CC BY
8УДК 619:636.09:633.88
Исаева А.Ю., Староверов С. А., Волков А. А., Ларионов С. В., Козлов С. В.
(Саратовский ГАУ, Саратовский НИВИ РАСХН, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов)
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НАНО РАЗМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ НА ОСНОВЕ КОЛЛОИДНОГО СЕЛЕНА IN VITRO
Ключевые слова:коллоидный селен, лактоферрин, иммунитет, наночастица, иммуностимулятор.
В последнее время большое внимание уделяется использованию в ветеринарной медицине биологически активных веществ природного происхождения, обладающих антимикробным и иммунопротективным действием. Данные соединения позволяют снизить количество применяемых хемоте-рапевтических средств и, тем самым, повысить качество получаемой сельскохозяйственной продукции [1-3].
Одним из таких веществ является лактоферрин - белок сыворотки молока млекопитающих, железосвязывающий, многодоменный, полифункциональный глико-протеид. Наибольший спектр биологической активности обнаружен у пептидных фрагментов лактоферрина, получаемых при его протеолизе [4]. По литературным данным продукты протеолиза лактофер-рина обладают целым рядом биоактивных свойств, обнаруженных in vitro. Так, они являются фактором опсонизации и усиления завершенности фагоцитоза, обладают антимикробной, антивирусной, противогрибковой и противогельминтной активностью, тормозят адгезию бактерий на клетках макроорганизма [5-7]. Все перечисленные выше свойства делают лакто-ферин интересным объектом для изучения и использования в фармакологии. Однако, многие вопросы, касающиеся лактофери-на и его использования, до сих пор остаются недостаточно изученными.
Так же особый интерес представляет микроэлемент селен. В организме нет такого органа или системы где не использовался бы селен. Этот микронутриент участвует в обмене белков и нуклеиновых кислот, входит в состав ферментов и гормонов, участвует в реакциях иммунитета, воспаления и регенерации. Селеносодер-жащие белки формируют костную и хрящевую ткани, поддерживают работу скелетных и гладких мышц, контролируют гормональный баланс. Все перечисленные выше свойства делают селен интересным объектом для изучения и использования в
фармакологии. Вместе с этим многие вопросы, касающиеся влияния коллоидного селена на иммунную систему до сих пор остаются недостаточно изученными. Коллоидные частицы имеют некоторое преимущество перед другими наночастицами, благодаря своему мелкому размеру (от 5 до 100 нм), большой свободной поверхности, низкой токсичности, клеточной пене-трабельности и возможности поверхностной модификации.
В связи с этим мы поставили целью в начале нашей работы изучить некоторые биодинамические параметры комплекса коллоидного селена конъюгированного с лактоферрином in vitro.
Материалы и методы исследований. Коллоидный селен синтезировался нами по методу Bo Huang et al (2003). Использованные в работе культуры клеток почек эмбрионов свиньи (SPEV), получены из криобанка коллекции клеточных культур лаборатории вирусологии научно-исследовательской ветеринарного института Российской академии сельскохозяйственных наук (РАСХН) (Саратов). Культивирование клеточных культур проводили в пластиковых флаконах в полной RPMI среде (10% эмбриональной сыворотки, гента-мицин, ампициллин, амфотерицин) при 37° С. Диссоциация клеток монослойной культуры достигалась промыванием монослоя раствором трипсина в течение 10 мин.
Выделение и культивирование перито-неальных макрофагов и клеток селезенки проводилось по стандартным методикам (Пастер Е.У, Овод В.В., Позур В.К., Вихоть Н.Е. 1989). Пролиферативную активность клеток селезенки проверяли по методу предложенному Кузаковой Н. А. (2002) и Berridge V M. (1996).
