CC BY
87
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ... 3
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 615.2/.3.012
Е.И. Михаевич1’2, Н.П. Яворская1, И. С. Голубева1, О.Л. Орлова1,
А.П. Полозкова , С.А. Партолина1, Н.А. Оборотова1 ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ
СОЗДАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ЦИФЕТРЕЛИНА ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва 2Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, Москва
Контактная информация:
Михаевич Екатерина Игоревна, аспирант;
адрес: 125315, Москва, ул. Усиевича, 23, 261; тел. +7 (499)612-88-34, моб. +7(910)412-04-23 е-mail: mcldo@mail.ru
Статья поступила: 13.10.2011; подписана в печать: 18.01.2012
Резюме
В лаборатории химического синтеза НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН синтезирован новый аналог соматостатина, цифетрелин, обладающий противоопухолевой активностью на разных моделях опухолей in vivo, в том числе - при пероральном введении. В связи с этим представляется актуальным исследование возможности создания лекарственной формы цифетрелина для перорального применения.
В настоящем исследовании предложен состав таблетированной лекарственной формы цифетрелина, позволяющий получить таблетки, удовлетворяющие всем требованиям ГФ XI. Установлено, что цифетрелин в таблетках не уступает по противоопухолевой активности субстанции цифетрелина при пероральном введении. По результатам работы сделан вывод, что предложенные для создания лекарственной формы вспомогательные вещества не мешают высвобождению цифетрелина из таблеток и не снижают его противоопухолевую активность.
Ключевые слова: соматостатин, аналоги соматостатина, пероральное введение пептидов, цифетрелин.
Е.I. Mikhaevich1,2, N.P. Yavorskaya1,I.S. Golubeva1, A.P. Polozkova1,
S.A. Partolina1, N.A. Oborotova1 STUDYING THE POSSIBILITY OF ORAL DELIVERY OF CIFETRELIN
1FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
2I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow
Abstract
In the Institute of experimental diagnostics and chemotherapy of FSBI «N.N. Blokhin CRC» RAMS a novel somatostatin analogue - cifetrelin - was synthesized. Cifetrelin has demonstrated antitumor activity on different experimental tumor models in vivo, including when orally administered. Taking this into account it seems to be worthwhile to investigate the possibility of development of cifetrelin drug formulation for oral delivery.
We have offered a composition for cifetrelin drug formulation, that allows to obtain tablets that meet all State Pharmacopoeia XI requirements. It was determined that antitumor activity of cifetrelin in tablets is comparable with antitumor activity of cifetrelin substance when orally administered. It may be concluded that offered for cifetrelin oral drug formulation excipients do not reduce the cifetrelin release and antitumor activity.
Key words: somatostatin, somatostatin analogues, peptide oral delivery, cifetrelin.
Введение
В настоящее время пептиды и белки стали препаратами выбора для лечения многих заболеваний вследствие своей непревзойденной селективности и способности оказывать мощное воздействие на мишени [6]. В целом препараты пептидной и белковой природы имеют меньше побочных эффектов и способны излечивать причину заболевания, а не просто купировать его симптомы. Сегодня благодаря достижениям биотехнологии на коммерческой основе производится множество различных пептидных и белковых препаратов [6; 9; 11]. К лекарственным препаратам белково-пептидной природы относятся препараты
гормонов (Инсулин, Тетракозактид, Окситоцин, Со-матропин, Бусерелин, Октреотид и др.), иммуномодуляторы (интерферон бета-1а, интерлейкин-2 человеческий рекомбинантный), противоопухолевые средства (Ритуксимаб, Трастузумаб), стимуляторы гемо-поэза (Молграмостим), ноотропы (Семакс), регенерирующие препараты (Актовегин) и многие другие [3]. Разработка систем доставки пептидов и белков представляет собой значительную трудность вследствие их физико-химических свойств, к которым относятся большой размер молекул, неустойчивость к действию ферментов, короткое время полужизни в плазме крови, иммуногенность и склонность к агрегации, адсорбции и денатурации [8].
