CC BY
65
УДК 661.727.24
М. И. Маллябаева (к.х.н., доц.)1, Г. Г. Ягафарова (д.т.н., проф., зав. каф.)1, Т. В. Тюмкина (к.х.н., с.н.с)2 , С. В. Балакирева (к.т.н., доц.) 1, Э. М. Зайнутдинова (к.б.н., доц.) 1
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ МЕТАЛЬДЕГИДА НА БИОЦЕНОЗ ПОЧВЫ И МЕХАНИЗМ ЕГО БИОТРАНСФОРМАЦИИ
1 Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра «Прикладная экология» 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347)2431737, e-mail: ecologial@rambler.ru, mmallyabaeva@yandex.ru
2 Институт нефтехимии и катализа РАН 450075, г. Уфа, пр. Октября, 141; тел. (374)2431737, e-mail: ttvnmr@gmail.com
M. I. Mallyabaeva1, G. G. Yagafarova1, T. V. Tyumkina2, S. V. Balakireva1, E. M. Zainutdinova1
RESEARCH OF METALDEHYDE INFLUENCE ON THE SOIL BIOCENOSIS AND HIS BIOTRANSFORMATION MECHANISM
1 Ufa State Petroleum Technological University
1, Kosmonavtov Str.,450062, Ufa, Russia; ph.(347)2431737, e-mail: ecologia1@rambler.ru, mmallyabaeva@yandex.ru
2 Institute of Petrochemical and Catalysis RAS
141, Oktyabrya Pr, 450075, Ufa, Russia; ph.(347)(347)2431737, e-mail: ttvnmr@gmail.com
Представлены результаты исследования влияния метальдегида на организмы почвы в условиях производственных концентраций (ПК: 1, 10 и 100ПК) и проявление экологических факторов при нарушении правил использования пестицида. Установлено, что угнетение почвенных организмов происходит при концентрации пестицида 100ПК. Исследовалось влияние пестицида на дождевых червей (Lumbricus-terrestris L). Выявлено, что 100ПК приводит к их гибели. Изучался механизм биодеструкции данного пестицида. В качестве микроорганизмов деструкторов использованы культуры: Pseudomonas fluorescens IBRB-34DCP; Bacillus cereus IBRB-33T; Rhodococcus erythropolis BKMAC-1339D; Bacillus subtilis 16N27.13LB. Выявлено, что наибольшей деструктивной активностью обладают микроорганизмы Bacillus cereus IBRB-33T и Bacillus subtilis 16N27.13LB. Установлено, что промежуточным соединением биотрансформации является ацетальдегид.
Ключевые слова: ацетальдегид; биотрансформация; деструкторы; дождевые черви; ме-тальдегид; микроорганизмы почвы; пестицид; почва; экологическая безопасность.
Presents the results of a study of the effect of metaldehyde on the organisms of the soil in terms of production concentration (PC: 1, 10, and 100) and the manifestation of ecological factors at violating of use of the pesticide. It is established that the oppression of soil organisms occurs at the pesticide concentrations 100PC. The pesticide effect on earthworms (Lumbricusterrestris L.) was researched. It was revealed that 100PC led to their death. This pesticide biodestruction mechanism was studied. As microorganisms of destructors cultures were used: Pseudomonas fluorescens IBRB-34DCP; Bacillus cereus IBRB-33T; Rhodococcus erythropolis BKM AC-1339D; Bacillus subtilis 16N27.13LB. It was revealed that microorganisms Bacillus cereus IBRB-33T and Bacillus subtilis 16N27.13LB had the greatest destructive activity. It was established that biotransformation intermediate is acetaldehyde.
Key words: acetaldehyde; biotransformation; destructors; earthworms; ecological safety; metaldehyde; soil microorganisms; soil pesticide.
Дата поступления 02.08.16
Экосистема почвы характеризуется динамическим взаимодействием ее составляющих (минеральные частицы, детрит, редуценты, детритофаги), она способна к саморегуляции — поддержанию определенной стабильности своего состава в результате устойчивого круговорота веществ и энергии. Устойчивость экосистемы почвы напрямую связана с состоянием ее микробиоты, с богатством видового состава, многообразием их взаимодействия и средообразующими свойствами.