Проведение МТТ теста: МТТ-тест проводили по следующей методике: чистую культуру клеток и клетки с добавлением препаратов инкубировали по 500 мкл в пробирках эппендорф при 370С в течение 48 часов. Каждую пробирку с клеточны-
Рис. 1. Изменение дыхательной активности в клеточной популяции при культивировании их в присутствии препарата коллоидного селена (Р<=0,05)
0,0008
1—I
? 0,0007
ГО
№ ГО
I 0,0006 -
0
-е-
§ г 0,0005 ¡4
§ | 0,0004
1 I-
ГО 01
й 5 0,0003
ш о;
I 0,0002
О. II
3- 0,0001
МагБсОЗ клетки ФГА Ьо ЬР
Рис. 2. Трансформирующая активность клеток селезенки крыс в присутствие конъюгатов коллоидного селена.
Рис. 3. Изменение дыхательной активности перитонеальных клеток крыс в присутствие конъюгатов коллоидного селена.
ми суспензиями по окончании инкубирования центрифугировали 10 мин при 1000 g. Перерастворяли полученный осадок в 500 мкл раствора МТТ и инкубировали в течение часа. После инкубации клетки перерастворяли в 500 мкл ДМСО, отбирали по 200 мкл суспензии из каждой пробирки и помещали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета. Показания оптической плотности считывали на планшетном ридере Multiscan Ascent Thermo (Scientific) (Bernas T., Dobrucki J.W 2000).
При изучении взаимодействия коллоидного селена с перитениальными и лим-фойдными клетками к 1 мл клеточной суспензии с количеством клеток 1*108- 109 вносится 0,5 конъюгат селена с лактофер-рином с концентрацией белка 1мг на мл перерастворенный в полной RPMI среде. В работе использовали следующие контро-ли это клетки с селинитом натрия, клетки культивируемые с ФГА и чистые клетки (клетки без внесённых препаратов). Ставится на ночь в термостат 370С. На следующий день клетки собираются центрифугированием отмываются и проводится измерение МТТ-теста.
При изучении влияния коллоидного селена на окислительно-восстановительные процессы клеток препарат вносился в мо-нослойную культуру клеток в концентрации 1 мг на 10 мл среды. Культивирование проводили в течение 48 часов после чего клетки снимались трипсинизацией и у них определялась интенсивность дыхания в МТТ тесте.
При изучении влияния препарата на дыхательную активность клеток в качестве контроля использовались 100 мкл клеточных суспензий в 1 мл питательной среды. В качестве опыта использовались 100 мкл клеточных суспензий с препаратом (7.5 мкг/мл) в 1 мл питательной среды с антигеном. Итоговая концентрация клеток составила 2x107 клеток в 1 мл. Клетки культивировались в присутствие препара-
та в течение 24 - 72 часов (в зависимости от задачи) при 370С.
Результаты и обсуждение. Исследование биологической активности комплекса коллоидного селена конъюгированного с лактоферрином проводились на клеточной линии SPEV-2.
Культивирование клеток в присутствие нашей нанокомпозиции, приводит к повышению их дыхательной активности в 4 раза (рис 1). Что может говорить о способности препарата активировать окислительные процессы клеточного метаболизма.
Отметив стимуляцию клеточного дыхания у клеток линии SPEV-2, мы в дальнейшем провели исследования по изучению влияния коллоидного селена на стимуляцию пролиферативной активности лимфоидных клеток.
Проведя данные исследования, мы отметили, что коллоидный селен, вызывал повышение пролиферативной активности клеток на 91%, селенит натрия на 9%, а фитогемагглютинин на 26% по сравнению с контролем (рисунок 2).
Отметив дыхательную активность клеток селезенки, мы провели изучение влияния нашего препарата на дыхательную активность фагоцитирующих клеток в частности перитонеальных клеток крыс. На рисунке 3 можно отметить, что дыхательная активность перитонеальных клеток возрастает в присутствие нашего препарата в 10 раз, что может указывать на способность селена активировать клеточную активность.
Заключение: анализируя полученные данные, хочется отметить, что данный комплекс обладает ярко выраженными иммуномодулирующими свойствами, что в дальнейшем позволит создать препараты, обладающие высокой биологической активностью и низкой токсичностью, и даст возможность провести конструирование иммуномодулирующих и вакцинных препаратов.