Вследствие этого до сегодняшнего дня наиболее распространенными для соединений белковопептидной природы являются лекарственные формы для парентерального введения. Большинство пептидных лекарственных препаратов благодаря хорошей растворимости в воде выпускаются в виде водных растворов (Сандостатин, Инсулин, Ганиреликс, Тимо-депрессин, Церебролизин) для внутривенного, подкожного или внутримышечного введения. Соединения, растворимые в воде, но нестойкие в водных растворах, выпускают в виде лиофилизатов [З] для приготовления растворов ex tempore (Бусерелин, Цетро-реликс, Молграмостим).
С различным успехом были опробованы следующие пути введения пептидных препаратов: перо-ральный, трансбуккальный, интраназальный, транс-дермальный и ректальный. Из указанных пероральный путь введения остается наиболее удобным для пациента и врача. Лекарственные формы для перорального введения имеют ряд преимуществ: безболезненность, отсутствие дискомфорта, отсутствие риска инфекционных поражений. Кроме того, производство перораль-ных лекарственных форм менее затратно, поскольку не требует стерильных условий. Помимо этого, накопленные данные позволяют говорить о том, что для некоторых полипептидов, таких как инсулин, пероральный путь введения является более физиологичным [7]. Однако вследствие упомянутых свойств пептидов и белков создание лекарственной формы для перорального применения весьма затруднительно. В виде таблеток выпускаются такие лекарственные препараты как Ак-товегин и Десмопрессин [З].
Одной из групп лекарственных препаратов белково-пептидной природы являются аналоги сомато-статина (Сандостатин, Соматулин). Доказана эффективность аналогов соматостатина при симптоматической терапии секретирующих эндокринных опухолей желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы (карциноиды, ВИПомы, глюкагономы, гастрино-мы, инсулиномы) и нейроэндокринных опухолей [2; 12]. В последние годы начато изучение возможности применения этой группы препаратов для лечения других видов опухолей [5; 1O]. Однако и в данном случае пока не удалось решить проблему создания лекарственных форм для перорального применения.
В лаборатории химического синтеза НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН был синтезирован новый аналог соматостатина - цифетре-лин. Цифетрелин в отличие от других аналогов сома-тостатина не является циклическим пептидом. Все реакционно способные боковые группы в его молекуле защищены третбутилоксикарбонильной, бензилок-сикарбонильной и тетрагидропиральной группами, благодаря чему цифетрелин частично сохраняется в кислой среде желудка [4], что позволяет рассматривать возможность создания лекарственной формы для перорального применения.
Цели настоящей работы:
m разработка модели лекарственной формы цифетрелина для перорального применения;
m оценка качества ЛФ в соответствии с требованиями ГФ XI;
m оценка эффективности in vivo в сравнении с субстанцией цифетрелина.
Материалы и методы
Цифетрелин синтезирован в необходимом для проведения химико-фармацевтических, технологических и биологических исследований количестве в ла-
боратории химического синтеза НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН под руководством Смирновой Л.И. Субстанция цифетрелина была охарактеризована в соответствии с проектом ФСП, в используемой серии субстанции цифетрелина количественное содержание цифетрелина составляло не менее 96,8 %.
Таблетки цифетрелина получали с применением влажного гранулирования. В качестве гранулирующей жидкости использовали 5 %-ный крахмальный клейстер, поскольку цифетрелин нерастворим в воде. Смесь субстанции цифетрелина и вспомогательных веществ (лактоза, крахмал, целлюлоза микрокристаллическая, аэросил, ПВП в разных соотношениях) увлажняли в ступке гранулирующей жидкостью до получения тестообразной массы, которую протирали через сито с диаметром пор 1,5 мм. Гранулят высушивали на воздухе в течение 24 ч, снова протирали через сито с диаметром пор 1,5 мм, а затем опудривали смесью из 30 %-ного талька, 10 %-ного стеарата магния и 60 %-ного крахмала. Масса опудривающей смеси составляла 10 % от массы таблетки. Тщательно перемешивали и таблетировали на лабораторном таблеточном прессе фирмы «Erweka» (Германия). Масса таблетки составляла около 0,1 г.
