CC BY
89
8. Spoerl, E. Techniques for stiffening the cornea // E. Spoerl, T. Seiler // J. of Refractive Surgery. - 1999. -Vol. 15, № 6. - P. 711-713.
9. Spoerl, E. Increased resistance of crosslinked cornea agaist enzymatic difestion / E. Spoerl, G. Wollensak, T. Seiler // Curr. Eye Res. -2004. - Vol. 29. - P. 35-40.
10. Safety of UVA-riboflavin cross-linking of the cornea / E. Spoerl [et al.] // Cornea. - 2007. - Vol. 26. - P. 385-9.
11. Spoerl, E. Boiphysicalische Grundlagen der Kollagenvernetzung / E. Spoerl, F. Raiscup-Wolf, L.E. Pilunat // Klin. Monatsbl. Augen-heilkd. - 2008. - Vol. 225. - P. 131-137.
12. Wollensak, G. Riboflavin/ultraviolet-a-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus / G.Wollensak, E. Spoerl, T. Seiler // Am. J. Ophthalmol. - 2003. -Vol. 135. - P. 620-7.
УДК 579.22;579.262
© Н.Б. Перунова, В.Г. Туйгунова, Е.В. Иванова, Ю.З. Габидуллин, 2013
Н.Б. Перунова1, В.Г. Туйгунова2, Е.В. Иванова1, Ю.З. Габидуллин2 ИЗМЕНЕНИЕ БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИЯ И АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ CITROBACTER FREUNDII ПОД ДЕЙСТВИЕМ МЕТАБОЛИТОВ
КИШЕЧНОЙ МИКРОБИОТЫ
1 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г. Оренбург 2ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет»
Минздрава России, г. Уфа
Экспериментально выявлено два типа направленности биокоммуникативой активности в ассоциации бактерий с Citrobacter spp. - синергидный и антагонистический. Ассоциативная микробиота, характерная для дисбиоза, инициировала биопленкообразование (БПО) и антилизоцимную активность (АЛА) C. freundii, и, напротив, доминанты (бифидобактерии) и лактозопозитивные негемолитические эшерихии, изолированные при эубиозе, ингибировали базовые физиологические функции адаптации Citrobacter spp.
Метаболиты C. freundii, предварительно соинкубированные с культурами бифидобактерий, индуцировали у доминан-тов усиление антагонистической активности, подавляя АЛА и БПО цитробактеров. Полученные данные свидетельствуют о «распознавании» доминантами C. freundii в качестве «чужеродного» микроорганизма, что может являться одним из механизмов защитного действия нормофлоры при эубиозе.
Ключевые слова: биокоммуникация, персистенция, Citrobacter, микробиота кишечника, микробное распознавание.
N.B. Perunova, V.G. Tuygunova, E.V. Ivanova, Y.Z. Gabidullin CHANGES IN BIOFILM FORMATION AND ANTILIZOZYME ACTIVITY OFCITROBACTER FREUNDII UNDER THE INFLUENCE OF THE HUNAN GUT MICROBIOTA METABOLITES
The experiments have revealed two types of orientation of biocommunication activity in association of bacteria with Citrobacter spp. - synergistic and antagonistic ones. Associative microbiota typical for dysbiosis, stimulated biofilm formation (BFF) and anti-lysozyme activity (ALA) C. freundii, and, on the contrary, the dominant (bifidobacteria) and lac-positive non-hemolytic Escherichia, isolated at eubiosis, inhibited the basic physiological functions of the adaptation of Citrobacter spp.
Metabolites C. freundii being pre-coincubated with cultures of Bifidobacteria induced antagonistic activity in dominant gain by inhibiting the ALA and BFF of Citrobacter. The findings suggest that dominants "recognize" C. freundii as a "foreign" microorganism, which may be one of the mechanisms of the protective effect of normal flora in eubiosis.
Key words: biocommunication, persistence, Citrobacter, microbiota of the bowel, microbiota recognition.
В настоящее время имеются работы, биотопов макроорганизма формируют специ-
указывающие на рост инфекций, обусловлен- фический микросимбиоценоз, являющийся
ных оппортунистическими микроорганизма- одним из векторов ассоциативного симбиоза
ми семейства Enterobacteriaceae, представи- человека [3]. Исходя из данной концепции,
телями которых являются бактерии рода патогенный потенциал бактерий рода
Citrobacter. Цитробактеры часто являются Citrobacter, при формировании симбиотиче-
этиологической причиной гнойно- ских взаимосвязей с микробиотой также под-
воспалительных и токсико-септических про- вержен изменениям, что может отражаться на
цессов, инфекций мочеполового тракта, ост- гомеостазе организма человека. В ряде работ
рых кишечных, респираторных и внутриболь- отмечены различия экспрессии вирулентных
ничных инфекций. При этом выделенные и некоторых персистентных (АЛА и АИА)
штаммы, как правило, проявляют в опреде- свойств Citrobacter spp., изолированных при
ленной степени факторы патогенности и моно- и ассоциированой инфекциях [4, 5].
мультирезистентности к широко применяе- Однако отсутствуют данные об измене-
мым антибактериальным препаратам [1, 2]. нии персистентных свойств (антилизоцимная
С позиции инфекционной симбиологии активность и биопленкообразование) бакте-
популяции микроорганизмов, вступая в слож- рий рода Citrobacter в ассоциации с другими
ные взаимоотношения - конкурентные или видами бактерий, представителями домикооперативные - при заселении различных нантной и ассоциативной микробиоты, что и
предопределило тематическую направленность исследований.
Цель исследования - изучение персистентных свойств бактерий рода Citrobacter при влиянии метаболитов ассоциативной и доминантной микробиоты человека.
Материал и методы
Эксперименты по изучению регуляции биопленкообразования (БПО) и антилизоцим-ной активности (АЛА) Citrobacter freundii в ассоциации с бактериями проводили на клинических штаммах микроорганизмов, изолированных от пациентов при обследовании на дисбиоз кишечника. Исследование микросим-биоценоза кишечника осуществлялось в соответствии с методическими рекомендациями «Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника» [6]. Оценка состояния микробиоты дистального отдела толстого кишечника (дисбиоз/эубиоз) по степеням проводилась в соответствии с приказом МЗ РФ № 231 [7]. Выделение и идентификация анаэробных микроорганизмов проводились в соответствии с руководством [8]. Идентификация выделенных штаммов факультативно-анаэробных микроорганизмов проводилась общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных и культуральных свойств. Биохимический профиль изучаемых культур факультативноанаэробных бактерий определяли с помощью коммерческих тест-систем фирмы «Lachema» (Чехия).
В качестве доминантной микрофлоры были использованы культуры Bifidobacterium spp. (B. longum, B. bifidum), а в качестве ассо-циантов - микроорганизмы родов Escherichia, Proteus, Staphylococcus. В работе были использованы 6 культур C. freundii, в том числе эталонный штамм Cf^u^a ГИСК № 255.
Исследование биологических свойств микроорганизмов в условиях межмикробных взаимодействий проводили при добавлении стерильных супернатантов (продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, метаболитов), микроорганизмов-симбионтов в питательный бульон по алгоритму, описанному в ряде работ [9, 10]. Распознавание «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» микросимбионтов определяли по методике [11].
Биопленкообразование определяли по методу [12], антилизоцимную активность -фотометрическим методом по Бухарину О.В. с соавт. [13].
Статистическая обработка результатов исследования включала применение общепринятых методов вариационной статистики с использованием программы Excel и SPSS Sta-tistics.Дaнные по определению регулирующего влияния экзометаболитов микроорганиз-мов-симбионтов на биологические свойства бактерий рода Citrobacter были статистически обработаны непараметрическим методом с применением критерия Манна-Уитни. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р<0,05.
Результаты и обсуждение
Анализ полученных результатов позволил установить наличие синергидных связей в ассоциации C. freundii с P. vulgaris, S. aureus и гемолитическими (hly +) E. coli. (рис. 1 А).
Под действием метаболитов данных ас-социантов отмечалась стимуляция биоплен-кообразования C. freundii в 47,2 - б9,4 % случаев. При влиянии супернатантов P. vulgaris значения БПO цитробактера увеличивались с 3,8 ± 0,3 до 4,3 ± 0,3 ед., под действием метаболитов S. aureus - до 5,1 ± 0,5 ед. и при воздействии E. colihly - до 4,9 ± 0,4 ед. (p<0,05). Oтсyтствие изменений биопленкообразования (индифферентный эффект) наблюдалось в 19,5 - 27,8 % случаев. Ингибирование БПO было характерно для 11,1 - 27,8 % штаммов C. freundii. Биопленкообразование исследуемых штаммов цитробактеров снижалось с 3,8 ± 0,3 до 2,9 ± 0,3 ед., 3,1 ± 0,3 ед. и 2,5 ± 0,2 ед. под действием супернатантов P. vulgaris, S. Aureus и гемолитических E. Coli соответственно.
Противоположный антагонистический эффект был характерен при влиянии метаболитов представителей нормофлоры на био-пленкообразование C. freundii. Ингибирование БГО отмечалось у б9,4 ± 9 % штаммов Citrobacter spp. при действии супернатантов лaктoзoпoзитивныхE. coli и у 80,5 ± 7,7% культур - под влиянием B. longum. Экспрессия БГО снижалась с 3,8 ± 0,3 до 2,б ± 0,3 ед. и 1,8 ± 0,2 ед. соответственно при действии супернатантов эшерихий и бифидобактерий. Стимуляцию биопленкообразования C. freun-dii под действием лактозопозитивных E. coli и
B. longum выявляли не более чем в 13,9 ± б,8 % случаев (с 3,8 ± 0,3 до 2,4 ± 0,2 ед.), а индифферентный эффект не превышал 1б,7 ± 7,3 % случаев.
Аналогичная направленность биоком-муникативной активности микросимбионтов была выявлена при исследовании изменения антилизоцимной активности C. freundii (рис.
1Б).
P. vulgaris S. aureus E. coli гем + E. coli лак + В. longum
P. vulgaris S. aureus E. coli гем + E. coli лак + В. longum
Рис. 1. Распространенность изменений биопленкообразования (А) и антилизоцимной активности (Б) среди штаммов C. freun-dii при соинкубировании с метаболитами ассоциативных и доминантных бактерий: П - снижение экспрессииБПО и АЛА микросимбионтов; Ш - увеличение экспрессии БПО и АЛА микросимбионтов; ^ - индифферентное действие; *- достоверность различий (p<0,05).
Под действием супернатантов P. vulgaris, S. aureusи E. colihly + отмечались стимуляция антилизоцимной активности у 55 - 63,9 % исследуемых штаммов цитробактеров и индифферентный эффект - в 29,6 ± 8,9 % случаев.
Экспрессия АЛА C. freundii составляла 1,2 ± 0,01 мкг/мл*ОП, тогда как после соин-кубирования с метаболитами P. vulgaris, S. aureus и E. colihly + данный показатель увеличился до 1,6 ± 0,01 мкг/мл*ОП, 1,9 ± 0,01 мкг/мл*ОП и 1,4 ± 0,01 мкг/мл*ОП соответственно. Значительно реже (у 8,3 - 22,2 % штаммов) было отмечено снижение антили-зоцимного признака C. freundii 1,2 ± 0,01 мкг/мл*ОП до 0,7 - 0,9 мкг/мл*ОП (p<0,05).
