CC BY
90
УДК 575:224.23:577.213
В.и. минина м.л. Баканова я.А. савченко А.А. Тимофеева 1, Т.П. Аносова 1, В.Д. Титов 2,
н.Е. Вержбицкая 3, А.н. Глушков 1
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ МЕЖДУ ПОЛИМОРФИЗМОМ ГЕНОВ РЕПАРАЦИИ ДНК И ЧАСТОТОЙ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЛЕГКОГО
1 Институт экологии человека СО РАМН (Кемерово)
2 Областной клинический онкологический диспансер (Кемерово) 3 Кемеровское патологоанатомическое бюро (Кемерово)
Проводили поиск ассоциаций между рядом полиморфизмов в генах репарации ДНК и уровнем хромосомных аберраций (ХА) в лимфоцитах крови, в двух группах: 215 больных раком, легкого и. 152 здоровых доноров. В группе больных РЛ уровень хромосомных аберраций был статистически, значимо выше у носителей генотипов TG и. GG гена XPD, по сравнению с генотипом. ТТ. В контрольной группе здоровых доноров уровень ХА был выше у носителей генотипа ТС гена ADPRT, по сравнению с генотипом. ТТ.
Ключевые слова: рак легкого, хромосомные аберрации, гены ферментов репарации ДНК
ASSOCiATiON OF DNA REPAIR GENE POLYMORPHiSM WiTH CHROMOSOMAL ABERRATiONS iN THE BLOOD LYMPHOCYTES OF PATiENTS WiTH LUNG CANCER
V.I. Minina 1, M.L. Bakanova 1, J.A. Savchenko 1, A.A. Timopheyeva 1, T.P. Anosova 1,
V.A. Titov 2, N.E. Verghbizkaja 3, A.N. Glushkov 1
11nstitute of Human Ecology SB RAMS, Kemerovo
2 Regional Clinical Oncology Dyspensary, Kemerovo
3 Pathologoanatomic bureau, Kemerovo
Analysis of association between several DNA repair gene polymorphisms and the level of chromosomal aberrations (CAs) in lymphocytes was performed in two groups: a group of 215 patients with lung cancer and a control group of 152 donors. In the group patient with lung cancer the level of CAs shows a significant increase in the carrier of genotypes: XPD TG and XPD GG vs XPD TT. In the control group level of CAs shows a significant increase in the carrier of genotype ADPRT ТС vs ТТ.
Key words: lung cancer, сhromosomal aberrations, DNA repair gene
Рак легкого (РЛ) занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости и смертности среди мужского населения России. Известно, что риск РЛ существенно возрастает у курящих лиц, особенно в условиях загрязнения вдыхаемого атмосферного воздуха продуктами термической обработки угля, древесной и металлической пылью. Ввиду высокой концентрации предприятий угледобывающего и перерабатывающего комплекса на территории Кемеровской области особую актуальность представляют исследования больных РЛ, проживающих в этом регионе.
Признанным маркером мутагенного воздействия среды на организм являются хромосомные аберрации (ХА) в лимфоцитах крови, однако остается много неясного относительно специфики их формирования у больных злокачественными опухолями.
Известно, что тонкие изменения специфических белков, функционирующих в репаративных системах, потенциально способны приводить к мутагенезу [11]. Интенсивно изучаются ассоциации уровня повреждений ДНК и полиморфизмов генов ферментов репарации: XRCC1, XPD/ERCC2, hOGG1, APE1, ADPRT. Понимание роли генетических повреждений и их репарации в механизме возникновения РЛ сегодня являются основной предпосылкой для разработки новых терапевтических технологий и диагностических критериев в
оценке функционирования молекулярных звеньев этиологической цепочки процесса инициации данного онкологического заболевания.
В связи с этим целью данного исследования стало изучение связи ХА с полиморфизмом генов репарации ДНК у жителей Кемеровской области больных РЛ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Было обследовано 367 человек. Из них 215 больных РЛ, проживающих на территории Кемеровской области, поступивших на лечение в Кемеровский областной онкологический диспансер. В группу вошло 180 мужчин и 37 женщин. Среди обследованных соотношение курящие/некурящие составило 181/37. Средний возраст — 58 лет. Группу сравнения составили 152 здоровых донора (56 мужчин и 96 женщин; средний возраст — 44 года; курящих и некурящих — 40/115), также проживающих в Кемеровской области.
