CC BY
138
УДК 68.35.33: 31.27.21
Н. В. Демина, А. А. Кочетов, Я. А. Шевченко, И. Н. Сметанская, А. В. Канарский, З. А. Канарская
ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ЭКСТРАКТОВ ИЗ ЛИСТЬЕВ
РАЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВ СТЕВИИ, ВЫРАЩЕННЫХ В СВЕТОКУЛЬТУРЕ
Ключевые слова: генотипы стевии, светокультура, экстракты, антиоксидантная активность.
Исследовано влияния генотипов стевии и температуры экстракции на антиоксидантную активность экстрактов из листьев стевии. Установлено эффективная температура экстракции из листьев стевии водно-метанольной смесью антиоксидантов 80 - 90 °С. Показана высокая антиоксидантная активность экстрактов из листьев стевии различных генотипов, выращенных при длинном дне в светокультуре.
Keywords: genotypes of Stevia svetokultury, extracts, antioxidant activity.
Investigated the influence of genotype and temperature stevia extract-ing on the antioxidant activity of extracts from the leaves of stevia. INSTALLATIONS effective temperature extraction from leaves of Stevia aqueous methanolic mixture of antioxidants 80 - 90 ° C. The high antioxidant activity of the extracts of stevia leaves of different genotypes grown under long-day conditions in light culture.
В условиях современного мира человеческий организм постоянно подвергается действию свободных радикалов, находящихся в потребляемой пище и окружающей его техногенной среде, что приводит к развитию окислительного стресса, провоцирующего развитие многих серьезных заболеваний, таких как онкологические заболевания, атеросклероз, диабет, преждевременное старение. Негативное влияние свободных радикалов можно существенно уменьшить при использовании в питании продуктов растительного происхождения, содержащих вещества с антиоксидантной активностью (полифенолы, витамины, каротиноиды, флавоноиды и др.), которые ингибируют или задерживают окисление других молекул.
В последнее время интерес к натуральным ан-тиоксидантам существенно возрос. Значительное количество их присутствует в зеленом чае, кофе, гранате, винограде, цитрусовых, черноплодной рябине и других фрукта и ягодах [1, 2, 3]. К этой группе растений относят и стевию - двулистник сладкий ^вуга геЬаыЛапа Бе^оп!).
Стевия - новая культура семейства сложноцветных, многолетний травянистый полукустарник из Парагвая, в листьях которой содержатся сладкие диетические дитерпеновые гликозиды (стевиозид, ребаудиозиды А и В и др.), близкие по вкусовым качествам к сахарозе и превосходящие ее по сладости в 300 и более раз [4, 5]. Естественную способность этого растения накапливать большие количества сладких диетических сахарозаменителей делает его интересным для пищевой биотехнологии, особенно для приготовления различных напитков и диетических продуктов [6, 7, 8]. Сегодня стевия широко культивируется в Южной Америке и странах Юго-Восточной Азии. В ряде стран - Японии, Китае, Вьетнаме, Таиланде до 50 % сахара, используемого в пищевой промышленности, заменяется на подсластители из стевии.
Для России замена сахара на подсластители из стевии весьма актуальна, так как значительная часть населения болеет сахарным диабетом (более 2 миллионов человек) или имеет нарушения обмена
веществ, связанные с чрезмерным употреблением углеводов. Культивирование стевии в России возможно лишь при сохранении маточных растений в зимнее время в закрытом грунте при последующем массовом размножении и выращивании полученной рассады в открытом грунте. Такая технология круглогодичного выращивания стевии с использованием регулируемых условий разработана и апробирована для Северо-Западного региона России [9]. Она может быть адаптирована для массового культивирования стевии на территории России, что обеспечит сырьем отечественную пищевую промышленность.