Резюме: В работе изучается влияние композиции на основе коллоидного селена коньюгирован-ного с полипептидными комплексами для повышения стимулирующего влияния клеточного и гуморального иммунитета, путем непосредственной презентации активных компонентов препаратов в клетки ретикулоэндотелиальной системы.
SUMMARY
The work is devoted to the study of composition on the basis of colloidal selenium with lactoferrin which stimulates the immunity.
Keywords:colloidal selenium, lactoferrin, immunity, nano-part, immunostimulant.
Литература
1. Miedzobrodzki J., NaiduA. S.,Watts J.I., Ciborowski P, Palm K., Wadsröm T. Effect of milk on fibronectin and collagen type I binding to Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci isolated from bovine mastitis // J. Clin. Microbiol. 1989. V 27. P. 540-544.
2. Miyauchi H., Kaino A., Shinoda I., Fukuwatari Y., Hayasawa H. Immunomodulatory effect of bovine lactoferrin pepsin hydrolysate on murine splenocytes and Peyer's patch cells // J. Dairy Sci. 1997. V 80. P 23302339.
3. Holmgren J., Svennerholm A.M., Ahren C. Nonimmunoglobulin fraction of human milk inhibits bacterial adhesion (hemagglutination) and enterotoxin binding of Escherichia coli and Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1981. V 33. P. 136-141.
4. Dionysius D.A., Milne J.M. Antibacterial peptides
of bovine lactoferrin: purification and characterization // J. Dairy. Sci. 1997. V 80. P. 667-674.
5. Dionysius D.A., Grieve PA., Milne J.M. Forms of lactoferrin: their antibacterial effect on enterotoxigenic Escherichia coli // J. Dairy Sci. 1993. V 76. P. 2597-2606.
6. Naidu A.S. Lactoferrin: Natural, Multifunctional, Antimicrobial. - Boca Raton, FL: CRC Press, 2000. 86 p.
7. Zimecki M., Mazurier J., Machnicki M., Wieczorek Z., Montreuil J., Spik G. Immunostimulatory activity of lactotransferrin and maturation of CD4- CD8- murine thymocytes // Immunol. Lett. 1991. V 30. P. 119-124.
8. Гринь В.А., Родионова Т.Н., Строгов В.В. Фар-макокорекция селеновой недостаточности у телят на откорме. - Краснодар. - Ветеринария Кубани, № 6, 2011. - с. 25-26.
Контактная информации об авторах для переписки Исаева Анна Юрьевна соискатель кафедры «Терапия, акушерство и фармакология» ФГБОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова
Староверов Сергей Александрович доктор биологических наук начальник отдела биохимии и иммунологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт РАСХН г. Саратов, профессор кафедры «Терапия, акушерство и фармакология» ФГБОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова
Волков Алексей Анатольевич доктор ветеринарных наук, заведующий кафедрой «Терапия, акушерство и фармакология» ФГБОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова
Ларионов Сергей Васильевич доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой «Паразитологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы», член -корреспондент Российской Академии сельскохозяйственных наук, заслуженный ветеринарный врач РФ
Козлов Сергей Васильевич кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Терапия, акушерство и фармакология» ФГБОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова
УДК 619:636.09:633.88
Исаева А.Ю., Староверов С. А., Волков А. А., Ларионов С. В., Козлов С. В.
(Саратовский ГАУ, Саратовский НИВИ РАСХН, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов)
КОНСТРУИРОВАНИЕ НАНО РАЗМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ НА ОСНОВЕ КОЛЛОИДНОГО СЕЛЕНА
Ключевые слова: коллоидный селен, наночастица, наноноситель, наноплатформа.
Одной из важнейших проблем в фармацевтической отрасли остается адресная доставка лекарственных веществ предназначенная для повышения эффективности лечения. Как известно, традиционные лекарственные формы содержат одно или несколько индивидуальных лекарствен-
ных веществ в формах, пригодных для эн-терального или парентерального введения. Применяемые подходы к введению лекарств в организм человека и животных, основанные на использовании общепринятых лекарственных форм, имеют целый ряд существенных недостатков:
