Изменение активности сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени крыс под воздействием соединений класса 1,3,4-тиадиазина в условиях in vitro

Алисултанова Надежда Жафаровна; Вахнина Надежда Алексеевна; Шадрина Вера Дмитриевна; Бойко Евгений Рафаилович; Сидорова Лариса Петровна; Чупахин Олег Николаевич

ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА

УДК С07D 417/12+577.151.1

ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ КРЫС ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ СОЕДИНЕНИЙ КЛАССА 1,3,4-ТИАДИАЗИНА В УСЛОВИЯХ

IN VITRO

Е.Р. Бойко1, О Н. Чупахин 2,3

1 Институт физиологии Коми научного центра УрО РАН, г. Сыктывкар 2 Уральский Федеральный университет, г. Екатеринбург 3 Институт органического синтеза им. И.Я. Постовского УрО РАН, г. Екатеринбург

Поступила в редакцию 08.12.2014

Статья посвящена изучению влияния производных класса 1,3,4-тиадиазина, таких как L-2, L-4, L-6, синтезированных в Уральском Федеральном университете под руководством академика О.Н. Чупахи-на, на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени крыс в условиях in vitro. Показано, что в отличие от вещества L-6, которое не оказывает значительного воздействия на активность фермента, соединения L-2 и L-4 в разной степени ингибируют сукцинатдегидрогеназу, снижая ее активность в 2 и 4 раза, соответственно, по сравнению с нативными митохондриями (р<0,001). Мы полагаем, что выявленное отличие связано с наличием различных функциональных групп в химической структуре производных класса 1,3,4-тиадиазина.

Ключевые слова: митохондрия, сукцинатдегидрогеназа, тиадиазины

Митохондрии играют центральную роль в клеточном метаболизме, обеспечивая процесс клеточного дыхания, связанного с генерацией АТФ, необходимого для функционирования клетки и организма в целом [14]. Основу мито-хондриального энергетического метаболизма составляют реакции цикла Кребса и дыхательной цепи митохондрий, одним из показателей работы которых является активность сукцинат-дегидрогеназы [8]. Сукцинатдегидрогеназа (СДГ; КФ 1.3.99.1) - это гетеротетрамерный,

Алисултанова Надежда Жафаровна, младший научный сотрудник. Е-mail: alisultanova.nadezhda@mail.ru Вахнина Надежда Алексеевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник. Е-mail: vakhnina80@mail. ru

Шадрина Вера Дмитриевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник. Е-mail:

Vera. shadrina56@mail. ru

Бойко Евгений Рафаилович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий Отделом экологической и медицинской физиологии. Е-mail:

erbojko@physiol.komisc.ru

Сидорова Лариса Петровна, кандидат химических наук, доцент. Е-mail: vlapp@isnet.ru Чупахин Олег Николаевич, академик РАН, научный руководитель института. Е-mail:

chupakhin@ios. uran. ru

ФАД-зависимый ферментный комплекс, встроенный во внутреннюю мембрану митохондрий. СДГ относится к классу оксидоредуктаз и катализирует реакцию окисления сукцината до фу-марата в составе цикла Кребса. В результате этой реакции образуется восстановленный ФАД, электроны от которого через железо-серные центры СДГ переносятся на убихинон электрон-транспортной цепи митохондрий [11]. Таким образом, СДГ участвует как в реакциях цикла Кребса, так и в транспорте электронов в составе сукцинат: убихинон-оксидоредуктазы (комплекса II) митохондриальной дыхательной цепи, поэтому, изменяя ее активность воздействием различных химических агентов, можно регулировать процессы клеточного дыхания и энергетического метаболизма [8].

1,3,4-тиадиазиновый цикл является шести-членным гетероциклическим соединением, содержащим два атома азота и один атом серы [5]. Известны производные класса 1,3,4-тиадиазина, обладающие широким спектром биологической активности, что позволяет их рассматривать в качестве основы для создания фармакологических препаратов. Так, в результате исследований ряда новых производных 1,3,4-тиадиазина,

выявлены вещества, обладающие миорелакси-рующей, антиспазмолитической активностью [10], вещества с гиполиподемическим и гиперг-ликемическим эффектами [6], показана способность некоторых тиадиазинов снижать агрегацию тромбоцитов [9] и действовать на течение системного воспаления при остром инфаркте миокарда [13] и остром панкреатите [12]. Несмотря на широкий спектр фармакологического действия производных класса 1,3,4-тиадиазина, механизм их действия на клеточном уровне остается мало изученным.

Цель исследования: оценка активности СДГ митохондрий печени крыс под воздействием новых производных класса 1,3,4-тиадиазина в условиях in vitro.