Материалом для исследования послужила цельная периферическая кровь. Культивирование клеток крови осуществляли по стандартному полу-микрометоду [7]. Питательную смесь готовили из расчета: среда RPMI—1640 (6 мл), сыворотка крупного рогатого скота (1,5 мл) и 0,1 мл фитогемагглю-тинина (ПанЭко). Смесь помещали в стерильные культуральные флаконы и добавляли 0,5 мл гепа-
ринизированной крови. Культуральные флаконы выдерживали при 37 °С в течение 48 часов. За 2 часа до фиксации в культуры вводили колхицин (0,5 мкг/мл). После гипотонической обработки и фиксации клеток суспензию раскапывали на охлажденные чистые предметные стекла и высушивали над пламенем спиртовки. Препараты окрашивали 1% красителем Гимза и анализировали под микроскопам Axioskop 2 plus (Carl Zeiss, Germany). Для учета ХА у каждого индивида проанализировано от 100 до 200 метафаз. Регистрировали аберрации хромосомного и хроматидного типов в соответствии с общепринятыми требованиями [2]. Долю аберрантных метафаз определяли путем подсчета частоты метафаз с аберрациями хромосом (в процентах от изученного числа клеток).
Для изучения полиморфизмов генов репарации ДНК: APE1 Asp148Glu; hOGG1Ser326Cys; XPD Lys751Gln; ADPRT Val762AIa использовали коммерческую тест-систему «SNP-express» (НПФ «Литех», г.Москва). ПЦР проводили на амплификаторах ТЕРЦИК (НПФ «ДНК-Технология», Россия) по программе, рекомендованной производителем набора. Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в горизонтальном 3% агарозном геле. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.
Статистическая обработка материала проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Для основных показателей рассчитывали средние значения и их стандартные ошибки (М ± m). Распределение значений всех изученных показателей сравнивалось с нормальным методом Колмогорова-Смирнова. По результатам анализа установлено, что распределение всех изучаемых цитогенетических параметров отличалось от нормального. На основании этого, в дальнейшем, для сравнения групп использовали ранговый U-тест Манна — Уитни. Сравнение частот генотипов проводили с помощью четырехпольной таблицы сопряженности с поправкой Йетса на непрерывность вариации (с2). Нулевую гипотезу отвергали при p < 0,05. [1].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенного исследования было зафиксировано, что средняя частота аберрантных метафаз у больных РЛ составила 2,88 ± 0,13 %, что статистически значимо выше, чем в группе здоровых - 1,79 ± 0,13 % (UM-W = 21253; р = 0,00001). Увеличение частоты аберраций хромосом в группе больных РЛ достигается, преимущественно, за счет одиночных фрагментов.
Сопоставление цитогенетических параметров между мужчинами и женщинами не выявило никаких различий между полами, как в опытной, так и в контрольной группе. Наблюдаемые различия частоты ХА между РЛ и контролем достигали статистической значимости как у мужчин (р = 0,000004), так и у женщин (р = 0,02).
Анализ воздействия фактора курения не показал значимых отличий ХА между группами курящих и некурящих в изученных выборках больных РЛ и здоровых доноров.
На следующем этапе проводился анализ полиморфизмов генов репарации ДНК в изучаемых группах. Учитывая тот факт, что средний возраст в группе здоровых доноров был ниже (43 года), чем в группе больных РЛ (58 лет), первоначально проводилась проверка влияния возраста на частоты генотипов. Группы были разделены на подгруппы: до 50 лет и старше 50 лет. Сопоставление частот генотипов всех изученных генов в данных подгруппах показала отсутствие статистически значимых отличий. Исходя из этого, в дальнейшем мы проводили сравнение групп больных РЛ и здоровых доноров без подразделения их на возрастные подгруппы.
Проведенный анализ позволил выявить значимую положительную ассоциацию генотипа hOGG1 GG с РЛ (8,9 % в исследуемой группе против 1,3 % в группе сравнения; х 2 = 4,23; p = 0,04; RR = 5,99; CI = 2,25—15,97). Для генотипа CC гена hOGG1 выявлена значимая отрицательная ассоциация с РЛ (66,3 % в группе сравнения против 46,1 % в исследуемой группе; х2 = 7,07; p = 0,008; RR = 0,44; CI = 0,17-1,17).
Ген hOGG1 кодирует фермент ДНК-гликозилазу, которая вырезает мутантное основание 7,8-дигидро-8-оксогуанин (8-OHdG), возникающее в результате воздействия на ДНК свободных радикалов. Для аллеля hOGG1 326Cys установлена сниженная функциональная активность кодируемого им фермента [6], что приводит к снижению индивидуальной способности к репарации повреждений ДНК и повышению чувствительности к канцерогенам [12].
