CC BY
40
ТЕХНОЛОГИЯ И АППАРАТЫ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ
УДК 615.322:582.287.237
М. А. Сысоева, В. Р. Хабибрахманова, В. С. Гамаюрова,
Г. И. Халиуллина, А. С. Опарина
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛЯ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ V. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В КИСЛЫХ СРЕДАХ.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МУРАВЬИНОГО БУФЕРА
Проведено разделение хромогенов водного извлечения чаги с помощью электрофореза на бумажном носителе. Подобраны условия для разделения фракций водного извлечения чаги при применении горизонтального электрофореза с использованием буфера на основе муравьиной кислоты. Показано, что проведение электрофореза с использованием в качестве буфера муравьиной кислоты позволяет отделить от дисперсной фазы золя слабо связанные и свободные хромогены водного извлечения чаги, которые подвижны как в сторону анода, так и в сторону катода.
Водные извлечения чаги содержат фенольные соединения как связанные в виде ас-социата - полифенолоксикарбонового комплекса (ПФК), так и свободные. Золь водного извлечения чаги интенсивно окрашен, что препятствует его изучению с помощью физикохимических методов исследования коллоидных растворов.
Горизонтальный электрофорез используют для разделения индивидуальных фенольных соединений, способных передвигаться в электрическом поле либо за счёт ионизации, либо приобретения заряда за счет участия в комплексообразовании с металлами. Для электрофоретического разделения фенолов на бумаге применяют различные буферные системы. Водный раствор муравьиной кислоты (рН 2,4) используют, например, для разделения антоцианов и бетацианов [1].
В водном извлечении чаги при рН 2,0 - 2,5 происходит седиментация золя с выпадением ПФК. При этом ПФК захватывает соединения, находившиеся в золе в свободном состоянии в составе дисперсионой среды, такие, например, как полисахариды [2]. Фильтрат после удаления ПФК имеет слабую желтовато-коричневую окраску, что свидетельствует о присутствии в нём фенольных соединений. Агрегация частиц ПФК при седиментации должна привести к меньшей подвижности связанных с ПФК хромогенов в электрическом поле и способствовать подвижности свободных или слабо связанных с ним частиц или соединений. При этом движение подвижных, не связанных фенольных соединений к катоду должно облегчить наличие в водном извлечении чаги высокого содержания зольных элементов - 25-50% [3].
Исследование водных извлечений чаги с помощью электрофореза важно, поскольку этот метод может позволить разделить золь на фракции подвижные в электрическом поле. Это более мягкое воздействие на природный золь водного извлечения чаги и его дисперсную фазу, ПФК, по сравнению с гидролизом. Привлечение этого метода к исследованию водных извлечений чаги сможет помочь ответить на вопросы о закономерностях формирования золя и структуре ПФК.
Целью проведения исследования является подбор условий разделения хромогенов водного извлечения чаги на фракции при применении горизонтального электрофореза на бумажном носителе с использованием муравьиного буфера (рН 2,4).
На всех полученных электрофоретограммах наблюдается окрашенный фронт, продвигающийся по направлению к аноду. Кроме этого, отмечается меньший по интенсивности окраски и длине продвижения фронт, двигающийся к катоду. И в том и другом случае не происходит отделения подвижного окрашенного фронта от интенсивно окрашенной, коричневой зоны на стартовой линии. На стартовой линии остаётся больше хромогенов, судя по тёмно коричневой окраске этой зоны. Под действием электрического поля, в муравьином буфере, наблюдается движение свободных, либо слабо связанных с ассоциатом ПФК фракций водного извлечения чаги. В УФ-свете, отделившиеся подвижные хромогены флуоресцируют, приобретая зеленоватую окраску. Обработка форетограмм парами аммиака усиливает цвет фронта. Оба факта указывают на то, что продвигающиеся по электрофоретограмме соединения относятся к классу фенолов. Можно предположить, что наблюдаемые подвижные соединения могут быть сложно организованы. Данные обсчёта электрофоретограмм с помощью денситометра приведены на рис. 1-4.
б
а
Рис. 1 - Электрофорез водного извлечения чаги: а - электрофоретограмма и денситограмма при 5мА и 350В; б - электрофоретограмма и денситограмма при 15мА и 350В
На всех электрофоретограммах яркость фронта продвигающегося к аноду не превышает шести, а к катоду двух единиц.
Электрофорез водного извлечения чаги при силе тока в 5мА и изменении напряжения от 200 до 400В даёт результаты, описанные ранее. Около стартовой линии, до Кг 0,1 практически на всех электрофоретограммах можно наблюдать разделение: пятна на стартовой линии более темно окрашены и отходящий от них ореол более светлого тона.
Это позволяет предположить, что хромогены ПФК неоднородны, и разделяются в условиях примененного электрофореза. Использование буфера с pH среды, близкой к седиментации ПФК приводит к снижению подвижности хромогенов на электрофоретограмме.
Рис. 2 - Электрофорез водного извлечения чаги при 10мА: а - электрофоретограмма и денситограмма при 200В; б - электрофоретограмма и денситограмма при 350В
Яркость, 103
а
Яркость, 1G3
б
Рис. Э - Электрофорез водного извлечения чаги при 20мА: а - электрофоретограмма и денситограмма при 300В; б - электрофоретограмма и денситограмма при 400В
Оптимальным режимом для электрофореза водного извлечения чаги при силе тока в 5мА является напряжение 350В, электрофоретограмма представлена на рис. 1а. На ней наблюдается максимальное удаление хромогенов от стартовой линии, как в сторону анода, так и в сторону катода, что зафиксировано с помощью денситометрии. Яркость фронта, двигающегося к аноду, достигает максимального значения в диапазоне Rf 0,2-0,4. Хромогены, двигающиеся к катоду, согласно денситограмме разделяются на две зоны, первая оканчивается около Rf 0,55, вторая имеет оптимум при Rf 0,9.