Методика исследования. Объектами исследования являлись самцы и самки половозрелых крыс линии Wistar (n=7, m=300±50 г), которых содержали в стандартных условиях вивария с соблюдением основных зоологических требований [3]. Экспериментальных животных наркотизировали и извлекали печень, которую максимально быстро промывали ледяной средой выделения, содержащей 0,25 М сахарозу и 0,001 М ЭДТА-№2, после чего ее измельчали и гомогенизировали на гомогенизаторе Potter S (Sartorius, Germany). Митохондриальную фракцию из го-могената печени выделяли в градиенте сахарозы методом дифференциального центрифугирования (2220-10750 об./мин.) с использованием центрифуги Avanti J-30I (Beckman Coulter Inc., USA) при температуре 0-2°С [2]. Все процедуры по выделению митохондриальной фракции из печени крыс проводили на льду при температуре 0-4°С. Концентрацию белка в полученной суспензии митоходрий определяли биуретовым методом [4]. После выделения суспензию митохондрий подвергали процессу трехкратного замораживания/оттаивания для разрушения мембраны и высвобождения фермента. Новые производные 1,3,4-тиадиазина (L-2, L-4, ТД-6), синтезированные в Уральском Федеральном университете под руководством академика О.Н. Чупахина, растворяли в ДМСО (10 мг/мл). Митохондрии инкубировали с растворами тиадиазиновых соединений в соотношении 1:1 в течение 10-ти минут при комнатной температуре. Активность СДГ митохондрий печени экспериментальных животных до и после инкубации с производными 1,3,4-тиадиазина определяли феррецианидным методом [7]. Данные по активности СДГ митохондрий печени крыс представлены в статье как M±SD. Значимость различий оценивали с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса с последующим использованием метода Данна; различия считали значимыми при р<0,05 [1].

Результаты исследования. Статистический анализ показателей активности СДГ в суспензии митохондрий печени крыс до и после инкубации с растворами производных 1,3,4-тиадиазина не выявил значимых различий между самками и самцами (р>0,05), что позволило объединить их в одну выборку. Активность фермента в суспензии нативных митохондрий составила 11,9±1,1 нм сукцината/мин на мг белка (рис. 1.), что соответствует нормальному значению активности СДГ митохондрий печени крыс [4]. На рис. 1. показано, что производные 1,3,4-тиадиазина, такие как Ь-2 и Ь-4, в разной степени оказали ингибирующее влияние на активность СДГ печени крыс, снизив ее в 2 и 4 раза соответственно, относительно активности СДГ в нативных митохондриях (р<0,001) (рис. 1). Однако после инкубации суспензии митохондрий печени экспериментальных животных с соединением Ь-6 значимых изменений в активности фермента, по сравнению с контрольным значением, не выявлено (р>0,05).

Рис. 1. Активность СДГ в суспензии митохондрий печени крыс до и после инкубации с растворами производных 1,3,4-тиадиазина (различия значимы при р<0,001: а - по сравнению с контролем; Ь - по сравнению с Ь-4)

Результаты, полученные в ходе настоящего исследования, позволяют предположить, что различная ингибирующая активность производных 1,3,4-тиадиазина по отношению к СДГ митохондрий печени крыс связана с химической структурой данных соединений (табл. 1). Из табл. 1. видно, что химические структуры соединений Ь-2 и Ь-4 отличаются друг от друга характером заместителя во 2-м положении тиадиази-нового кольца. Мы предполагаем, что максимальный эффект Ь-4 на активность СДГ митохондрий печени крыс обусловлен наличием остатка морфолина во втором положении тиадиа-зинового кольца. В структуре вещества Ь-6 в 1,3,4-тиадиазиновом кольце в качестве заместителя в положении-2 вместо морфолина находится пипередин (табл. 1), и это соединение уже не является активным по отношению к СДГ и не приводит к ингибированию фермента.

Фундаментальная медицина

Таблица 1. Химическая структура производных 1,3,4-тиадиазина

Соединение Химическая формула и название

L-2 . HBr ^^ NH(CH2)2OH 2-Гидроксиэтиламино-5 -(4'-гидроксифенил)-6Н-1,3,4-тиадиазин, гидробромид

L-4 Т! 1 II ■ HBr Oo 2-морфолино-5 -(4'-гидроксифенил)-6Н-1,3,4-тиадиазин, гидробромид

L-6 HO "П 2-пиперидино-5 -(3 '4'-гидроксифенил)-6Н-1,3,4-тиадиазин, гидрохлорид

Выводы: в ходе скрининга тестируемых веществ выявлены как соединения, не оказывающие влияния на активность СДГ митохондрий печени крыс, так и соединения, в разной степени ингибирующие активность фермента.

Работа выполнена совместно с Уральским Федеральным университетом и с Институтом органического синтеза им. И.Я. Постовского УрО РАН России при поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (проект 12-П-4-1031).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Гланц, С. Медико-биологическая статистика. - М.: Практика, 1998. 459 с.

2. Егорова, М.В. Выделение митохондрий из клеток и тканей животных и человека: современные методические приемы / М.В. Егорова, С.А. Афанасьев // Сибирский медицинский журнал. 2011. Т. 26. № 1. С. 22-28.