На следующем этапе был проведен анализ частоты ХА в зависимости от различных генотипов генов системы репарации ДНК. Результаты представлены в таблицах 1 и 2. В группе здоровых доноров (табл.1) показатели хромосомного мутагенеза: доля аберрантных метафаз, доля аберраций на 100 клеток, аберраций хромосомного типа были статистически значимо выше у носителей генотипа ТС гена ADPRT, по сравнению с генотипом ТТ. Повышения уровня ХА у носителей различных комбинаций генотипов изученных генов выявлено не было.
Ген ADPRT (adenosine diphosphate ribosyl transferase) кодирует ассоциированный с хроматином фермент поли-АДФ-рибозил-полимеразу (PARP), которая модифицирует различные ядерные белки. PARP относится к одному из ядерных факторов, первым распознающим повреждение ДНК, входит в мультипротеиновый комплекс (МР-комплекс), включающий, кроме него, еще фактор XRCC1, ДНК-лигазу III и бета-ДНК-полимеразу. PARP способен регулировать активность МР-комплекса путем модифицирования белков. Кроме того, PARP служит источником энергии для ДНК-лигаз, описано участие PARP в процессах репликации, транскрипции, модификации хроматина и апоптоза [8]. Трансверсия Т-С в сайте 2285 локализована в каталитическом домене белка и сопровождается потерей метильной
Таблица 1
Характеристика основных цитогенетических показателей у здоровых доноров из группы сравнения с различными генотипами системы репарации ДНК
Полиморфизм Генотип n Доля аберрантных метафаз, % Аберраций на 100 клеток, % Аберраций хроматидного типа, % Аберраций хромосомного типа, %
APE(X)1 T444G TT 53 1,8 ± 0,3 1,6 ± 0,2 1,5 ± 0,2 0,3 ± 0,1
TG 57 2,1 ± 0,3 2,0 ± 0,3 1,7 ± 0,3 0,4 ± 0,1
GG 29 1,9 ± 0,4 1,6 ± 0,4 1,8 ± 0,4 0,1 ± 0,07
hOGGI C977G СС 91 1,8 ± 0,2 1,7 ± 0,2 1,5 ± 0,2 0,3 ± 0,1
CG 59 2,3 ± 0,3 2,1 ± 0,3 1,9 ± 0,3 0,3 ± 0,1
GG 2 3,0 ± 0,9 3,0 ± 0,9 3,0 ± 0,9 0
ADPRT T2285C ТТ 65 1,3 ± 0,2* 1,2 ± 0,2* 1,1 ± 0,2* 0,3 ± 0,1
ТС 44 2,8 ± 0,4 2,6 ± 0,4 2,3 ± 0,4 0,5 ± 0,1
CC 8 2,5 ± 0,9 2,4 ± 0,7 2,1 ± 0,7 0,3 ± 0,2
XPD T2251G TT 49 1,9 ± 0,3 1,8 ± 0,2 1,6 ± 0,2 0,3 ± 0,1
TG 65 1,9 ± 0,3 1,8 ± 0,3 1,6 ± 0,2 0,3 ± 0,1
GG 22 2,3 ± 0,5 2,0 ± 0,4 2,0 ± 0,4 0,3 ± 0,1
Примечание: * - отличается от ADPRT ТС, р = 0,002.
группы, в результате чего может нарушаться связь одной из петель белка с активным центром фермента, что в свою очередь может являться причиной снижения функциональной активности белка [5]. Замена Val762AIa связывается с повышенной предрасположенностью к развитию некоторых форм рака [9]. В работе Zhang (2005) было обнаружено небольшое повышение риска рака для замены ADPRT VaI762AIa и 5-кратное возрастание риска для сочетания ADPRT 762AIaAIa XRCC1 399GInGIn [15]. Кроме того, было показано повышение частоты ХА в клетках крови детей с генотипами ADPRT AlaAla, ADPRT ValAla, по сравнению с ADPRT ValVal, проживающих в условиях воздействия повышенных доз
радона [3]. В данном же исследовании, впервые была показана значимость генотипа ADPRT в формировании хромосомных нарушений у взрослых здоровых доноров в условиях спонтанного мутагенеза.