Оценку качества полученных таблеток проводили в соответствии с требованиями ГФ XI [1].
1. При оценке внешнего вида таблеток обращали внимание на следующие параметры: края таблетки (ровные, со сколами), наличие/отсутствие расслаивания, качество поверхности (наличие мраморности, глянцевая или матовая поверхность).
2. Среднюю массу таблеток и массу отдельных таблеток определяли по стандартной методике, приведенной в ГФ XI [1].
3. Оценка прочности таблеток на истирание проводили на фриабилляторе типа TAR10 фирмы «Erweka» (Германия) по стандартной методике, приведенной в ГФ XI [1].
4. Тест на радиальное сжатие проводили на приборе ТВТ, фирмы «Erweka» (Германия). Таблетку помещали в специальную вставку на наковальне, регулируемой по высоте, и подводили к конусовидному поршню, оказывающему давление на таблетку до ее разрушения. По шкале прибора фиксировали величину давления, вызвавшего разрушение таблетки.
5. Оценку распадаемости таблеток проводили с помощью прибора «качающаяся корзинка» серии ZT300, фирмы «Erweka» (Германия) по стандартной методике ГФ XI [1].
6. Тест растворение для таблеток цифетрели-на проводили по стандартной методике, описанной в ГФ XI [1], количество цифет-релина, перешедшего в раствор определяли методом спектрофотометрии.
7. Определение подлинности и количественное определение цифетрелина в таблетках также проводили с помощью спектрофото-метрии (методики разработаны в лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН).
Во всех трех тестах в качестве растворителя использовали 95 %-ный этиловый спирт. Раствор рабочего стандартного образца (РСО) готовили путем растворения точной навески субстанции цифетрелина в растворителе.
В качестве раствора сравнения использовали раствор вспомогательных веществ, входящих в состав таблеток, в 95 %-ном этиловом спирте.
Оптическую плотность раствора таблеток цифетрелина и РСО измеряли в диапазоне X от 350 нм до 220 нм в кювете толщиной 10 мм относительно раствора сравнения. Электронный спектр поглощения цифетрелина имеет выраженный максимум поглощения при X 282 нм. Качественное и количественное определение цифетрелина проводили по данному максимуму поглощения.
Животные были получены из питомника ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, содержались в одинаковых условиях вивария с брикетированным режимом кормления. В опытах использованы мыши-самки массой 18-21 г в возрасте 1,5-2 мес. Количество животных в контрольных группах составляло 10 мышей, в опытных - 7-8. Контролем являлись нелеченные животные.
Работа проведена на экспериментальной перевиваемой солидной опухоли РШМ-5. Штамм опухолевых клеток был получен в Банке криокон-сервированных биоматериалов ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Опухоль перевивали половозрелым мышам-самкам линии СВА2, инокуляцию проводили подкожно в правую подмышечную область мыши, каждой по 50 мг опухолевой взвеси в среде 199 в разведении 1 : 10 (5 х 5106 клеток).
Критерием эффективности цифетрелина являлось ТРО, которое вычисляли по формуле:
V - V
TPO,% = kv 0 X100, где
V и V0 - средний объем опухолей (мм3) в контрольной и опытной группах соответственно. Объем опухоли определяли как произведение трех перпендикулярных измерений опухолевого узла.
Введение препарата животным начинали через 48 ч после перевивки опухолей. Субстанцию и таблетки цифетрелина вводили перорально с помощью зонда в 1 %-ном крахмальном клейстере в различных режимах. Измерения объема опухолей проводили на 7; 11; 14; 18; 22 и 25 дни после перевивки опухоли. Эффективными считали дозы препарата, вызывающие ТРО 50 % и более.