Антропогенное воздействие на почву проявляется по-разному. Постоянная обработка ядохимикатами может привести к угнетению почвенной микробиоты, вызвать ее гибель и потерю почвой полезных свойств (естественное плодородие) 1 2.
Попадая в почву, пестициды подвергаются деградации под влиянием различных факторов. Вклад микроорганизмов в процесс трансформации и деградации составляет до 70%, именно поэтому на сегодняшний день особый интерес исследователей вызывает процесс биотрансформации пестицида с использованием различных микроорганизмов 3' 4.
Метальдегид — циклический тример аце-тальдегида, он относится к 3 классу опасности для человека, его ЛД50 для крыс составляет 283 мг/кг, для мышей — 425 мг/кг.
Целью работы являлось изучение влияния пестицида «Гроза», действующим веществом которого является метальдегид, на почвенную биоту и механизма его биотрансформации.
Изучение воздействия проводилось с учетом экологических факторов в модельных условиях, создающих несоблюдение установленных агротехнических приемов: внесения доз (многократное повышение); нарушение способа хранения пестицида с разрушением гранул (увеличение рабочей поверхности активного вещества).
Материалы и методы исследования
Материалом для экспериментов был использован чернозем, взятый в поселке Ново-Михайловка РБ. Отбор проб осуществляли согласно ГОСТ 17.44.02-84.
Производителем препарата заявлена производственная концентрация 30—40 г на 10 м2 или 3—4 г на 1 м2 (в работе рассматривали усредненное значение 3.5 г на 1м2).
Экспериментальная работа была связана с тремя направлениями: первое — изучение воздействия препарата на дождевых червей с учетом экологических факторов биотического и
антропогенного характеров, второе — действие на микроорганизмы почвы; третье — возможность утилизации действующего вещества препарата (метальдегида) методом биодеструкции.
В работе проводились эксперименты по воздействию препарата на дождевых червей с учетом их поведения, моделировалось условие контакта дождевых червей с препаратом в соответствии с методикой 6. В емкости с опытными образцами почвы (1 кг) вносили пестицид в виде порошка из расчета производственной концентрации: ПК (0.035 г), 10ПК (0.35 г), 100ПК (3.5 г) и контроль (без пестицида), перемешивали, увлажняли водой (60%), вносили по 10 особей половозрелых дождевых червей (Lumbri-custerrestris L.) из маточной популяции.
Контрольные и опытные инкубационные сосуды на протяжении всего опыта находились в одинаковом режиме температуры (20—25 °С) и увлажнения (60%).
Определение динамики численности почвенных червей проводили на 6-е и 12-е сутки визуально 5, результаты представлены в табл. 1.
Влияние исследуемого пестицида на почвенную микробиоту проводили следующем образом. Сначала методом микробиологического анализа на МПА (мясо-пептонном агаре) определили состав почвенных микроорганизмов. Анализ проводили чашечным методом Коха по известной методике 6 7. На начальном этапе оценивался качественный и количественный состав исследуемой почвы. Из табл. 2 видно, что чернозем богат микрофлорой: грамот-рицательными бактериями (Pseudomonas sp.), спорообразующими (Bacillus sp. ), автохтонными (Arthrobacter sp.), микромицетами (Fusarium и Penicillium).
Далее выполнили исследования по выделенным микроорганизмам. Микроорганизмы из инкубационных сосудов были направлены на изучение их численности при внесении различных доз пестицида. Посев взвесей исследуемых культур проводили методом отпечатков или уколом на поверхность питательной среды, содержащей (ПК, 10ПК, 100ПК) и не содержащий (контроль) пестицид. Чашки с посевами культивировали в термостате при температуре 28 оС в течение 2—5 сут. После инкубации учитывали диаметр выросших колоний и сравнивали их с ростом аналогичных культур в контроле и опыте. Отбор штаммов, использующих пестицид как единственный источник углерода, проводили на минеральной синтетической среде Маккланга, содержащей в объеме 100 мл следующие компоненты: NaNO3 — 0.2 г, KH2PO4 - 0.1 г, MgSO4 -7H2O - 0.05 г,
MnSO4 и ZnSO4 — в следовых количествах, с добавлением в качестве единственного источника углерода и энергии метальдегида в дозах ПК, 10ПК и 100ПК. Результаты представлены в табл. 2.