В группе больных РЛ (табл. 2) уровень хромосомных аберраций (показатели: доля аберрантных метафаз, доля аберраций на 100 клеток, аберраций хромосомного типа) был статистически значимо выше у носителей генотипов TG и GG гена XPD, по сравнению с генотипом ТТ.
Ген XpD/ERCC2 (excision repair crosscomplementing rodent repair deficiency, complementation group 2 [xeroderma pigmentosum D]) локализован на хромосоме 19q32.2 и кодирует АТФ-независимую
Таблица 2
Характеристика основных цитогенетических показателей у больных раком легкого с различными генотипами
системы репарации ДНК
Полиморфизм Генотип n Доля аберрантных метафаз, % Аберраций на 100 клеток, % Аберраций хроматидного типа, % Аберраций хромосомного типа, %
APE(X)1 T444G TT 52 3,4 ± 0,4 3,3 ± 0,4 2,8 ± 0,3 0,6 ± 0,1
TG 65 2,9 ± 0,3 2,9 ± 0,3 2,6 ± 0,2 0,4 ± 0,1
GG 49 3,2 ± 0,3 3,2 ± 0,3 2,7 ± 0,3 0,6 ± 0,1
hOGGI C977G СС 99 2,9 ± 0,2 2,9 ± 0,2 2,5 ± 0,2 0,4 ± 0,1
CG 75 3,5 ± 0,3 3,4 ± 0,3 2,9 ± 0,3 0,5 ± 0,1
GG 17 2,4 ± 0,4 2,4 ± 0,4 1,9 ± 0,4 0,4 ± 0,2
ADPRT T2285C ТТ 127 3,2 ± 0,2 3,1 ± 0,2 2,7 ± 0,2 0,5 ± 0,1
ТС 75 3,0 ± 0,3 3,0 ± 0,3 2,7 ± 0,2 0,4 ± 0,1
CC 15 2,7 ± 0,6 2,6 ± 0,6 2,4 ± 0,5 0,3 ± 0,1
XPD T2251G TT 45 2,7 ± 0,3* 2,7 ± 0,3* 2,5 ± 0,3 0,3 ± 0,1*
TG 80 3,3 ± 0,3 3,2 ± 0,3 2,9 ± 0,2 0,4 ± 0,1**
GG 44 3,5 ± 0,3 3,6 ± 0,3 2,8 ± 0,3 0,8 ± 0,1
Примечание: * - отличается от XPDTG и XPD GG, p = 0,01; ** - отличается от GG, р = 0,04.
хеликазу. Это ключевой белок эксцизионной репарации нуклеотидов, который узнает и исправляет различные мутации (сшивки оснований — тими-новые димеры, аддукты ДНК, окислительные повреждения ДНК и др.), образующиеся, например, после УФ-облучения или оксидативного стресса. В составе TFIIH транскрипционного комплекса хеликаза XpD раскручивает цепь ДНК, обеспечивая доступ эндонуклеаз к поврежденному участку. Полиморфизм T2251G, приводящий к замене Lys-751Gln меняет конфигурацию белка и может влиять на его взаимодействие с хеликазным активатором p44, приводя к уменьшению репаративной способности и повышению риска онкозаболеваний [4].
В ряде исследований было показано значение данной нуклеотидной замены при оценке частоты цитогенетических нарушений. Обнаружено возрастание общей частоты аберраций в лимфоцитах крови у носителей аллеля XpD 751Gln после облучения [13] и при воздействии комплекса токсикантов шинного завода [10].
Таким образом, в результате проделанной работы можно сделать следующие выводы:
• частота хромосомных нарушений в лимфоцитах периферической крови у больных РЛ выше, чем у здоровых доноров;
• установлено, что у обладателей генотипа hOGG1 GG в 5,9 раз выше риск РЛ, по сравнению с носителями других вариантов генотипов (СС, CG).
• в группе больных РЛ уровень ХА был статистически значимо выше у носителей генотипов TG и GG гена XPD, по сравнению с генотипом ТТ.
• в контрольной группе здоровых доноров уровень ХА был выше у носителей генотипов ТС гена ADPRT, по сравнению с генотипом ТТ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Животовский Л.А. Популяционная биометрия. — М.: Наука. — 1991. — 272 с.
2. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П., Барановская Л.И. Хромосомы человека. — М.: Медицины, 1982. — 263 c.
3. Минина В.И., Дружинин В.Г., Лунина А.А., Ларионов А.В. и др. Исследование взаимосвязи между полиморфизмом генов репарации ДНК и частотой хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека // Эколог. генетика. — 2011. — Т. IX, № 2. — С. 74 — 79.