Листья стевии можно использовать непосредственно или извлекать из них сладкие вещества [10]. Экстракты стевии обладают комплексом лечебных свойств и являются безопасными для человека при длительном употреблении [11, 12] Выявлено гипог-ликемическое, гипотензивное и иммуномодули-рующее действие экстрактов из листьев стевии. Кроме того, эти экстракты могут оказывать проти-вопаразитарное и противомикробное действие, положительно влияют на органы пищеварения и сердечно-сосудистую систему [13, 14, 15]. Многие полезные свойства экстрактов стевии связаны с наличием в них антиоксидантных соединений [16, 17]. Результаты, представленные в работе [18], показывают, что стевия имеет значительный потенциал для использования в качестве натурального антиокси-данта. В стевии обнаружена хлоргеновая кислота, обладающая гипогликемическим действием и высокой антиоксидантной активностью [19]. Установлено, что антиоксидантная активность экстрактов сте-вии увеличивается при смешивании с кофе и соком лайма. В этой связи полная очистка экстрактов из листьев стевии для получения чистых гликозидов как сахарозаменителей, т.е. подсластителей, не является целесообразной [20, 21, 22].
Цель настоящей работы - изучение антиок-сидантной активности водно - метанольных экстрактов из листьев различных генотипов стевии, выращенных в светокультуре.
Материалы и методы
В опытах использовали 10 образцов стевии, выращенных из семян различного происхождения. Они отличались генотипически, что проявлялось в различиях по морфологическим признакам (табл. 1) и реакции на длину дня. Растения каждого генотипа выращивали в светокультуре под лампами ДНАТ -400 при облученности 40 - 60 Вт/м2 ФАР при фотопериодах 12, 14, 16 часов в сутки (повторность 5 - 6 растений для каждого варианта опыта). Для анализа брали среднюю пробу сухих листьев с 5 - 6 растений в трехкратной повторности.
Таблица 1 - Характеристика образцов стевии, выращенных в открытом грунте
№ образца Происхождение образца (выращен из семян фирмы) Морфологические особенности образца
1 «Richters», Канада Куст невысокий, с 2-5 побегами. Лист средней величины ромбовидный, край листа пильчатый.
2 «Richters», Канада Куст высокий, с 2 - 7 побегами. Лист крупный, ромбовидный, край листа пильчатый.
3 «Грин Бэлт», Россия Куст средней высоты, с 2 - 4 побегами, хорошо облиствленный. Лист мелкий, ланцетный, зубцы края листа острые.
4 «Richters», Канада Растение невысокое, хорошо кустящееся (3-4 побега). Лист мелкий, ланцетный и ромбический, зубцы края листа острые.
5 «Richters», Канада Куст высокий, среднекус-тистый. Лист крупный, ромбовидный, зубцы края листа острые.
6 «Richters», Канада Растение высокое с 2 - 6 побегами. Лист средний ромбовидный, край листа пильчатый.
7 «Richters», Канада Куст средней высоты с 1 -3 побегами. Лист средней величины, ромбовидный с пильчатым краем.
8 «Richters», Канада Растение невысокое, хорошо кустится (3 - 6 побегов). Лист крупный, ромбовидный, зубцы листа острые
9 «Richters», Канада Куст средней высоты с 1 -3 побегами. Лист средний, ромбовидный, зубцы листа округлые
10 «Richters», Канада Куст средней высоты с 1 -3 побегами. Лист крупный, ромбовидный, зубцы листа заостренные
Получение экстракта из листьев стевии Предварительно измельченные до порошкообразного состояния листья стевии взвешивали и засыпали в пробирки объемом 2 мл. Затем в эти пробирки вносили 1,5 мл 70 % метанола и помещали их в водяной термостат - экстрактор 8ШаШ: 8БИ 130Б. Экстракцию проводили в течение 5 минут при температурах 60, 70, 80, 90 и 100 °С. Для разделение экстракта и шрота стевии смесь центрифугировали в течение 10 мин. при 10000 об/мин. Фугат сливали, к осадку добавляли 700 мкл 70 % метанола и экстракцию повторяли в течение 5 минут при тех же температурах. Повторное разделение экстракта и шрота стевии проводили также центрифугированием в течение 10 мин., при 10000 об/мин. Затем фугат после двух экстракций смешивали в пробирке объемом 2 мл.
Определение антиоксидантной активности экстракта листьев стевии Приготовление реакционной смеси - БРРИ (2,2 - дифенил - 1 - пикрилгидразила) К 50 мкл экстракта добавляли 2 мл реакционной смеси состоящей из БРРИ (2,2 - Б1рИепу1 - 1 -рюгуШу^ату1) и метанола, путем смешивания 6 мл маточного раствора с 100 мл метанола до получения значения абсорбции 0,7 ± 0,02 при 515 нм с помощью спектрофотометрии. Затем смесь перемешивали, выдерживали в течение 30 минут и проводили измерения оптической плотности, при длине волны 515 нм. Антиоксидантную активность (АА) образцов определяли по формуле:
Е - Е
АА контр. о.