Современные экологические требования, принятые во всем мире, направлены на восстановление природных свойств почв и очистку их от пестицидов с помощью безопасных методов. Утративший производственные качества пестицид «Гроза» сегодня утилизируется в основном термическими методами. Одним из перспективных экологических направлений является утилизация методом биодеструкции.
Осуществлен поиск микроорганизмов деструкторов пестицида, содержащего активное вещество метальдегид. В качестве микроорганизмов деструкторов были использованы штаммы музея Уфимского государственного нефтяного технического университета кафедры «Прикладная экология»: Pseudomonas fluorescens IBRB-34DCP1; Bacillus cereus IBRB-33T2; Rhodococcus erythropolis BKMAC-1339D3; Bacillus subtilis 16N27. 13LB4. Для этого в полную минеральную среду в качестве единственного источника углерода и энергии добавляли 0.1 г метальдегида на 100 мл питательной среды. Инокулят добавляли из жидкой среды из расчета 3% объемных. Культивирование проводили на термостатической качалке при температуре 25 оС в течение 3 сут 5. О биодеструкции судили по результатам тонкослойной храматографии (ТСХ), а также *Н и C ЯМР спектроскопии. Спектры ЯМР *Н, 13С, HSQC, HMBC получены на спектрометре Bruker AVANCE-400, рабочая частота 400.13 МГц (*Н) и 100.63 МГц (13С) на широкополосном инверсном датчике (BBI). В качестве стандарта ЯМР 1Н, 13С использовали CDCl3. Образцы готовили в стандартной ампуле диаметром 5 мм. Количество точек в одномерной спектроскопии ЯМР — 32К, импульс 90о длительностью 14.7 мс, ЯМР 13С — 32К, импульс 90о длительностью 9.3 мс. Время ожидания 5 с.
Состав почвенных
Результаты и их обсуждение
Результаты анализа организмов почвы (дождевых червей и микробиоты), обработанной разными концентрациями (ПК, 10ПК, 100ПК) пестицида с учетом экологических факторов (нарушение условий хранения и внесения доз препарата, их превышение), свидетельствуют об отрицательном влиянии пестицида в условиях нарушения правил обработки почвы установленным производителем препарата. В результате исследования установлено, что концентрация измельченного препарата 100ПК является губительной для дождевых червей (табл. 1).
Таблица 1 Влияние инсектицида «Гроза» на дождевых червей
Контейнеры Начальное Выжива-
с почвой, количество емость
обработанной помещенных через 15 сут,
пестицидом в контейнер дождевых червей (Lumbricusterrestris L.), % %
Контроль - 0 ПК 100
ПК 100 80
10ПК 40
100ПК 0
Концентрации ПК и 10 ПК незначительно влияют на качественный и количественный состав микробиоты, а доза 100ПК практически полностью подавляет рост выявленных микроорганизмов (табл. 2).
С целью исследования биодеструкции метальдегида из препаративной формы исходного пестицида была проведена экстракция метальдегида хлороформом. Экстракцию проводили следующим образом: в перемолотый в порошок пестицид (30 г) добавили 30 мл хлороформа, тщательно перемешали, отделили твердую фазу от жидкой фильтрованием, в экстракте через 12 ч образовались кристаллы. Методом ЯМР и 13С спектроскопии проведена идентификация полученного вещества как метальдегида .
Таблица 2
микроорганизмов
Микроорганизмы Контроль ПК
0 1 10 100
Pseudomonas sp. (2±0.02)-106 (1±0.03)-106 (2±0.02)-105 не обнаруж.
Bacillus sp. (3±0.02)-107 (2 ±0.02)-107 (1±0.02)-10/ не обнаруж.
