CC BY
46
DOI: 10.23868/201812047
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЫЖИВАЕМОСТИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КАРДИОМИОЦИТОВ, ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ ИЗ ИПСК ЧЕЛОВЕКА, ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ В МЫШЕЙ ЛИНИИ SCiD
С.В. Павлова1-3, Е.В. Чепелева2, Е.В. Дементьева1-3, Е.В. Григорьева1-4, Е.Д. Сорокоумов5, М.М. Слотвицкий6, А.В. Пономаренко2, А.А. Малахова1-4, А.А. Докучаева2, Д.С. Сергеевичев2, Е.А. Покушалов2, С.М. Закиян1-4
1 Федеральный исследовательский центр «Институт цитологии и генетики» СО РАН, Новосибирск, Россия
2 Национальный медицинский исследовательский центр имени академика Е.Н. Мешалкина, Новосибирск, Россия
3 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия
4 Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия
5 Институт вычислительных технологий СО РАН, Новосибирск, Россия
6 Московский физико-технический институт (государственный университет), Долгопрудный, Россия
SURVIVAL AND FUNCTIONAL ACTIVITY EXAMINATION OF CARDIOMYOCYTES DIFFERENTIATED FROM HUMAN IPSCS, WHEN TRANSPLANTING IN SCID MICE
S.V. Pavlova1-3, E.V. Chepeleva2, E.V. Dementyeva1-3, E.V. Grigor'eva1-4, E.D. Sorokoumov5, М.М. Slotvitsky6, A.V. Ponomarenko2, А.А. Dokuchaeva2, A.A. Malakhova1-4, D.S. Sergeevichev2, E.A. Pokushalov2, Sm Zakian1-4
1 Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics of the SO of the RAS, Novosibirsk, Russia
2 E.N. Meshalkin National Medical Research Center, Novosibirsk, Russia
3 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of the SO of the RAS, Novosibirsk, Russia
4 Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
5 Institute of Computational Technologies of the SO of the RAS, Novosibirsk, Russia
6 Moscow Institute of Physics and Technology (State University), Dolgoprudny, Russia
e-mail: sonpavlova@gmail.com
Нарушения проводимости и сердечного ритма могут быть вызваны как функциональной патологией, так и тяжёлыми органическими поражениями сердца. В настоящее время изучается возможность применения заместительной клеточной терапии на основе кардиомиоцитов, полученных из индуцированных плю-рипотентных стволовых клеток, для компенсации утраченной ткани миокарда или проводящей системы. Цель работы — изучение выживаемости и функциональной активности кардиомиоци-тов, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, при интрамиокардиальной и подкожной абдоминальной трансплантации в сгустке белков экстраклеточного матрикса Matrigel иммунодефицитным мышам линии SCID. Кардиомиоциты анализировали на маркеры карди-альной дифференцировки, проводили электрофизиологическое исследование. Через 2 и 5 недель после интрамиокардиальной и через 2, 7, 14, 21 и 28 суток после подкожной трансплантации изучали выживаемость кардиомиоцитов цитологическими методами. Кардиомиоциты человека выявлялись в организме мышей как минимум в течение 35 суток после интрамиокардиальной трансплантации, однако на электрокардиограммах эктопическая электрическая активность миокарда не была зафиксирована. После подкожной трансплантации кардиомиоциты сохраняли жизнеспособность в течение всего срока эксперимента.
При оценке функциональной активности кардиомиоцитов в составе подкожных матригельных трансплантатов методом оптического картирования потоков ионов кальция на 2-28 сут. после инъекции было показано, что лишь незначительная часть кардиомиоцитов после трансплантации оказалась способна к спонтанной осцилляции потоков ионов кальция. Мы предполагаем, что сократительные кардиомиоциты, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, при трансплантации in vivo теряют способность к спонтанному возбуждению и при оптическом картировании мы наблюдаем только активность пейсмейкерных кардиомиоцитов.
Ключевые слова: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, кардиомиоциты, пейсмейкерные клетки, клеточная трансплантология, матригельный трансплантат, оптическое картирование.
Conduction and heart rhythm disorders can be caused by both functional pathology and severe organic lesions of the heart. The possibility of using cell-based replacement cell therapy derived from induced pluripotent stem cells to compensate for lost myocardial tissue or the conduction system is currently being studied. The aim of the work is to study the survival and functional activity of cardio-myocytes differentiated from induced human pluripotent stem cells in intramyocardial and subcutaneous abdominal transplantation in a clots of proteins of the basement membrane matrix Matrigel to the SCID mice. After 2 and 5 weeks after intramyocardial and 2, 7, 14, 21 and 28 days after subcutaneous transplantation, the survival and activity of cardiomyocytes were studied by cytological methods. Human cardiomyocytes were detected in mice for at least 35 days. after transplantation and did not cause ectopic electrical activity of the myocardium. When assessing the functional activity of cardiomyocytes in subcutaneous matrigel plugs using the method of optical mapping of calcium ion currents for 2-28 days. after injection, it was shown that only a small fraction of cardiomyocytes after transplantation was able to spontaneously oscillate the calcium ions. We assume that contractile cardiomyocytes obtained from induced pluripotent human cells lose their ability to spontaneous excitation during in vivo transplantation, and we observe only the activity of pacemaker cardiomyocytes in optical mapping.