4. Benhamou S., Sarasin A. ERCC2/XPD polymorphisms and lung cancer // Am J Epidemiol. — 2005. — Vol. 161. — P. 1 — 14.
Сведения об авторах
5. Cottet F., Blanche H., Verasdonck P. New polymorphisms in the human poly (ADP-ribose) polymerase-1 coding sequence: lack of association with longevity or with increased cellular poly (ADP-ribosyl)ation capacity // J. Mol. Med. — 2000. — Vol. 78. - P. 471 -480.
6. Dherin C., Radicella J.P., Dizdaroglu M. Excision of oxidatively damaged DNA bases by the human ahOGGl protein and the polymorphic ahOGGl (Ser326Cys) protein which is frequently found in human population // Nucleic Acids Research. — 1999. — Vol. 27. — N 20. — P. 4001 —4007.
7. Hungerford P.A. Leukocytes cultured from small inocula of wholeblood and the preparation of metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KCl // Stain Techn. — 1965. — Vol. 40. — P. 333 — 338.
8. Godon C., Cordelieres F.P., Biard D. PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility // Nucleic Acids Res. — 2008. — Vol. 36. — P. 4454 — 4464.
9. Lockett K., Hall M.C., Xu J. The ADPRT V762A genetic variant contributes to prostate cancer susceptibility and deficient enzyme function // Cancer Research. — 2004. — Vol. 64. — P. 6344 — 6348.
10. Musak L., Soucek P., Vodickova L. Chromosomal aberrations in tire plant workers and interaction with polymorphisms of biotransformation and DNA repair genes // Mutat Res. — 2008. — Vol. 641, N 1—2. — P. 36 — 42.
11. Nemec A., Wallace S., Sweasy J. Variant base excision repair proteins: Contributors to genomic instability // Seminars in Cancer Biology. — 2010. — Vol. 20. — P. 320 — 328.
12. Park J., Chen L., Tockman M.S. The human 8-ox-oguanine DNA N-glycosylase 1 (hOGG1) DNA repair enzyme and its association with lung cancer risk // Pharmacogenetics. — 2004. — Vol. 14, N 2. — P. 103 — 112.
13. Parshad R., Tarone R.E., Price F.M. Cytogenetic evidence for differences in DNA incision activity in xeroderma pigmentosum group A, C and D cells after X-irradiation during G2 phase // Mutat. Res. — 1993. — Vol. 294. — P. 149—155.
14. Weiss J.M., Goode E.L., Ladiges W.C. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature // Mol. Carcinog. — 2005. — Vol. 42. — P. 127—141.
15. Zhang X., Miao X., Liang G. Polymorphisms in DNA Base Excision Repair Genes ADPRT and XRCC1 and Risk of Lung Cancer // Cancer Res. — 2005. — Vol. 65, N 3. — P. 722 — 726.
Минина Варвара Ивановна - руководитель группы цитогенетики ИЭЧ СО РАН, доцент , кандидат биологических наук (660002, г Кемерово, пр. Шахтеров, 72а, кв. 2; тел.: 8-923-616-45-52; e-mail: vminina@mail.ru)
Баканова Марина Леонидовна - младший научный сотрудник ИЭЧ СО РАН (650000, г. Кемерово, пр. Октябрьский, 42-240) Савченко Яна Александровна - младший научный сотрудник ИЭЧ СО РАН (650056, г Кемерово, ул. Волгоградская 29, кв. 30) Тимофеева Анна Александровна - инженер-технолог ИЭЧ СО РАН (650065, г. Кемерово, Ленинградский, 10)
Аносова Татьяна Петровна - научный сотрудник ИЭЧ СО РАН (650000, г. Кемерово, ул. Волгоградская, 35)
Титов Виктор Александрович - заведующий торакальным отделением ФГБУЗ КО Областного клинического онкологического диспансера (650052, г. Кемерово, ул. Волгоградская, 35)
Вержбицкая Наталья Евгеньевна - заведующая патологоанатомическим отделением в ГБУЗ КО ОТ Кемеровском патологоанатомическим бюро (650052, г. Кемерово, ул. Волгоградская, 35)
Глушков Андрей Николаевич - директор ИЭЧ Со РАН, доктор медицинских наук, профессор (650065, г. Кемерово, пр. Ленинградский, 10; тел.: (3842) 57-50-79)
