природоохранном статусе копеечника Гмелина Hedysarum gmelinii Ledeb. (Fabaceae) в Республике Башкортостан. Вестник Оренбургского государственного университета, 2009, 6: 254-257.
4. Куликов П.В. Конспект флоры Челябинской области (сосудистые растения). Екатеринбург, 2005.
5. Benhizia Y., Benhizia H., Benguedouar A., Muresu R., Giacomini A., Squartini A. Gamma proteobacteria can nodulate legumes of the genus Hedysarum. Systematic and Applied Microbiology, 2004, 27(4): 462-468 (doi: 10.1078/0723202041438527).
6. Squartini A., Struffi P., Doring H., S e l e ns k a - P o b e 11 S., Tola E., Giacomini A., Vendramin E., Velazquez E., Mateos P.F., Mart í nez-Molina E., Dazzo F.B., Casella S., Nuti M.P. Rhizobium sullae sp. nov. (formerly Rhizobium hedysari), the root-nodule microsymbiont of Hedysarum coronarium L. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2002, 52: 1267-1276 (doi: 10.1099/00207713-52-4-1267).
7. Wei G.H, Zhang Z.X., Chen C., Chen W.M., Ju W.T. Phenotypic and genetic diversity of rhizobia isolated from nodules of the legume genera Astragalus, Lespedeza and Hedysarum in northwestern China. Microbiological Research, 2008, 163(6): 651-662 (doi: 10.1016/j.micres.2006.09.005).
8. Сафронова В.И., Чижевская Е.П., Б ел им о в А.А., Павлова Е.А. Определение таксономического положения штаммов-микросимбионтов копеечника (Hedysarum) и астрагала (Astragalus) путем анализа генов рибосомальных РНК. Сельскохозяйственная биология, 2011, 3: 61-64.
9. Novikova N., Safronova V. Transconjugants of Agrobacterium radiobacter harbouring sym genes of Rhizobium galegae can form an effective symbiosis with Medicago sativa. FEMS Microbiology Letters, 1992, 93: 261-268 (doi: 10.1016/0378-1097(92)90472-Z).
10. Safronova V.I., Kuznetsova I.G., Sazanova A.L., Kimeklis A.K., Beli-mov A.A., Andronov E.E., Pinaev A.G., Chizhevskaya E.P., Pukhaev A.R., Popov K.P., Willems A., Tikhonovich I.A. Bosea vaviloviae sp. nov., a new species of slow-growing rhizobia isolated from nodules of the relict species Vavilovia formosa (Stev.) Fed. Antonie van Leeuwenhoek, 2015, 107: 911-920 (doi: 10.1007/s10482-015-0383-9).
11. Safronova V., Tikhonovich I. Automated cryobank of microorganisms: Unique possibilities for long-term authorized depositing of commercial microbial strains. In: Microbes in applied research: current advances and challenges /A. Mendez-Vilas (ed.). World Scientific Publishing Co, Hackensack, 2012.
12. Электронная база данных Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ). Режим доступа: http://www.arriam.spb.ru. Без даты.
13. Румянцева М.Л., Симаров Б.В., О нищ у к О.П. Биологическое разнообразие клубеньковых бактерий в экосистемах и агроценозах. Теоретические основы и методы. СПб, 2011.
14. St ^ pkowski T., Z ak M., Moulin L., K^liczak J., Goli n ska B., Naro z-na D., Safronova V.I., M4drzak C.J. Bradyrhizobium canariense and Bradyrhizobium japonicum are the two dominant rhizobium species in root nodules of lupin and serradella plants growing in Europe. Systematic and Applied Microbiology, 2011, 34: 368-375 (doi: 10.1016/j.syapm.2011.03.002).
15. GenBank sequence database. The National Center for Biotechnology Information. Режим доступа: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Без даты.
16. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using Maximum Likelihood, evolutionary distance, and Maximum Parismony methods. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28: 27312739 (doi: 10.1093/molbev/msr121).