^ обр.
Е,,
* 100,
контр.
где АА - антиоксидантная активность образцов (%); Е контр. - оптическая плотность контроля - реакционной смеси БРРИ (2,2 - Б1рИепу1 - 1-рюгуШу^ату1) и метанола; Е ор - оптическая плотность экстрактов образцов с добавкой реакционной смеси.
Калибровочный график строили по галловой кислоте. Фотометрический анализ образцов проводили с использованием фотометра Jenway 6200.
Результаты и обсуждение
Изученные в опытах генотипы стевии различались, как морфологически, так и по реакции на длину дня (рис. 1).
При 12 - часовом фотопериоде растения всех генотипов быстро переходили к цветению и накапливали небольшую надземную массу. При 14 - часовом фотопериоде часть растений раньше других переходила к цветению (образцы № 3, 4, 7), другие же не зацветали до конца опыта. При 16 - часовом фотопериоде наблюдали интенсивный вегетативный рост без перехода к цветению у всех изучаемых образцов, отмечая максимальное накопление надземной массы у растений генотипов № 1, 2, 3.
Рис. 1 - Продуктивность исследуемых образцов стевии при разной длине дня (характеристика образцов в табл. 1)
Таким образом, 14 - часовой фотопериод является дифференцирующим для различных генотипов по чувствительности к длине дня.
Различия между генотипами по морфологическим признакам часто сохранялись на всех фотопериодах. Стабильно высокий коэффициент кущения (3 - 4 стебля на растении) имели образцы (№ 3, 5, 7). Растения других генотипов характеризовались более крупным листом (№ 1, 2, 4, 8). При 12 - часовом фотопериоде средняя длина листа у этих растений этих вариантов составила 82 - 89 мм, а ширина - 41 - 44 мм, достигая показателей 95 - 99 и 44 - 51 мм при 16 - часовом фотопериоде соответственно.
Основной задачей данного исследования было изучение антиоксидантной активности вытяжек из листьев различных генотипов стевии. В ходе опытов проведена работа по определению оптимальных условий экстракции веществ с АА из сухих листьев стевии. Эти вещества экстрагировали водно - мета-нольной смесью при разных температурах от 60 до 100 °С.
Температура экстракции существенно повлияла на антиоксидантную активность вытяжек из листьев растений всех изучаемых образцов (рис. 2).
Наибольшую АА имели экстракты, полученные при 80 и 90°С, наименьшую - при 60 и 100оС. Такая тенденция наблюдалась у всех образцов стевии. Результаты исследований позволяют предположить, что при 60°С экстракция веществ с АА проходит не полностью, при 70 - 90°С постепенно возрастает. Уменьшение АА при 100°С может быть связано с разложением части экстрагированных веществ.
Результаты эксперимента позволяют сделать вывод, что наиболее эффективной температурой для экстракции веществ с АА у стевии является температура 80 - 90°С.
В опыте также обнаружены достоверные различия по АА между исследуемыми образцами (рис. 3).
Рис. 2 - Средняя антиоксидантная активность водной вытяжки из листьев 10 образцов стевии при различной температуре экстракции
Рис. 3 - Антиоксидантная активность разных образцов стевии при разных температурах экстракции
На гистограмме приведены средняя АА по всем температурам экстракции и АА при наиболее эффективной температуре экстракции (90°С) для каждого образца стевии. Как видно из гистограммы, при 90°С величины АА экстрактов различных генотипов стевии сопоставимы. Это позволяет легко выделить образцы с низкой величиной АА вытяжки (генотипы № 5 и 9). Образцы стевии, экстракты которых имеют высокие значения АА, более четко определяются при сравнении средних показателей АА (генотипы растений № 3, 4, 6). Сопоставляя продуктивность различных образцов и их АА можно отметить, что для образца № 3 характерно как значительное накопление надземной массы при 16 -часовом фотопериоде, так и высокая АА. Перспективно дальнейшее использование этого генотипа в селекционной работе.