Keywords: induced pluripotent stem cells, cardiomyocytes, pacemaker cells, cell transplantology, matrigel plug, optical mapping.
Введение
Лечение нарушений ритма сердца путем установки искусственного водителя ритма пока остается единственным методом борьбы с аритмией различного ге-неза. Разработка биологического водителя ритма может в корне изменить существующие тактики лечения аритмий.
Клеточная терапия заболеваний сердца является одной из перспективных медицинских технологий, применение которой возможно даже с помощью малоинва-зивных эндоваскулярных способов доставки клеточного материала. Зачастую клеточная терапия остается последним шансом излечить пациента или улучшить качество его жизни.
Кардиомиоциты, полученные в результате направленной дифференцировки индуцированных плюрипо-тентных стволовых клеток (ИПСК) человека, — наиболее перспективный тип клеток для заместительной клеточной терапии миокарда, так как они обладают свойствами сократимости, возбудимости, отвечают на сигналы симпатической и парасимпатической нервной системы, и, как показано в in vitro исследованиях, могут формировать функциональные контакты с кар-диомиоцитами реципиента [1-3]. Однако кардиомио-циты, дифференцируемые из ИПСК, функционально незрелые и имеют фетальный фенотип. Для ускорения процесса созревания кардиомиоцитов, получаемых из ИПСК, используют технологии создания клеточных пластов и культивирования при стимуляции электрическим током [4-9]. Одним из признаков незрелости кардиомиоцитов, полученных из ИПСК, является их способность спонтанно сокращаться и генерировать потенциал действия независимо от мембранного механизма автоматии (М-часов), присущего пейсмейкерам. Способность автоматически сокращаться у незрелых кардиомиоцитов из ИПСК обусловлена стохастическими процессами кальциевого обмена в клетке, приводящими к осцилляции ионов кальция в цитоплазме кардиомиоцита [10-13].
Цель исследования — оценка функциональных свойств кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПСК человека, после интрамиокардиальной и подкожной абдоминальной трансплантации в сгустке белков экстраклеточного матрикса Matrigel мышам линии SCID (Severe Combined Immuno Deficiency).
Материал и методы
Дизайн эксперимента
Анализ выживаемости и функциональной активности кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПСК человека, выполняли на самцах иммунодефицитных мышей линии SCID (n=19, возраст 6-8 недель, вес 26-30 г). Кардиомиоциты на 20-24 сут. после дифференцировки из ИПСК человека трансплантировали в суспензии RPMI-Matrigel (1:1) интрамиокардиально (n=4) и подкожно (n=15). При абдоминальной подкожной трансплантации формировался сгусток белков экстраклеточного матрикса с кардиомиоцитами (матригельный трансплантат), который хорошо визуализировался весь срок эксперимента.
Работа с животными проводилась в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755 и приложение к приказу МЗ СССР № 565 от 04.10.1977 г.) и принципами Хельсинкской декларации, разработанной Всемирной медицинской ассоциацией (2000 г.). Животные содержались на стандартной диете и имели свободный
доступ к воде. Исследования выполняли на базе ЦКП «Центр генетических ресурсов лабораторных животных» ФИЦ ИЦиГ СО РАН, разрешение этической комиссии № 22.4 от 30.05.2014 г.
Получение культуры кардиомиоцитов
ИПСК человека линии iMA1L, полученные в лаборатории эпигенетики развития ИЦиГ СО РАН [14], культивировали на пластике, предварительно покрытым тонким слоем (9 мкг/см2) Matrigel growth factor-reduced (Matrigel GFR, Corning, США) в среде Essential B™ (Thermo Fisher Scientific, США) в стандартных условиях согласно рекомендациям фирмы-производителя. После пассирования ИПСК с использованием 0,5 мМ ЭДТА (Thermo Fisher Scientific) в среду Essential B™ добавляли ингибитор Y-27632 (StemRD, США) в концентрации 10 мкМ на 1 сут. При плотности монослоя 80-90 % на 3-4 сут. культивирования запускали кардиальную дифференцировку с помощью 6 мкМ CHIR99021 (StemRD, США), инкубируя клетки в среде RPMI 1640 (Lonza, США), дополненной B27 без инсулина (Thermo Fisher Scientific), в течение 48 ч. Для терминальной дифференцировки в кардиомиоциты на 4 сут. культивирования в питательную среду добавляли ингибитор IWP2 (Sigma-Aldrich, Германия) в концентрации 5 мкМ на 4B ч. С 10 сут. дифференцировки проводили метаболическую селекцию кардиомицитов в среде RPMI 1640 без D-глюкозы (Thermo Fisher Scientific), содержащей 213 мкг/мл L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата (Sigma-Aldrich, Германия), 500 мкг/мл ре-комбинантного альбумина человека (Sigma-Aldrich) и 5 мМ DL-лактата натрия (L4263, Sigma-Aldrich, Германия). На 14-20 сут. дифференцировки кардиоми-оциты пересевали с помощью TrypLETM Express (Thermo Fisher Scientific, США) на обработанный Matrigel GFR культуральный пластик в среду RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific), США, содержащую 20 % эмбриональной бычьей сыворотки (Autogene Bioclear, США), В27 c инсулином (Thermo Fisher Scientific) и 10 мкМ ингибитора Y-27632 (StemRD, США). Через 2 сут. проводили замену среды RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific, США) c добавкой В27 (RPM№27), и продолжали культивировать кардиомиоциты до 1 года.