О токсичности препарата судили по числу павших животных до начала гибели животных в контрольной группе, макроскопической картине внутренних органов при вскрытии, а также по снижению массы тела более 20 %.
Статистическую обработку полученных данных проводили по методу Фишера-Стьюдента. Различия сравниваемых величин считали достоверными при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Для обеспечения возможности индивидуального подбора режима дозирования в зависимости от чувствительности опухоли и восприимчивости пациента к действию препарата в таблетки цифет-релина была заложена доза 6 мг.
Разработка состава модели таблеток цифетрелина и оценка их качества
Свойства субстанции цифетрелина исключают возможность прямого прессования, поэтому нами выбран метод таблетирования с предшествующим влажным гранулированием.
Поскольку цифетрелин нерастворим в воде, в качестве гранулирующей жидкости предложена
вода, а в качестве гранулирующего агента - картофельный крахмал, Для гранулирования использовали 5 %-ный крахмальный клейстер.
В качестве наполнителей (вспомогательных веществ) использовали лактозу (хорошо смешивается с субстанцией цифетрелина и обеспечивает необходимый объем таблетки), крахмал и целлюлозу микрокристаллическую.
Кроме того, крахмал обладает свойствами разрыхлителя (в водной среде набухает, обеспечивая дезинтеграцию таблетки), а целлюлоза микрокристаллическая увеличивает механическую прочность таблетки и улучшает сыпучесть гранулята.
В некоторые составы в качестве связывающего агента введен ПВП, а также аэросил, выполняющий функции разрыхлителя. Для исключения залипаемости на прессующий инструмент в состав таблеток введена опудривающая смесь, состоящая из талька, магния стеарата и крахмала в соотношении З : 1 : 6. В табл. 1 представлены результаты предварительной оценки качества модельных смесей для таблетирования цифетрелина.
По результатам оценки таблеток, полученных из пяти модельных смесей, отобран состав № 4 как обладающий оптимальными технологическими характеристиками. В соответствии с выбранным составом была проведена наработка таблеток ци-фетрелина для дальнейшего изучения.
Основные критерии качества таблеток ци-фетрелина были выбраны на основании требований ГФ XI [1]. Результаты оценки качества модельных таблеток цифетрелина приведены в табл. 2.
При оценке подлинности таблеток цифетре-лина раствор лекарственной формы цифетрелина в 95 %-ном этиловом спирте имел выраженный максимум поглощения (как и РСО) при X 282 нм (см. рис.). Предварительно установлено, что зависимость оптического поглощения раствора цифетре-лина в 95 %-ном этиловом спирте от концентрации подчиняется закону Бугера - Ламберта - Бера. При проведении количественного определения содержания цифетрелина в наработанной серии таблеток установлено, что среднее содержание цифетрелина составляет G,GG58 г.
По результатам оценки качества модельных таблеток цифетрелина был сделан вывод, что предложенный состав лекарственной формы обеспечивает соответствие показателей качества лекарственной формы требованиям ГФ XI. Таблетки цифетрелина наработанной серии были использованы в исследовании противоопухолевой активности in vivo.
Исследование противоопухолевой активности таблеток цифетрелина.
При сравнении противоопухолевого действия цифетрелина в субстанции и таблетках при пе-роральном введении в изученных режимах в дозе 1G мг/кг и 1 мг/кг установлено, что по показателю ТРО эффективность модели лекарственной формы цифетрелина не уступала таковой субстанции (табл. 3). Во всех группах животные начинали гибнуть позже, чем в контрольной группе, ни в одной из групп животных не наблюдалось изменения макроскопической картины внутренних органов или снижения массы тела более чем на 2G %. Вывод: цифетрелин нетоксичен.
Полученные результаты свидетельствуют, что использованные при получении таблеток ци-фетрелина вспомогательные вещества не снижают его биодоступность и противоопухолевый эффект при пероральном введении.
Wavelength (nm)
Wavelength (nm)
Рис. Спектры поглощения раствора таблеток цифетрелина
А: в 95 %-ном спирте этиловом;
Б: РСО цифетрелина относительно раствора сравнения в УФ-области
Таблица 1
Модельные смеси для таблетирования цифетрелина
№ Модельные смеси для таблетирования (в расчете на 1 таблетку) Результат
1 Цифетрелина - 0,006 г Лактозы - 0,055 г Целлюлозы микрокристаллической - 0,010 г Крахмала - 0,025 г Опудривающей смеси - 0,010 г Таблетируемая смесь прессуется, поверхность таблеток без сколов, глянцевая. Распадаемость 11-13 мин, прочность на радиальное сжатие 1,6 МПа.
2 Цифетрелина - 0,006 г Лактозы - 0,050 г Целлюлозы микрокристаллической - 0,010 г Крахмала - 0,025 г Поливинилпирролидона - 0,005 г Опудривающей смеси - 0,010 г Таблетируемая смесь прессуется, таблетки не расслаиваются, без сколов. Распадаемость 12-13 мин, прочность на радиальное сжатие - 1,0 МПа.
3 Цифетрелина - 0,006 г Лактозы - 0,055 г Целлюлозы микрокристаллической - 0,010 г Крахмала - 0,020 г Поливинилпирролидона - 0,005 г Опудривающей смеси - 0,010 г Таблетируемая смесь прессуется, таблетки хорошего качества, не расслаиваются, края некоторых таблеток имеют небольшие сколы. Распадаемость 3-4 мин, прочность на радиальное сжатие - 0,63 МПа.
4 Цифетрелина - 0,006 г Лактозы - 0,055 г Целлюлозы микрокристаллической - 0,005 г Крахмала - 0,025 г Поливинилпирролидона - 0,005 г Опудривающей смеси - 0,010 г Таблетируемая смесь прессуется, таблетки хорошего качества, поверхность глянцевая, края ровные, без сколов. Распадаемость 7-9 мин, прочность на радиальное сжатие 0,88 МПа.
5 Цифетрелина - 0,006 г Лактозы - 0,050 г Целлюлозы микрокристаллической - 0,010 г Крахмала - 0,020 г Поливинилпирролидона - 0,005 г Аэросила - 0,005 г Опудривающей смеси - 0,010 г Таблетируемая смесь прессуется, таблетки хорошего качества, не расслаиваются, поверхность таблеток приобрела мраморность. Распадаемость 9-11 мин, прочность на радиальное сжатие 0,63 МПа.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ...
Таблица 2
Показатели качества таблеток ци< а д и л о а н о
Показатель Требования ГФ XI Результаты оценки модельных таблеток цифетрелина
Описание (внешний вид) - Круглые таблетки белого цвета с глянцевой поверхностью, двояковыпуклые, с ровными, без сколов краями, без запаха
Средняя масса таблетки 0,925 - 0, 1075 г 0,1059
Отклонение в средней массе ±7,5% ± 5,5
Однородность дозирования ±15%, ни в одной таблетке более ±25%. от -7 до +9.
Распадаемость не более 15 минут для таблеток без оболочки не более 9 минут
Прочность на истирание не менее 97 % 99 %
Растворение не менее 75 % за 45 мин. в воде не менее 96 % за 45 мин в 95 %-ном спирте этиловом
Количественное содержание лекарственного вещества в таблетке 5,4 - 6,6 мг 5,8 мг
Таблица 3
Противоопухолевое действие субстанции и таблеток цифетрелина на модели опухоли РШМ-5 при пероральном введении в различных режимах___________________________________________________________________________
Ь О £ Режим дозирования Таблетки/ субстанция % ТРО, дни после перевивки опухоли
7 11 14 18 22 25
10 5 дней с интервалом 24 ч, 1 курс Субстанция 90* 80* 76* 75* 67* 54
Таблетки 84* 82* 87* 74* 60* 56
5 дней с интервалом 24 ч, 2 курса с интервалом 7 дней Субстанция 77* 82* 88* 91* 79* 78*
Таблетки 70* 76* 73* 50 63* 59*
1 раз в неделю в течение 3 недель Субстанция 79* 74* 56 62* 66* -
Таблетки 88* 92* 82* 67* 69* 70*
1 5 дней с интервалом 24 ч, 2 курса с интервалом 7 дней Субстанция 70* 61* 69* 79* 68* 53
Таблетки 80* 89* 78* 69* 73* 69*
10 дней с интервалом 24 ч, 1 курс Субстанция 59* 69* 51 63* 58* 55
Таблетки 67* 85* 70* 57* 57* 64*
*достоверно к контролю при р < 0,05; «-» - нет данных.
Заключение
Полученные данные показывают возможность создания лекарственной формы цифетрелина в таблетках для перорального введения:
■ предложенный состав вспомогательных веществ для таблетирования цифетрелина позволяет получить таблетки, качество которых соответствует требованиям ГФ XI;
■ выбранные вспомогательные вещества, входящие в состав таблеток, не мешают высвобождению цифетрелина из ЛФ;
по противоопухолевой активности таблетки цифетрелина не уступают субстанции цифетрелина при пероральном введении.
Авторы благодарят сотрудников лаборатории химического синтеза и лаборатории химикофармацевтического анализа НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН за предоставление цифетрелина, ценные консультации и помощь в выполнении настоящей работы.
1.
2.
3.
10.
11.
12.
Литература
Государственная фармакопея. - XI, Вып. 2. - М.: Медицина, 1998. - 154 с.
Егоров А.В., Кондрашин С.А., Фоминых Е.В. и др. Аналоги соматостатина в диагностике и лечении нейроэндокринных опухолей.// Анналы хирургической гепатологии. - 2009. - Т. 14, № 4. - С. 1-7.
Регистр лекарственных средств России РЛС [Электронный ресурс]/Энциклопедия лекарств и товаров аптечного ассортимента. - Электрон. данн. - М.: Справочно-информационный портал RLSNETRU, 2011. - Режим доступа: http://www.rlsnet.ru/, свободный. - Загл. с экрана. - Яз. рус.
Смирнова Л.И., Устинкина С.В., СмирноваА.П. и др. Средство, обладающее противоопухолевым действием. Патент № 2254139 РФ De Herder W. W., Lamberts S. W. Somatostatin and somatostatin analogues: diagnostic and therapeutic uses // Current Opinion in oncology. - 2002. - 14(1). - P. 53-7.
Frokjaer S. and Otzen D.D. Protein drug stability: a formulation challenge // Nat. Rev. Drug Discov. - 2005. - 4. - P. 298-306. Hoffman A., Ziv E. Pharmacokinetic considerations of new insulin formulations and routes of administration // Clinical pharmacokinetics. - 1997. - 33(4). - P. 285-301.
Jorgensen L., Hostrup S., Moeller E.H., Grohganz H. Recent trends in stabilising peptides and proteins in pharmaceutical formulation - considerations in the choice of excipients // Expert opinion in drug delivery. - 2009. - 6(11). - P. 1219-30.
Rakhi B. Shah, Fakhrul Ahsan, Mansoor A. Khan. Oral delivery of proteins: Progress and prognostication // Critical reviews in therapeutical drug carrier Systems. - 2002. - 19(2). - P.135-69.
Susini C, BuscailL Rationale for the use of somatostatin analogs as antitumour agents//Annals of Oncology. - 2006. - 17(12). - P. 1733-42. Torchilin V.P. Peptide and protein drug delivery to and into tumors: challenges and solutions/ZDrug, discovery today. -2003. - 8(6). - P. 259-66. Weckbecker G., Lewis I., Albert R. et. al. Opportunities in somatostatin research: biological, chemical and therapeutic aspects // Nature Rev. Drug Discovery. - 2003. - 2. - P. 999-1017.
8
9