Для сравнения отметим, что растения стевии изученных генотипов, выращенные в светокультуре при длинном дне, по антиоксидантному потенциалу не уступают растениям, выращенным в Парагвае, Таиланде и Испании, антиоксидантная активность которых достигает 57 % [23]. Это позволяет надеяться на то, что растения стевии данных генотипов можно будет использовать не только как источник натуральных диетических сахарозаменителей, но и как источник веществ с высокой АА.
Выводы
1. Эффективной температурой экстракции ан-тиоксидантов из листьев стевии водно-метанольной смесью является 80 - 90 °С.
2. Наблюдаются существенные различия по продуктивности и антиоксидантной активности у разных генотипов стевии, выращенных из семян различного происхождения. Выделены генотипы, накапливающие наибольшую надземную массу при длинном дне (16 - часовой фотопериод), среди которых один образец (3) имеет и высокую АА.
3. Показана высокая антиоксидантная активность экстрактов листьев стевии изученных генотипов, выращенных при длинном дне в светокультуре, сопоставимая с АА образцов стевии из Парагвая, Таиланда и Испании.
Литература
1. Шарафутдинова, Е.Н. Качество пищевых продуктов и антиоксидантная активность [Текст] / Е.Н. Шарафутдинова, А.В. Иванова, А.И. Матерн, Х.З. Брайнина // Аналитика и контроль. 2011. Т. 15. № 3. С. 281 - 286.
2. Яшин, Я.И. Природные антиоксиданты. Содержание в пищевых продуктах и влияние их на здоровье и старение человека [Текст] / Я. И. Яшин, В. Ю. Рыжнев, А. Я. Яшин, Н. И. Черноусова // ТрансЛит. 2009. 212 с.
3. Velioglu, Y.S. Antioxidant Activity and Total Phenolics in Selected Fruits, Vegetables, and Grain Products [Text] / Y.S. Velioglu, G. Mazza, L. Gao, B.D. Oomah // J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 4113 - 4117.
4. Das, S. Evaluation of the cariogenic potential of the intense natural sweeteners stevioside and rebaudioside A [Text] / S. Das, A.K. Das, R.A. Murphy, I.C. Punwani, M.P. Nasution, A.D. Kinghorn // Caries Research, 1992, 26, 363 - 366.
5. Дзюба, О.О. Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley - новый для России источник натурального сахарозаменителя [Текст] / О.О. Дзюба // Растительные ресурсы. 1998. Т. 34. Вып. 2. С. 86 - 95.
6. Kinghorn, A.D. In Alternative Sweeteners, 3rd ed., revised and expanded [Text]/ A.D. Kinghorn, C. D. Wu, D. D. Soe-jarto // L. O'Brien Nabors (Ed.), pp. 167 - 184. Marcel Dekker, New York, 2001.
7. Brandle, J.E. Steviol glycoside biosynthesis phytochemistry [Text] / J.E. Brandle, P.G. Telmer // 2007, 68, pp. 1855 -1863.
8. Лисицин, В.Н. Новые технологии производства диабетических и диетических продуктов на основе продукции переработки растения стевии [Текст] / В.Н. Лисицин, Е.Л. Воловик // Пища, вкус и аромат. № 4. 1999. С.8 - 9.
9. Кочетов, А.А. Перспективы выращивания стевии [Stevia rebaudiana Bertoni (L.)] в Нечерноземной зоне России [Текст] / А. А. Кочетов // Аграрная Россия. 2012. № 2. С. 2 - 4.
10. Midmore, D. J. A new rural industry stevia to replace imported chemical sweeteners [Text] / D.J. Midmore, A.H. Rank // RIRDC Pub No. W 02/22. 2002. p. 55.
11. Gardana, C. Metabolism of stevioside and rebaudioside A from Stevia rebaudiana extracts by human microflora [Text]
/ C. Gardana, P. Simonetti, E. Canzi, R. Zanchi, P. Pietta // J Agric Food Chem. 2003. Oct. 22; 51(22): 6618 - 22.