Проточная цитофлуориметрия
На 14-20 сут. после начала дифференцировки популяцию кардиомиоцитов, полученных из ИПСК, дезагрегировали с помощью TrypLETM Express и количество жизнеспособных клеток подсчитывали на CountessTM Automated Cell Counter (Thermo Fisher Scientific, США) после окрашивания трипановым синим.
Для проточной цитофлуориметрии клетки фиксировали 1 % параформальдегидом (ПФА) и инкубировали с меченными PE антителами к белку SIRPa (CD172a), (Biolegend, США, 323B06) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Негативный контроль — изоти-пические антитела, меченные флуорохромом PE Mouse IgG1 к Isotype (Biolegend, США, 400114). Клетки, связывающие антитела к белку HCN4 (Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide-gated channel 4, Abcam, Великобритания, ab32679) выявляли с помощью меченных антител Alexa Fluor 4BB anti-mouse IgG (H+L) (A11029), (Thermo Fisher Scientific, США, 2 мкг на 0,5x106 клеток). Изотипический контроль — клетки, инкубировавшиеся только со вторыми антителами. Анализ клеточной популяции проводили на приборе FACS Canto II (BD Biosciences, США) в программе FACS Diva (FACS-анализ).
Электрофизиологическая
характеристика кардиомиоцитов
Электрофизиологические исследования кардиоми-оцитов выполняли на отдельных спонтанно сокращающихся клетках методом локальной фиксации потенциала в режиме регистрации со всей поверхности клетки на аппаратном комплексе, в который входят усилитель Multiclamp 700B (Molecular Devices, США), система сбора данных Digidata 1550 (Axon Instruments, США) и программный пакет pCLAMP 10 (Molecular Devices, США). Оцифровку сигнала проводили с частотой 10 кГц. После того, как был установлен контакт с кардиомиоцитом, подавали поддерживающий потенциал -70 мВ. Стеклянные электроды вытягивали из боросиликатных заготовок (Sutter Instrument, США), сопротивление составляло 4-6 мОм. Электроды заполняли раствором, содержащим 10 мМ NaCl, 145 мМ C6H11KO7, 10 мМ HEPES, 1 мМ MgCl^^O, pH 7,2~7,4 (нейтрализация раствора KOH). Клетки постоянно омывали раствором, содержащим 140 мМ NaCl, 2,8 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 1 мМ Mg^^^O, 2 мМ CaCl^^O, pH 7,2~7,4 (нейтрализация раствора KOH) и аэрирововали газовой смесью, состоящей из 95 О O2 и 5 О CO2 [15].
Трансплантация кардиомиоцитов
в мышей линии SCID
Интрамиокардиальная трансплантация. За 10 мин. до интраперитонеальной наркотизации Золетилом 100 (30 мг/кг; Virbac Sante Animale, Франция) мышам вводили миорелаксант Домитор (0,25 мг/кг; Оrionpharma, Россия). Доступ к сердцу выполняли без интубации методом ручного выведения сердца из грудной полости через минимальный разрез [16]. Трансплантацию 1 x105 кардиомиоцитов в 20 мкл смеси RPMI-Matrigel GFR (1:1) в миокард мышей (n=4) проводили инсулино-вым шприцем Microfine со встроенной иглой 30G (BD, Германия). Контрольным животным (n=2) инъецировали смесь RPMI-Matrigel GFR (1:1) без кардиомиоцитов. Животных выводили из эксперимента через 2 и 5 недель после интрамиокардиальной трансплантации. Перед трансплантацией кардиомиоцитов и эвтаназией животным делали ЭКГ на приборе Cardiovit AT-102 (Schiller, Швейцария).
Подкожная трансплантация. Для проведения эксперимента по изучению выживаемости кардиомио-цитов при подкожной трансплантации 11 x106 клеток в 2,5 мл среды RPMI смешивали с равным объемом Matrigel GFR и вводили абдоминально мышам по 200 мкл (0,5x106 кардиомиоцитов, n=15); для контроля по 1 00 мкл смеси раскапывали на пластик для формирования сгустков белков экстраклеточного ма-трикса Matrigel с кардиомиоцитами in vitro, которые далее культивировали в среде RPMI-B27 при 370 C в CO2-инкубаторе весь срок эксперимента Животных выводили из эксперимента и извлекали матригельные трансплантаты через 2, 7, 14, 21 и 28 сут. (n=3 для каждого срока), половину каждого образца использовали для изготовления гистологических препаратов, другую половину — для проведения оптического картирования потоков ионов кальция с помощью флуоресцентного красителя Fluo8 (Abcam, Великобритания). Для уменьшения неспецифического связывания Fluo8 «тканью» матригельного трансплантата его инкубировали при 37°C в культураль-ной среде RPMI-B27 не менее 2 сут.
Для всех временных точек на гистологических препаратах матригельных трансплантатов и контрольных образцах in vitro производили подсчет клеток, окрашенных антителами aSА (Abcam, ab9465) к белку саркомерный
а-актинин, в 5 полях зрения на объективе х10 микроскопа Nikon Ti-E (Япония).
Оптическое картирование потоков
ионов кальция в кардиомиоцитах
Кальций-зависимый краситель Fluo8 добавляли в питательную среду, в которой инкубировали кардио-миоциты на пластике, в сгустке белков экстраклеточного матрикса Matrigel или матригельные трансплантаты, до концентрации 4 мкМ на 30-40 мин. при 37°C, отмывали раствором Tyrode, рН 7,4 (Sigma-Aldrich) и документировали осцилляцию потоков ионов кальция в клетках с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse Ti-E с камерой Nicon DS QilMc и программным пакетом NIS (Nikon). Видео c фиксированными параметрами видеонаблюдения обрабатывали в программе ImageJ с дополнениями (http://rsbweb.nih. gov/ij/) и строили графики зависимости интенсивности сигнала от времени [3].
Иммунофлуоресцентный анализ (ИФ-анализ)
Кардиомиоциты, полученные из ИПСК, фиксировали в течение 10 мин. в 4 % ПФА, пермеабилизовали 10 мин. в 0,4 % растворе Тритона-Х-100 и далее окрашивали антителами, как описано ранее [14, 17, 18]. Материал миокарда и матригельного трансплантата кардиомиоцитов замораживали в среде Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek Inc., Япония) при -20°С и готовили серийные криосрезы толщиной 10 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятой методике [17]. После размораживания срезы фиксировали 4 % раствором ПФА в течение 10 мин, пермеабилизовали 1 % раствором Тритона Х-100 в течение 40 мин., неспецифическое связывание антител блокировали 2 % раствором бычьего сывороточного альбумина, дважды промывали натрий-фосфатным буфером и окрашивали антителами [18]. Для окрашивания препаратов кардиомиоцитов, культивируемых на пластике, и для криосрезов использовали антитела (рабочее разведение 1:100), выявляющие кардиальный тропонин Т ^TnT; Abcam, ab8295); саркомерный а-актинин (aSA; Abcam, ab9465); миозин MLC2 (Abcam, ab79935); транскрипционный фактор Nkx2.5 (Santa Cruz, sc-14033); HCN4 (Abcam, ab32675); HNA (Human nuclear antigen, Abcam, ab191181); aSMA (DAKO, M0851, Германия); SIRPa, конюгированные с PE (Biolegend, 323806).
Для визуализации сосудоподобных структур в матри-гельных трансплантатах связывание с клетками изолек-тина В4, конюгированного c Alexa 594 (Thermo Fisher Scientific, I21413), проводили в растворе 0,1 мМ CaCl2, при 4°C в течение 2 ч.
После выполнения ИФ-анализа ядра клеток докрашивали 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, Thermo Fisher Scientific). Результаты ИФ окрашивания анализировали с помощью инвертированного микроскопа Nikon Eclipse Ti-E, оснащенного камерой Nicon dS Qi1Mc и программным пакетом NIS (Nikon), или на конфокальном микроскопе LSM 780 NLO (Zeiss, Германия) на базе ЦКП «Центр микроскопического анализа биологических объектов СО РАН».
Статистический анализ
Статистическую обработку выполняли в программе RStudio версия 3.5.1 и Microsoft Excel. Данные представлены в виде значений среднего ± ошибка среднего. Для сравнения между группами использовали тест Вилкоксона с поправкой Бонферони. Отличия между группами считали достоверными при Р <0,05.
Результаты
Анализ кардиомиоцитов, полученных из ИПСК,
на маркеры кардиальной дифференцировки
Протокол дифференцировки ИПСК в кардиальном направлении заключался в ингибировании сигнального пути GSK-3ß для формирования мезодермальных предшественников и терминальной дифференцировки в кардиомиоциты при последующем ингибировании пути WNT. Появление сокращающихся клеток наблюдали на 8 сут. после добавления CHIR99021. После проведения метаболической селекции с использованием среды, содержащей лактат вместо глюкозы, количество кардиомиоцитов в популяции дифференцированных клеток по данным FACS-анализа (окрашивание антителами к SIRPa — CD172a, маркеру дифференцированных из ИПСК кардиомиоцитов [19]), составляло 98,6 % (рис. 1А). FACS-анализ популяции кардиомиоцитов (после метаболической селекции) антителами к HCN4 — белку, характерному для пейсмейкерных кардиомиоцитов, выявил 6 % позитивных клеток (рис. 1Б).
При исследовании популяции кардиомиоцитов методом ИФ-анализа с помощью антител к общему маркеру кардиомиоцитов кардиальному тропонину Т (cTnT) и транскрипционному фактору Nkx2.5 была показана их солокализация, характерная для сократительных (атриальных и вентрикулярных) кардиомиоцитов (рис. 2А). Наличие вентрикулярных кардиомиоцитов в популяции было подтверждено антителами к миозину MLC2 (рис. 2Б). Также в популяции кардиомиоцитов были обнаружены клетки, связывающие антитела к белку HCN4, характерному для пейсмейкеров. Поскольку известно, что дифференцировка в сократительные или пейсмей-керные кардиомиоциты определяется соответственно парой антагонистичных транскрипционных факторов Nkx2.5 и SHOX2, которые конкурируют за связывание с общими регуляторными сайтами ДНК [20-22], было показано, что кардиомиоциты HCN4+ являются отрицательными по маркеру Nkx2.5 (рис. 2В, Г, стрелки).
Электрофизиологические показатели кардиомиоци-тов регистрировали методом локальной фиксации потенциала. На 60-75 сут. после начала дифференциров-ки в популяции кардиомиоцитов были выявлены клетки с электрофизиологическим фенотипом атриальных, вен-трикулярных, а также пейсмейкерных кардиомиоцитов (рис. 3). Разделение кардиомиоцитов по фенотипам осуществляли на основании отношения длительности фазы реполяризации потенциала действия APD 50 % (от амплитуды потенциала действия) к длительности фазы восстановления диастолического потенциала — APD 90 %. Для сократительных типов кардиомиоцитов были характерны большие значения диастолического потенциала и более высокая протяжённость 2 и 3 фаз реполяриза-ции, в то время как для пейсмекерных клеток была характерна выраженная фаза медленной диастолической деполяризации, обусловленная потоком ионов калия через канал HCN4 — так называемый пейсмейкерный или «funny» ток (табл.).
Трансплантация кардиомиоцитов
человека в мышей линии SCID
Для экспериментов по трансплантации использовали кардиомиоциты, полученные из ИПСК человека на 20-24 сут. после начала дифференцировки. На ЭКГ, сделанных через 2 и 5 недель после трансплантации кардиомиоцитов, не было выявлено эктопической электрической активности миокарда у мышей, как в опытной, так и в контрольной группах. На окрашенных гематоксилином и эозином препаратах миокарда
экспериментальных животных (5 недель) в параинъек-ционной зоне среди структур миокарда на фоне дистрофически измененных кардиомиоцитов имелись базофильно окрашенные очаги замещения межволоконного пространства, образованные развивающейся соединительной тканью. На границе интактного миокарда и области инфильтрации инъецируемыми клетками был обнаружен участок с диффузно расположенными веретенообразными клетками, предположительно, незрелыми фибробластами. Признаки активного воспалительного процесса, как и прямые признаки неоангиоге-неза отсутствовали (рис. 4А). Анализ гистологических препаратов миокарда экспериментальных животных с помощью антител к SIRPa, которые специфично взаимодействуют с CD172a на мембране кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПСК [19], выявил их присутствие в параинъекционной зоне через 5 недель после трансплантации. Дополнительным подтверждением идентификации кардиомиоцитов из ИПСК человека в миокарде мыши являлась солокализация сигнала окрашивания антителами к SIRPa с антителами к ядерному человеческому антигену HNA (рис. 4Б, В).
Для оценки сохранения функциональной активности in vivo кардиомиоциты человека подкожно инъецировали 15 мышам в смеси RPMI-Matrigel, в результате чего образовывались матригельные трансплантаты. Спонтанное регулярное изменение свечения Fluo8 было обнаружено в каждом образце матригельных трансплантатов во всех экспериментальных точках, однако количество таких областей было представлено единичными случаями. В контрольных in vitro матригельных сгустках кардиоми-оциты, демонстрирующие изменение потоков кальция, выявлялись по всему образцу. Тем не менее, графики изменения интенсивности свечения Fluo8 от времени для опытных и контрольных образцов оказались похожими по своей форме, высоте и частоте пиков, что свидетельствует о сходной динамике изменения потоков ионов кальция в кардиомиоцитах, культивируемых на пластике, в составе матригельных сгустков in vitro и матригельных трансплантатов in vivo (рис. 5).
ИФ-анализ гистологических препаратов матригель-ных трансплантатов с помощью антител к саркомер-ному а-актинину (aSA), транскрипционному фактору сократительных кардиомиоцитов (Nkx2.5), человеческому ядерному антигену (HNA) на 28 сут. эксперимента показал, что ядра клеток, окрашенных антителами к aSA, связывают антитела к №х2.5 фактору (рис. 6А-В) и человеческому ядерному антигену HNA (рис. 6Г-Е). Таким образом, можно утверждать, что в течение 28 сут. в подкожных матригельных трансплантатах сохраняются aSA+/Nkx2.5+ кардиомиоциты человека. Также о наличии кардиомиоцитов человека в матригельном трансплантате свидетельствует тот факт, что ядра клеток, позитивных на антитела к SIRPa, окрашиваются антителами к HNA (рис. 6Ж). Поскольку для трансплантации была использована чистая популяция кардиомиоцитов (98,6 %), в которой присутствовало порядка 6 % HCN4+-кардиомиоцитов (для которых показано, что они являются Nkx2.5-), мы предполагаем, что единичные клетки HNA+/Nkx2.5-, отмеченные стрелками на рис. 6Е, могут быть пейсмейкерами. Кроме того, на препаратах присутствуют клетки, негативные по маркерам кардиомиоцитов и человеческому ядерному антигену HNA (ядра, рис. 6), которые мигрировали из организма мыши. По литературным данным в матригельных трансплантатах обнаруживаются эн-дотелиоциты, перициты, фибробласты и CD45+ клетки животного-хозяина [23, 24].
Рис. 1. Характеристика популяции кардиомиоцитов после метаболической селекции, 21 сут.: А — антитела, меченные РЕ, к маркеру дифференцированных из ИПСК человека кардиомиоцитов SIRPa; Б — антитела к белку HCN4, характерному для пейсмейкерных кардиомиоцитов. Проточная цитофлуориметрия
Рис. 2. Анализ популяции кардиомиоцитов на маркеры кардиомиоцитарной дифференцировки: А — антитела к транскрипционному фактору Nkx2.5 (зеленый), кардиальному тропонину сТпТ (красный); Б — антитела к маркеру вентрикулярных кардиомиоцитов MLC2 (зеленый), сТпТ (красный); В, Г — антитела к белку HCN4 (красный), Nkx2.5 (зеленый), пейсмейкерный кардиомиоцит HCN4+/Nkx2.5-, стрелка. Иммунофлуоресцентный анализ. Ядра клеток докрашены DAPI (синий); Масштабный отрезок: 50 мкм (А, Б), 100 мкм (В, Г)
Рис. 3. Электрофизиологическая характеристика популяции кардиомиоцитов. Форма потенциала действия кардиомиоцитов: А — вентрикулярных, Б — атриальных, В — пейсмейкерных. Метод локальной фиксации потенциала
Таблица. Электрофизиологические показатели отдельных кардиомиоцитов, измеренных методом локальной фиксации потенциала
Тип кардиомиоцита Число клеток Пиковое значение овершута Максимальный диастолический потенциал APD90/APD50
атриальный 4 38mV -58mV 1,9
пейсмейкер 3 42mV -62mV 1,4
вентрикулярный 9 34mV -48mV 1,5
При инкубировании препаратов криосрезов матри-гельного трансплантата с изолектином В4, который широко используется для оценки ангиогенного теста in vivo и связывается с эндотелиоцитами, были обнаружены единичные позитивные структуры (рис. 6И, стрелки). aSMA позитивные клетки выявлялись в слое клеток «неоинтимы», которая формируется стромальными клетками мыши вокруг матригельного трансплантата, а также в стенках сосудов, находящихся в этом слое (рис. 6З).
Анализ выживаемости кардиомиоцитов при подкожной трансплантации показал, что количество кардиомио-цитов в матригельных трансплантатах на разных сроках эксперимента достоверно не различается. Аналогичные данные были получены для контрольных образцов. Однако была обнаружена достоверная разница (примерно 30 %) в количестве кардиомиоцитов между образцами контрольной и опытной групп (рис. 7), которую можно
объяснить методическими особенностями формирования матригельного трансплантата in vitro и in vivo.
Обсуждение
Создание протоколов перепрограммирования соматических клеток человека в плюрипотентные и получения кардиомиоцитов in vitro позволит в будущем проводить пациент специфическую заместительную клеточную терапию различной патологии сердца. Однако на сегодняшний день в области тканевой инженерии сердца существует множество проблем, связанных как с незрелостью кардиомиоцитов, так и с образованием функциональных контактов с кардиомиоцитами хозяина in vivo. При созревании кардиомиоцитов происходит формирование упорядоченного сократительного аппарата, структур саркоплазматического ретикулума, стабилизация процессов внутриклеточной осцилляции
Рис. 4. Кардиомиоциты человека, трансплантированные в миокард мышей линии БОЮ: А — гематоксилин и эозин; Б, В — антитела к человеческому ядерному антигену Н1\1А (зеленый) и маркеру кардиомиоцитов из ИПСК человека БИЗРа (красный). Ядра клеток докрашены йАР! (синий). Масштабный отрезок: 100 мкм
Рис. 5. Функциональная активность кардиомиоцитов: А — кардиомиоциты на культуральном пластике; В — кардиомиоциты в сгустке белков экстраклеточного матрикса Matrigel in vitro; В — кардиомиоциты в составе матригельных трансплантатов, 21 сут. Метод оптического картирование потоков ионов кальция: зависимость интенсивности сигнала Fluo8 от времени
ионов кальция, наработка зрелых изоформ ионных каналов, коннексинов, увеличение количества митохондрий, изменение метаболизма и т. д. Для функционального созревания кардиомиоцитов in vitro применяют различные подходы: активацию биохимических путей (VEGF, FGF, IGF, Akt), создание клеточно-инженерных пластов с использованием матриксов, проводят электрическую и магнитную стимуляцию, механическое растяжение
клеточных и ткане-инженерных пластов кардиомиоцитов и т. д. Результаты моделирования сердечной ткани из кардиомиоцитов in vitro очень убедительные и действительно свидетельствуют о возможности созревания функциональной ткани [7, 25-29]. Показано, что кардиомициты хорошо выживают в миокарде после трансплантации, особенно в составе пластов или ткане-инженерных конструкций [8, 9]. Однако остается много
A Nkx2.5 dapi б aSA dapi B Nkx2.5aSA dapi
Г Nkx2.5 dapi Д HNA e Nkx2.5 hna dapi
Ж siRPa-HNA-dapi 3 aSMA aSA dapi и isoB4aSA dapi
Рис. 6. Кардиомиоциты в трансплантатах (Matrigel): А — антитела к Nkx2.5; Б — антитела к саркомерному а-актинину aSA; В — солокализация сигнала антител к Nkx2.5 и aSA; Г — антитела к Nkx2.5; Д — антитела к человеческому ядерному антигену HNA; Е — солокализация сигнала антител к Nkx2.5 и HNA, стрелки указывают на ядра HNA+/Nkx2.5-; Ж — совместная окраска антителами к HNA (зеленый) и маркеру кардиомиоцитов из ИПСК человека SIPRa (красный); З — совместная окраска антителами к aSA (зеленый) и aSMA (красный), стрелки указывают на сосуды; И — совместная окраска антителами к aSA (зеленый) и изолектину isoB4 (красный), стрелки указывают на капилляроподобные структуры. Ядра клеток докрашены DAPI (синий). Масштабная линейка 100 мкм
вопросов относительно функциональной активности трансплантированных кардиомиоцитов на клеточном и молекулярном уровнях, поскольку основными методами оценки результатов функциональной интеграции трансплантата в миокард являются УЗИ или МРТ исследования [8, 9, 29-31].
В данной работе мы изучали такие важные аспекты тканевой инженерии как выживаемость и сохранение
функциональных свойств кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПСК человека, при трансплантации. Ранее нами было показано, что мезинхимальные кардиальные клетки при интрамиокардиальной трансплантации и эндотелиальные и муральные клетки в ма-тригельном трансплантате элиминируются из организма реципиента в течение 2 недель [18, 24, 32-35]. В настоящем исследовании кардиомиоциты человека
выявлялись в миокарде мышей линии SCID через 5 недель после трансплантации, однако их присутствие не отражалось на электрокардиограмме экспериментальных животных. При анализе гистологических препаратов было обнаружено, что кардиомиоциты человека окружены фиброзными клетками и физически не контактируют с миокардом реципиента, следовательно, они не могут индуцировать эктопическую электрическую активность даже при условии сохранения у них способности к спонтанному генерированию потенциала действия. Для изучения in vivo состояния карди-омиоцитов, дифференцированных из ИПСК человека, мы предложили подход, который широко используется в тесте на ангиогенный потенциал клеток in vivo — формирование подкожного матригельного трансплантата. Мы оценивали количество кардиомиоцитов на разных сроках эксперимента гистологическими методами и их функциональные свойства с помощью кальций-зависимого красителя Fluo8. При подкожном введении в составе матригельного трансплантата кардиомиоци-ты выживали как минимум 4 недели, и их количество достоверно не менялось, что хорошо согласуется с литературными данными по выживаемости кардиомиоцитов, полученных из ИПСК, в миокарде [7, 25-29]. Однако, несмотря на хорошую выживаемость кардио-миоцитов в матригельных трансплантатах in vivo, при оптическом картировании выявлялось незначительное количество областей, способных к спонтанной осцилляции ионов кальция. Это может быть связано как с техническими особенностями эксперимента (объемный образец для оптического картирования, недостаточная интенсивность сигнала), так и с персистенцией карди-омиоцитов in vivo, где они находились под влиянием электромагнитного поля организма и могли потерять способность к спонтанной осцилляции ионов кальция. Можно предположить, что способность к автоматическому генерированию потенциала действия сохраняется только у пейсмейкеров, у которых есть определенный набор мембранных каналов для поддержания автоматического возбуждения клетки как in vitro, так in vivo.
Поскольку модель подкожного матригельного трансплантата широко используют для анализа ангиогенеза
250
i
CD CP
m CD
с
о
200
150
100
50
2
7
Число суток с момента трансплантации клеток
21 28 I Эксперимент
Рис. 7. Количество кардиомиоцитов в сгустках белков экстраклеточного матрикса Matrigel (in vitro, контроль] и матригельных трансплантатах (in vivo, опыт], позитивных на саркомерный а актинин (aSA), на разных сроках культивирования
in vivo [24], мы оценили васкуляризацию матригельно-го трансплантата и обнаружили, что капиллярная сеть внутри его формируется незначительно. Вероятно, для получения васкуляризированного трансплантата карди-омиоцитов следует дополнительно использовать клетки, продуцирующие ангиогенные факторы, например, эндо-телиоциты или перициты [24].
Благодарности
Исследования выполнены с использованием оборудования ЦКП «Центр генетических ресурсов лабораторных животных» ФИЦ ИЦиГ СО РАН, поддержанного Минобрнауки России (Уникальный идентификатор проекта RFMEFI62117X0015)», ЦКП «Центр микроскопического анализа биологических объектов СО РАН»
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 16-15-10322.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Burridge P.W., Matsa E., Shukla P. et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat. Methods 2014; 11(8): 855-60.
2. Lian X., Zhang J., Azarin S.M. et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/ß-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 2013; 8(1): 162-75.
3. Agladze N.N., Halaidych O.V., Tsvelaya V.A. et al. Synchronization of excitable cardiac cultures of different origin. Biomater. Sci. 2017; 5: 1777-85.
4. Shadrin I.Y., Allen B.W., Qian Y. et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nat. Commun. 2017; 8(1): 1825-40.
5. Masuda S., Shimizu T. Three-dimensional cardiac tissue fabrication based on cell sheet technology. Adv. Drug Deliv. Rev. 2016; 96: 103-9.
6. Funakoshi S., Miki K., Takaki T. et al. Enhanced engraftment, proliferation, and therapeutic potential in heart using optimized human iPSC-derived cardiomyocytes. Sci. Rep. 2016; 6: 1-14.
7. Riegler J., Tiburcy M., Ebert A. et al. Human engineered heart muscles engraft and survive long term in a rodent myocardial infarction model. Circ. Res. 2015; 117(8): 720-30.
8. Matsuo T., Masumoto H., Tajima S. et al. Efficient long-term survival of cell grafts after myocardial infarction with thick viable cardiac tissue entirely from pluripotent stem cells. Sci. Rep. 2015; 5: 1-15
9. Chong J.J.H., Yang X., Don C.W. et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature 2014; 510(7504): 273-7.
10. Yaniv Y., Spurgeon H.A., Lyashkov A.E. et al. Crosstalk between mitochondrial and sarcoplasmic reticulum Ca2+ cycling modulates cardiac pacemaker cell automaticity. PLoS One 2012; 7(5): 1-13.
11. Zhang X.H., Wei H., Saric T. et al. Regionally diverse mitochondrial calcium signaling regulates spontaneous pacing in developing cardiomyocytes. Cell Calcium 2015; 57(5-6): 321-36.
12. Morad M., Zhang X. Mechanisms of spontaneous pacing: SA-nodal cells, neonatal cardiomyocytes, and human Stem cell derived cardiomyocytes. Can. J. Physiol. Pharmacol. 2017; 95(10): 1100-7.
13. Байрамова С.А., Стрельников А.Г., Романов А.Б. и др. Перспективы создания пейсмейкерной сердечной ткани с использованием современных генетических и тканеинженерных технологий. Гены и Клетки 2017; XII(2): 29-36.
14. Grigor'eva E.V., Malankhanova T.B., Surumbayeva A. et al. Generation and characterization of iPSCs from human embryonic dermal fibroblasts of a healthy donor from Siberian population. BioRxiv https://doi. org/10.1101/455535.
15. Слотвицкий М.М., Цвелая В.А., Фролова Ш.Р. и др. Исследование функциональности получаемых из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток кардиомиоцитов для моделирования сердечных аритмий при синдроме удлиненного интервала QT. Вавиловский журнал генетики и селекции 2018; 22(2): 187-95.
16. Gao E., Lei Y.H., Shang X. et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ. Res. 2010; 107(12): 1445-53.
17. Чепелева Е.В., Балашов В.А., Докучаева А.А. и др. Исследование биологической совместимости полилактидных нановолоконных ма-триксов, заселенных кардиальной клеточной культурой, в эксперименте на мини-свиньях. Гены и Клетки 2017; XII(4): 62-8.
18. Чепелева Е.В., Павлова С.В., Малахова А.А. и др. Терапия хронического кардиосклероза у крыс линии WAG культурами кардиоваску-лярных клеток, обогащенными стволовыми клетками сердца. Клеточные технологии в биологии и медицине 2015; 3: 56-65.
19. Dubois N.C., Craft A.M., Sharma P. et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 2011; 29(11): 1-13.
20. Ye W., Wang J., Song Y. et al. A common Shox2-Nkx2.5 antagonistic mechanism primes the pacemaking cell fate in the pulmonary vein myocardium and sinoatrial node. Development 2015; 142: 2521-32.
21. van Weerd J.H., Christoffels V.M. The formation and function of the cardiac conduction system. Dev. 2016; 143(2): 197-210.
22. Protze S.I., Liu J., Nussinovitch U. et al. Sinoatrial node cardiomyo-cytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nat. Biotechnol. 2016; 12: 1-16.
23. Kermani P., Rafii S., Hempstead B.L. et al. Neurotrophins promote revascularization by local recruitment of TrkB + endothelial cells and systemic mobilization of hematopoietic progenitors. The Journal of Clinical Investigation 2005; 115(3):653-63.
24. Zakharova I.S., Zhiven' M.K., Saaya S.B. et al. Endothelial and smooth muscle cells derived from human cardiac explants demonstrate angiogenic potential and suitable for design of cell-containing vascular grafts. J. Transl. Med. 2017; 15(1): 54-70.
25. Kolanowski T.J., Antos C.L., Guan K. Making human cardiomyocytes up to date: Derivation, maturation state and perspectives. International Journal of Cardiology 2017; 241: 379-86.
26. Duelen R., Sampaolesi M. Stem cell technology in cardiac regeneration: A Pluripotent Stem Cell Promise. EBioMedicine 2017; 16: 30-40.
27. Ronaldson-Bouchard K., Ma S.P., Yeager K. et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature 2018; 556: 239-43.
28. Eng G., Lee B.W., Protas L. et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat. Commun. 2016; 7: 1-10.
29. Li J., Minami I., Shiozaki M. et al. Human pluripotent stem cell-derived cardiac tissue-like constructs for repairing the infarcted myocardium. Stem Cell Reports 2017; 9(5): 1546-59.
30. Liu Y., Chen B., Yang X. et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nat. Biotechnol. 2018; 36(7): 597-605.
31. Chauveau S., Anyukhovsky E.P., Ben-Ari M. et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes provide in vivo biological pacemaker function. Circ. Arrhythmia Electrophysiol. 2017; 10: 1-10.
32. Павлова С.В., Перовский П.П., Чепелева Е.В. и др. Характеристика кардиальных культур клеток, полученных из экспланта сердечной мышцы человека. Клеточные технологии в биологии и медицине 2013; 3: 132-41.
33. Павлова С.В., Сергеевичев Д.С., Чепелева Е.В. и др. Сравнение мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и региональных стволовых клеток сердца и фибробластов кожи человека. Патология кровообращения и кардиохирургия 2015; 19(4-2): 12-9.
34. Павлова С.В., Розанова И.А., Чепелева Е.В. и др. Ангиогенный потенциал кардиальных стволовых и мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крысы. Патология кровообращения и кардиохирургия 2015; 19(4-2): 77-84.
35. Павлова С.В., Леонова Е.А., Чепелева Е.В. и др. Мониторинг трансплантации клеток кардиосфер в фибриновом геле в зону ишемиче-ского повреждения миокарда с использованием люциферазной репор-терной системы. Гены и Клетки 2017; XII(4): 69-75.
Поступила: 11.102018