17. De Meyer S.E., Willems A. Multilocus sequence analysis of Bosea species and description of Bosea lupini sp. nov., Bosea lathyri sp. nov. and Bosea robiniae sp. nov., isolated from legumes. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2012, 62: 2505-2510 (doi: 10.1099/ijs.0.035477-0).
18. Jiao Y.S., Yan H., Ji Z.J., Liu Y.H., Sui X.H., Zhang X.X., Wang E.T., Chen W.X., Chen W.F. Phyllobacterium sophorae sp. nov., a symbiotic bacterium isolated from root nodules of Sophora flavescens. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2015, 65: 399-406 (doi: 10.1099/ijs.0.067017-0).
19. Valverde A., Vel a zquez E., Fern a ndez - Santos F., Vizca i no N., Rivas R., Mateos P.F., Mart i nez-Molina E., Igual J.M., Willems A. Phyllobacterium trifolii sp. nov., nodulating Trifolium and Lupinus in Spanish soils. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2005, 55: 1985-1989 (doi: 10.1099/ijs.0.63551-0).
20. Кузнецова И.Г., Сазанова А.Л., Сафронова В.И., Тихомирова Н.Ю., Оследкин Ю.С., Б е л и м о в А.А. Изучение генетического разнообразия микросимбионтов байкальских видов чины (Lathyrus), горошка (Vicia), остролодочника (Oxytropis) и астрагала (Astragalus). Сельскохозяйственная биология, 2015, 50: 345-352 (doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.345rus).
21. Cardoso J.D., Hungria M., Andrade D.S. Polyphasic approach for the characterization of rhizobial symbionts effective in fixing N2 with common bean (Phaseolus vulgaris L.). Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 93: 2035-2049 (doi: 10.1093/femsec/fix027).
22. Fterich A., Mahdhi M., Caviedes M.A., Pajuelo E., Rivas R., Rod rig -uez-Llorente I.D., Mars M. Characterization of root-nodulating bacteria associated to Prosopis farcta growing in the arid regions of Tunisia. Archives of Microbiology, 2011, 193(6): 385-397 ' (doi: 10.1007/s00203-011-0683-z).
23. Ezzakkioui F., El Mourabit N., Chahboune R., C a s t e 11 a no - H i no -josa A., Bedmar E.J., Barrijal S. Phenotypic and genetic characterization of rhizobia isolated from Hedysarum flexuosum in Northwest region of Morocco. Systematic and Applied Microbiology, 2014, 37(6): 457-465 (doi: 10.1016/j.syapm.2014.05.009).
24. Xu L., Zhang Y., Wang L., Chen W., Wei G. Diversity of endophytic bacteria associated with nodules of two indigenous legumes at different altitudes of the Qilian Mountains in China. Journal of Basic Microbiology, 2015, 55(7): 830-837 (doi: 10.1002/jobm.201400790).
25. Corretto E., Antonielli L., Sessitsch A., Compant S., Gorfer M., Kuffne r M., B rade r G. Agromyces aureus sp. nov., isolated from the rhizosphere of Salix caprea L. grown in a heavy-metal-contaminated soil. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2016, 66(9): 3749-3754 (doi: 10.1099/ijsem.0.001260).
ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной Поступила в редакцию
микробиологии, 11 марта 2017 года
196608 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3, e-mail: v.safronova@rambler.ru
Sel'skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2017, V. 52, № 5, pp. 1004-1011
STUDY OF THE GENETIC DIVERSITY OF MICROSYMBIONTS ISOLATED FROM Hedysarum gmelinii subsp. setigerum, GROWING IN THE BAIKAL LAKE
REGION
A.L. Sazanova, I. G. Kuznetsova, V.I. Safronova, A.A. Belimov, Zh.P. Popova, N.Yu. Tikhomirova, Yu.S. Osledkin
All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology, Federal Agency of Scientific Organizations, 3, sh. Pod-
bel'skogo, St. Petersburg, 196608 Russia, e-mail v.safronova@rambler.ru (corresponding author)
ORCID:
Sazanova A.L. orcid.org/0000-0003-0379-6975 Safronova V.I. orcid.org/0000-0003-4510-1772
Kuznetsova I.G. orcid.org/0000-0003-0260-7677 Belimov A.A. orcid.org/0000-0002-9936-8678
The authors declare no conflict of interests Acknowledgements:
We thank A.V. Verkhozina (SIPPB SB RAS) for organizing the expedition to the Baikal Lake region. Supported by the Federal Agency of Scientific Organizations (Program for the development and inventory of biore-source collections, № ISGZ 0664-2016-0018). ITS-sequencing of the isolates was supported by the Russian Science Foundation (grant 16-16-00080).
Received March 11, 2017 doi: 10.15389/agrobiology.2017.5.1004eng
Abstract
One of the urgent problems of modern microbiology and biotechnology is the study of the mechanisms of interaction between leguminous plants and root nodule bacteria (rhizobia), which are an extensive group of microorganisms capable to form nitrogen-fixing symbiosis with a host plant. Knowledge of these mechanisms is necessary for carrying out scientifically based selection of highly effective rhizobia-legume symbiotic systems. To understand the evolution of the specificity of plant-microbe interactions, symbiotic systems with the participation of relic leguminous plants, which are an intermediate link between the extinct and modern species, are of particular importance. One of these unique objects is the pleistocene relic Hedysarum gmelinii Ledeb. subsp. setigerum (Turcz. ex Fischer et Mey.) Kurbatsky. The aim of this study was to isolate and identify the world's first collection of microsymbionts of this plant species growing in the Lake Baikal region. The study of taxo-nomic positions of 19 isolates from root nodules of H. gmelini subsp. setigerum plants was conducted by the methods of ITS-RFLP and 16S rRNA gene (rrs) sequencing. Phylogenetic analysis revealed the considerable genetic diversity among microsymbionts of the plant species studied. Fourteen rhi-zobial isolates belonged to 3 genera: Rhizobium (family Rhizobiaceae), Phyllobacterium (family Phyllo-bacteriaceae) and Bosea (family Bradyrhizobiaceae). It was noted the presence in the root nodules of non-symbiotic rhizobial species that are not able to form symbiosis with leguminous plants (Phyllobacterium endophyticum, Ph. loti and Bosea sp.). In addition, five non-rhizobial isolates belonging to the genera Acinetobacter, Stenotrophomonas, Sphingomonas и Agromyces were obtained. The obtained data may indicate that the relic rhizobia-legume symbioses, formed in particular by the H. gmelini subsp. setigerum plants, are prototypes of modern symbiotic systems and reflect the evolutionary pathways in the direction of recruiting symbiotic genes of different microorganisms and increasing the specificity of plant-microbe interactions. It is possible that strains of non-symbiotic rhizobial species are present in nodules as a source of genes that do not participate directly in the formation of symbiosis, but affect its activity. Such strains, after appropriate genetic and phenotypic study, can be used for the production of biopreparations with increased efficacy.
Keywords: leguminous plants of the Baikal region, Hedysarum gmelinii subsp. setigerum, ri-bosomal RNA genes sequences, Rhizobiaceae taxonomy.
Научные собрания 5th NANO TODAY CONFERENCE (6-10 December, 2017, Hawaii, USA)
Topics: synthesis and self-assembly of nanocrystals, nanoparticles and thin films; functionalization and size-dependent properties of nanocrystals, quantum dots and nanowires; processing and templat-ing of nanotubes and nanoporous materials; tailoring of polymeric nanoparticles, organic-inorganic nanocomposites and biohybrids; nanosystems for biological and medical applications; nanosystems for sensing, diagnostic, imaging, magnetic, electronic and structural applications; nanomaterials for energy and environmental applications.
Information: https://www.elsevier.com/events/conferences/nano-today-conference