3. Западнюк, И.П. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте / И.П. Западнюк, В.И. Западнюк, Е.А. Захария, Б.В. Западнюк. Изд.3-е, перераб. и доп. - Киев.: Вища школа, 1983. 380 с.

4. Камышников, В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. - М.: МЕДпресс-информ, 2004. 920 с.

5. Леонтьева, Е.А. Поиск блокаторов реакции неферментативного гликозилирования белков среди производных 1,3,4-тиадиазина / Е.А. Леонтьева, А.В. Мусальникова // Достижения в химии и химической технологии. 2013. С. 37-40.

6. Применение 2-морфолино-5-фенил-6Н-1,3,4-тиадиазина, гидробромида в качестве средства, обладающего гиполипидемическим и гипергликеми-ческим эффектом: патент Рос. Федерации № 2411936; заявл. от 20.02.2011.

7. Прохорова, М.И. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / учеб. пособие под ред. М.И. Прохоровой. - Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. 272 с.

8. Brooks, P.S. A shortcut to mitochondrial signaling and pathology: A commentary on "Nonenzymatic formation of succinate in mitochondria under oxidative stress" / P.S. Brooks, R.S. Freeman, M.C. Barone // Free Radical Biology and Medicine. 2006. V. 41. Р. 41-45.

9. Campillo, N. Novel bronchodilators: synthesis, transamination reactions, and pharmacology of a series of pyrazino[2,3-c][1,2,6]thiadiazine 2, 2-dioxides / N. Campillo, C. Garcia, P. Goya et al. // J. Med. Chem. 2000. V. 43 (22). P. 4219-4227.

10. Novikova, A.P. Synthesis and properties of functional derivatives of 1,3,4-thiadiazines and condensed sys-

tems based on these compounds / A.P. Novikova, N.M. Perova, O.N. Chupakhin // Chem. Heterocyclic Comp. 1992. V. 11. P. 1443-1457.

11. Rutter, J. Succinate dehydrogenase - assembly, regulation and role in human disease / J. Rutter, D.R. Winge, J.D. Schifman // Mitochondrion. 2010. V. 10. P. 393401.

12. Sarapultsev, A. The correctional modification of inflammatory response at the experimental acute pancreatitis / A. Sarapultsev, O. Chupakhin, M. Rantsev et

al. // Advances in Bioscience and Biotechnology. 2012. V. 3. P. 442-448.

13. Sarapultsev, P. New insights in to the treatment of my-ocardial infarction / P. Sarapultsev, O. Chupakhin, A. Sarapultsev et al. // Int. J. Exp. Pathol. 2012. V. 93 (1). P. 18-23.

14. Singh, S. Ascorbic acid improves mitochondrialfunction in liver of arsenic-treated rat / S. Singh, S. V.S. Rana // Toxicology and Industrial Health. 2010. V. 26(5). P. 265-272.

ALTERATION OF SUCCINATE DEHYDROGENASE ACTIVITY IN RAT LIVER MITOCHONDRIA BY 1,3,4-THIADIAZINE CLASS

COMPOUNDS IN VITRO

O.N. Chupakhin3

1 Institute of Phisiology Komi SC UB RAS, Syktyvkar 2 Ural Federal University, Ekaterinburg 3 Institute of Organic Synthesis named after I.Ya. Postovskiy UB RAS, Ekaterinburg

In present article we report the effects of 1,3,4-thiadiazine class derivatives, such as L-2, L-4, L-6 synthesized in Ural federal University under the leadership of academician O.N. Chupahin on the mitochondrial succinate dehydrogenase of rat liver in vitro. It is shown that unlike L-6 substance which has no significant effect on enzyme activity, L-2 and L-4 compounds inhibit succinate dehydrogenase to varying degrees, reducing its activity in the 2 and 4-fold, respectively, compared with native mitochondria (p <0.001). We believe that the detected difference is due to the presence of various functional groups in the chemical structure of the 1,3,4-thiadiazine class derivatives.

Key words: mitochondria, thiadiazine, succinate dehydrogenase

Nadezhda Alisultanova, Minor Research Fellow. E-mail: alisultanova. nadezhda@mail. ru

Nadezhda Vakhnina, Candidate of Biology, Research Fellow. E-mail: vakhnina80@mail.ru

Vera Shadrina, Candidate of Biology, Research Fellow. E-mail: Vera. shadrina56@mail. ru

Evgeniy Boyko, Doctor of Medicine, Professor, Chief of the Department of Ecological and Medical Physiology. E-mail: erbojko@physiol.komisc.ru

Larisa Sidorova, Candidate of Chemistry, Associate Professor. E-mail: vlapp@isnet.ru

Oleg Chupakhin, Academician of RAS, Research Supervisor of the Institute. E-mail: chupakhin@ios.uran.ru