12. Koyama, E. Absorption and metabolism of glycosidic sweeteners of stevia mixture and their aglycone, steviol, in rats and humans [Text] / E. Koyama, N. Sakai, Y. Ohori, K. Kitazawa, O. Izawa, K. Kakegawa, A. Fujino, M. Ui // Food Chem Toxicol. 2003 Jun; 41(6): 875 - 83.
13. Geuns, J. M.C. Molecules of Interest Stevioside [Text] / J. M.C. Geuns // Phytochemistry 2003, 64, pp. 913 - 921.
14. Jeppesen, P.B. Stevioside acts directly on pancreatic cells to secrete insulin: actions independent of cyclic adenosine monophosphate and adenosine triphosphate-sensitive K+ channel activity [Text] / P.B. Jeppesen, S. Gregersen, C.R. Poulsen, K. Hermansen // Metabolism. 2000. 49. pp. 208 -214.
15. Chan, P. A double blind placebo-controlled study of the effectiveness and tolerability of oral stevioside in human hypertension [Text] / P. Chan, B. Tomlinson, Y. Chen, J. Liu, M. Hsieh, J. Cheng, // British Journal of Clinical Pharmacology. 2000. 50. pp. 215 - 220.
16. Tadhani, M.B. In vitro antioxidant activity of Stevia rebaudiana leaves and callus [Text] / M.B. Tadhani, V.H. Pa-tel // J Food Comp. Anal. 2007. 20 (3 - 4): 323 - 3213.
17. Ghanta, S. Oxidative DNA damage preventative activity and antioxidant potential of Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni, a natural sweetener [Text] / S. Ghanta, A. Banerjee, A. Poddar, S. Chattopadhyay // J Agric Food Chem. 2007. 5 (26): 10962 - 10967.
18. Shruti Shukla, Archana Mehta, Vivek K. Bajpai and Savita Shukla In vitro antioxidant activity and total phenolic content of ethanolic leaf extract of Stevia rebaudiana Bert. Food and chemical toxicology an international journal published for the British Industrial Biological Research Association (2009) Volume: 47, Issue: 9, Pages: 2338 - 2343.
19. Зимин, М.В. Использование биоморфологической характеристики сортообразцов стевии в селекционной работе [Текст] / М.В. Зимин, Т.П. Жужжалова // Селекция и семеноводство полевых культур: Юбилейный сборник трудов. Ч. 1. Воронеж: ФГОУ ВПО ВГАУ. 2007. С. 69 -73.
20. Ramakrishnan Kaushik, Narayanan Pradeep, Vasudevan Vamshi, Muthukumaran Geetha, Antony Usha (2010) J Food Sci Technol (January-February 2010) 47(1):27 - 33) Nutrient composition of cultivated stevia leaves and the influence of polyphenols and plant pigments on sensory and antioxidant properties of leaf extracts.
21. Канарская, З.А., Демина Н.В. Тенденции в производстве сахарозаменителей [Текст] // Вестник Казанского технол. ун. Т.15. № 9. 2012. с. 145 - 154.
22. Хусаинов И.А., Канарский А.В., Канарская З.А. Влияние конформации олигосахаров на их пребиотические свойства [Текст] // Вестник Казанского технол. ун. Т. 16. № 6 (1). 2013. с. 131 - 137.
23. Buran Phansawan, Supak Poungbangpho (2007) Antioxi-dant Capacities of Pueraria mirifica, Stevia rebaudiana Ber-toni, Curcuma longa Linn., Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees. and Cassia alata Linn. for the Development of Dietary Supplement Kasetsart J. (Nat. Sci.) 41: 548 - 554.
© Н. В. Демина - асп. каф. пищевой инженерии малых предприятий КНИТУ, raxona@rambler.ru; А. А. Кочетов - зав. лаб. экофизиологии растений, Агрофизический НИИ РАСХН, kochetoval@yandex.ru; Я. А. Шевченко - University of Alliped Schiences Weihenstephan Triesdorf, Agricultural Faculty, Triesdorf, yaroslav_shevchenko@yahoo.com; И. Н. Сметанская - University of Alliped Schiences Weihenstephan Triesdorf, Agricultural Faculty, Triesdorf, iryna.smetanska@hswt.de; А. В. Канарский -проф. каф. пищевой биотехнологии alb46@mail.ru; З. А. Канарская - доц. каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, zosya_kanarskaya@mail.ru.