Напротив, представители нормофлоры (бифидобактерии и лактозопозитивные негемолитические эшерихии) в большинстве случаев (50 - 72,2 %) проявляли антагонистический эффект, ингибируя АЛА C. freundii. При этом значения АЛА цитробактера снижались с 1,2 ± 0,01 до 0,6 ± 0,01 мкг/мл*ОП (p<0,05). Доминантные бактерии (B. longum) и эшери-хии увеличивали АЛА у 33,3 ± 9,2 % штаммов
C. freundii (c 1,2 ± 0,01 до 1,5 ± 0,01 мкг/мл*ОП). Отсутствие изменения АЛА было выявлено в 16,7 - 27,8 % случаев.
Таким образом, полученные данные позволили установить, что в ассоциации Citrobacter spp. с бактериями формируются по два основных типа взаимодействий, завися
щие от вида микросимбионтов. Синергидные связи формировались с представителями ассоциативной микробиоты (P. vulgaris, S. au-гєши гемолитические E. coli), как правило, присутствующие наряду с C. freundii при дисбиозе кишечника. Представители нормо-флоры, напротив, подавляли БПO и АЛА цит-робактеров, что можно рассматривать как защитную функцию бифидобактерий и эшери-хий, осуществляющих контроль численности и физиологической активности условнопатогенных бактерий в условиях ассоциативного симбиоза человека.
Поскольку ранее было установлено, что предварительное соинкубирование бифидобактерий с супернатантами ассоциантов позволяет дифференцировать «свои - чужие» виды микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант» [12], дальнейшие эксперименты были проведены по алгоритму с использованием в качестве модели пары «C. freundii - B. longum».
Предварительное соинкубирование B. longum с супернатантами C. freundii приводило к исчезновению стимулирующего эффекта влияния бифидобактерий как в случае био-пленкообразования цитробактеров, так и в отношении их антилизоцимной активности (рис. 2). Наряду с этим отмечено увеличение распространенности ингибирующего и индифферентного воздействия бифидофлоры на персистентные свойства Citrobacterspp.
III
III
Iі , 2 І Iі , 2 I
БПО С freundii АЛА С. freundii
Рис. 2. Изменение БПO и АЛА штаммов C. freundii при соинку-бировании с метаболитами B. Longum: 1 - изменение БПЭ и АЛА C. freundii после соинкубирования с супернатантом бифидобактерий; 2 - изменение БПЭ и АЛА C. freundii после соин-кубирования с метаболитами бифидобактерий, предсоинкуби-рованных с супернататом цитробактера; d -снижение экспрессии БПO и АЛА микросимбионтов; I - увеличение экспрессии БПO и АЛА микросимбионтов; индифферентное действие.
Предварительное соинкубирование B. longum с метаболитами C. freundii также приводило к снижению экспрессии БПO и АЛА цитробактеров на 18,9 - 3б,4 % от значений контроля (без предварительного соинкубиро-вания), на основании чего они были отнесены к «чужим» видам микросимбионтов.
Выводы
1. Формирование бактериальных
консорциумов с ассоциативной микробиотой сопровождается усилением вирулентного и персистентного потенциалов бактерий рода Citrobacter, способствуя формированию патологического (дисбиотического) микросим-биоценоза.
2. Доминантные микросимбионты-
бифидобактерии - обладают антагонистиче-
кои направленностью воздействия в отношении Citrobacterspp. и способны распознавать данный вид бактерий как чужеродный, снижая персистентный потенциал цитробактеров.
Работа выполнена по проекту фундаментальных исследований программ Президиума РАН № 12-П-4-1045 «Изучение интеграционных механизмов межмикробных взаимодействий микросимбионтов кишечной микробиоты в паре «доминант-ассоциант».
Сведения об авторах статьи:
Перунова Наталья Борисовна - д.м.н., доцент, зав. лабораторией биомониторинга и молекулярно-генетических исследований Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН. Адрес: г. Оренбург, ул. Пионерская, 11. Тел. 8 (3532) 77-59-08. E-mail: perunovanb@gmail.com.
Туйгунова Вера Георгиевна - ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. Тел. 8(347)272-83-88. E-mail: vera_step74@mail.ru.
Иванова Елена Валерьевна - к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории биомониторинга и молекулярногенетических исследований клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН. Адрес: г. Оренбург, ул. Пионерская, 11. Тел. 8 (3532) 77-59-08. E-mail: walerewna13@gmail.com.