Электрофоретограммы приведённые на рис. 2, снятые в режиме 10мА при 200 и 350В, свидетельствуют об изменении распределения веществ, двигающихся к аноду и катоду по сравнению, как между собой, а также отличаются от распределения веществ на электрофоретограммах, снятых при режимах 5мА, напряжении 200 и 300В. Электрофорез водного извлечения чаги при 10мА и 350В дает максимальную яркость, около б единиц, в диапазоне Rf 0,2-0,4, хромогенов двигающихся к аноду, и позволяет получить обособленную зону, находящуюся на уровне Rf 0,5-0,8.
Электрофорез водного извлечения чаги при 15 мА с использованием всего диапазона напряжений показывает в целом картину близкую к электрофоретограммам, полученным при 10мА. Оптимальным режимом при силе тока в 15мА можно считать также напряжение 350В. Как показано на рис. 1б, распределение веществ, двигающихся к аноду, и интенсивность окраски аналогична рис. 2б. Имеются различия в отделении двух фракций с Rf 0,75 и 0,9, двигающихся к катоду. Начиная с этой силы тока, при всех исследованных напряжениях, в веществах, двигающихся к аноду, хромогенов становится меньше.
Наиболее интересные результаты электрофореза водного извлечения чаги при 20мА и напряжении 300 и 400В представлены на рис. 3. При интенсивности окраски около 5 единиц, к аноду двигаются вещества, более равномерно распределяясь по всей длине электрофоретограммы по сравнению с выше приведенными данными. К катоду двигается очень мало веществ, распределяясь по различным зонам, в зависимости от используемого напряжения.
Проведен электрофорез фильтрата, после удаления ассоциата ПФК из водного извлечения чаги, при режимах 5мА и 350В, а также 20мА и 400В, результаты представлены на рис. 4. Поскольку при малой силе тока, действительно, движение свободных хромогенов затруднено, как показано на рис. 1а. Следовательно, при этом режиме электрофореза от мицеллы ассоциата ПФК способны отделяться слабо связанные с ним частицы, несущие на своей поверхности положительный, либо отрицательный заряд. Их подвижность определяется молекулярной массой, либо зарядом на поверхности частиц.
Электрофорез фильтрата при силе тока в 20мА даёт другую картину на электрофоретограмме, что показано на рис. 4б. Этот режим электрофореза обеспечивает движение свободных частиц золя водного извлечения чаги, как к аноду, так и к катоду. Это показано также после проявления электрофоретограмм парами аммиака, нингидрином и раствором азотнокислого серебра. С помощью электрофореза кроме полифенолов в фильтрате подтверждено присутствие аминокислот и соединений с восстанавливающими свойствами, обладающими подвижностью в электрическом поле.
При проведении электрофореза водного извлечения чаги в муравьином буфере под действием электрического тока свободные и слабо связанные с ассоциатом ПФК соединения по разному подвижны.
Высокие значения силы тока и напряжения усиливают седиментацию ассоциата ПФК, при этом облегчается движение частиц, находящихся в золе в свободном состоянии. При низких показателях силы тока и напряжения облегчается фракционирование ассоциата ПФК в зоне стартовой линии, движение частиц, находящихся в золе в свободном состоянии, затруднено.
Рис. 4 - Электрофорез фильтрата после удаления ПФК из водного извлечения чаги: а) электрофоретограмма и денситограмма при 5мА и 350В; б) электрофоретограмма и денситограмма при 20мА и 400В
Экспериментальная часть
Для экстракции использовали сырье чаги, приобретенное в аптечной сети, производитель ЗАО «Фирма Здоровье». Вытяжки получали проведением процесса ремацерации [4]. Выделение из водной вытяжки полифенольного комплекса, с целью получения фильтрата, осуществляли согласно методике [5]. Для проведения электрофореза использовали электрофоретическую камеру 8Е-1 и источник питания «Эльф-4». Для электрофореграмм использовали медленно фильтрующую бумагу. Электрофорез водного извлечения чаги проводили с использованием муравьиного буфера рН = 2,4: при силе тока в 5 мА, снимали электрофоретограммы при напряжении 200, 250, 300, 350 и 400В; при силе тока в 10, 15 и 20 мА использовали те же значения напряжения. После проведения электрофореза электрофоретограммы обрабатывались парами аммиака, нингидрином и раствором азотнокислого серебра [6].
Обсчет электрофоретограмм проводили с использованием программы «8огЬШ ТЬС».
Литература
1. Чармс Ш., Фишбейн Л., Вагман Дж. и др. Хроматография: Практическое приложение метода Ч.2 / Под редакций Э.Хефтмана. М.: Мир, 1986. 422с.
2. Пат. 2231786 2002 (РФ) // Бюл. № 18, 2004.
3. Якимов П.А. СтупакМ.Ф.// Зольные элементы чаги и препарата из нее. Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л.: Медгиз, 1959. Вып.9. С.50-54.
4. Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С. и др. // Вестник Казанского технол. ун-та. 2003. №2. С.172-179.
5. МуравьеваД.А. Фармакогнозия. М.: Медицина, 1981. 714 с.
6. ЗапрометовМ. Н. Основы биохимии фенольных соединений. М.: Высшая школа, 1974. 214 с.
7. Северин С.С. Практикум по биохимии. М.: Изд-во МГУ, 1989. 509 с.
© М. А. Сысоева - канд. хим. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КГТУ; В. Р. Хабибрахма-нова - асс. той же кафедры; В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф. зав. каф. пищевой биотехнологии КГТУ; Г. И. Халиуллина - студ. КГТУ; А. С. Опарина - студ. КГТУ.