Габидуллин Юлай Зайнуллович - ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. Тел. 8(347)272-83-88.
ЛИТЕРАТУРА
1. Валишин, Д.А. Факторы патогенности оппортунистических энтеробактерий и их роль в развитии диареи /Д.А. Валишин, В.М.Бондаренко, А.Р.Мавзютов, Н.Ю.Жеребцова // Журн. микробиол., 2007. - № 1. - С. 87-89.
2. Страчунский Л.С.,Белоусов Ю.Б., Козлов С.Н. Антибактериальная терапия. - М.: Полимаг, 2000. - 190 с.
3. Бухарин О.В.,Лобакова Е.С., Перунова Н.Б. [и др.]. Симбиоз и его роль в инфекции. - Екатеринбург: УрО РАН, 2011. - 301 с.
4. Азнабаев, Г.К. Биологические свойства бактерий рода Citrobacter, выделенных при моно- и ассоциированных бактериальных инфекциях: автореф. дис.... канд. мед. наук. - Оренбург, 2003. - 22 с.
5. Габидуллин, З.Г. Характеристика свойств, определяющих персистенцию моно- и ассоциированных культур условнопатогенных энтеробактерий /З.Г. Габидуллин, М.М.Туйгунов, А.К.Булгаков //Журн. микробиол. - 2006. - № 4. - С. 62-64.
6. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника: методические рекомендации. - М., 1986.
7. Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004-2003 утвержден Приказом Министерства здравоохранения РФ № 231 от 09.06.2003).
8. Jousimies-Somer H.R., Summanen P., Baron E.J. et al. Wadsworth-KTL anaerobic bacteriology manual. 6th ed. Belmont, CA: Star Publishing. - 2002. - 287 p.
9. Елагина, Н.Н. Факторы персистенции неспорообразующей анаэробноймикрофлоры кишечника человека: автореф. дис.... канд. мед. наук. - Оренбург, 2000. - 18 с.
10. Иванова, Е.В. Влияние бифидобактерий на антилизоцимную активность микроорганизмов и их способность к образованию биопленок /Е.В. Иванова, Н.Б.Перунова // Журн. микробиол. - 2009. - № 4. - С. 46-49.
11. Бухарин, О.В. Микробное распознавание "свой-чужой" в условиях кишечного микросимбиоценоза человека /О.В. Бухарин, Н.Б.Перунова // Журн. микробиол. - 2011. - № 6. - С. 46-51.
12. O'Toole G., Kaplan H. B., Kolter R.Biofilm formation as microbial development. Annu.Rev.Microbiol.,2000. - № 54. - P. 49-79.
13. Бухарин, О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 1999. - 365 с.
УДК 615.015.4.:547.854.4
© И.В. Петрова, В.А. Катаев, С.А. Мещерякова, К.В. Николаева, Д.А. Мунасипова, Р.Р. Фархутдинов, 2013
И.В. Петрова, В.А. Катаев, С.А. Мещерякова,
К.В. Николаева, Д.А. Мунасипова, Р.Р. Фархутдинов АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА ПРОИЗВОДНЫХ ПИРИМИДИНА
ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа
Методом регистрации люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) исследовали относительную антиоксидантную активность новых производных пиримидина в трех модельных системах: генерирующей активные формы кислорода, системе, модулирующей реакции перекисного окисления липидов, а также на фагоцитирующих клетках крови. Установлена высокая антиоксидантная активность метилпроизводных пиримидина, содержащих оксигруппу в положении С5. Обнаружено, что некоторые из вновь синтезированных производных пиримидина оказывают стимулирующее влияние на фагоцитоз. Установление закономерности между строением новых производных пиримидина и их антиоксидантными свойствами имеет практическую значимость в плане поиска биологически активных соединений и направленного синтеза.
Ключевые слова: свободнорадикальное окисление, антиоксидантная активность, производные пиримидина, тиетанпи-римидины.