Arthrobactersp. (2±0.03)-105 (2+0.03)-104 (1±0.02)104 +
Fusariumsp. +++ +++ ++ +
Penicilliumsp. +++ +++ ++ +
Примечание: контроль - без внесения инсектицида; +++ - обильный рост микроорганизмов;
++ - умеренный рост; + - слабый рост.
Изучение деструкции метальдегида проводили путем внесения штаммов деструкторов в жидкую минеральную среду Егоровой. Ме-тальдегид добавляли в количестве 1 г/л минеральной среды. Инокулят добавляли из расчета 3% объемных на 100 мл питательной среды. Все операции производились в стерильных условиях 5.
Для анализа ТСХ применяли пластинки Silufol UV-254, н-гексан - EtOAc = 1:1. Анализ полученных проб показал, что активными биодеструкторами метальдегида являются: Bacillus cereus IBRB-33T и Bacillus subtilis 16N27.13LB (рис. 1).
а б в
Рис. 1. Результаты ТСХ анализа продуктов биодеструкции метальдегида микроорганизмами через шесть суток взаимодействия: а — исходное вещество (мета льде гид); б — проба с Bacillus cereus IBRB-33T; в — проба с Bacillus subtilis16N27.13LB.
Сравнение спектров ЯМР исходного метальдегида со спектрами образцов, полученных в результате культивирования микроорганизмами Bacillus cereus IBRB-33T в течение двух суток, показало, что в течение этого времени происходит разложение пестицида. Так, наряду с сигналами метальдегида появляются дополнительные сигналы (5H = 2.3 м.д.;
Литература
1. Петрова Д. В., Балакирева С. В., Маллябаева М. И. Воздействие пестицидов на окружающую среду и человека // Радиоэкология. Новые технологии обеспечения экологической безопасности: сб. науч. тр. междунар. науч.-техн. конф.-Уфа: изд-во УГНТУ, 2012.- С. 188-195.
2. Ягафарова Г.Г., Леонтьева С.В., Федорова Ю.А., Сафаров А.Х. Микробная трансформация экотоксикантов.- Уфа: изд-во УГНТУ, 2015.- 254 с.
3. Маллябаева М.И., Тюмкина Т.В., Балакирева. Ягафарова Г. Г. Экологически чистый способ получения низкомолекулярного полипропилена
5H = 9.8 м.д.) (вычет примесных сигналов минорной интенсивности проводился при сравнении с исходным спектром). Комплексный анализ одно- и двумерных гетеро-корреляцион-ных экспериментов HSQC и HMBC, проведенных на инверсном датчике, позволили
о
установить структуру ацетальдегида , как продукта биодеструкции, очевидно, оставшегося в растворе после неполного упаривания растворителя. Этот факт вполне соответствует литературным данным 8. О наличии ацетальде-гида, как продукта биотрансформации ме-тальдегида, свидетельствуют также данные ИК-спектроскопии, так как в спектре наблюдаются колебания группы HC=O при 1710.7 см-1 в комплексе с сигналами 2851.4, 2921.4 см-1, характеризующими связь C—H.
Использование микроорганизмов Bacillus subtilis 16N27.13LB не изменяет направление биотрансформации, так как в результате также образуется ацетальдегид. Однако скорость биодеструкции сравнительно выше, поскольку через двое суток наблюдаются характеристичные сигналы ацетальдегида при отсутствии сигнала исходного вещества.
Таким образом, установлено, что нарушение приемов обработки препаратом, содержащим метальдегид, при дозах 10ПК и выше отрицательно влияет как на микробиоту почвы, а именно на бактерии: грамотрицательные — Pseudomonas sp., спорообразующие — Bacillus sp., автохтонные — Arthrobacter sp., так и на микромицеты из рода Fusarium и Penicillium. Доза 100ПК губительна для дождевых червей (Lumbricusterrestris L.).
Выявлены активные микроорганизмы-деструкторы метальдегида: Bacillus cereus IBRB-33T и Bacillus subtilis 16N27.13LB.
Методом ЯМР спектроскопии подтверждено, что промежуточным продуктом биотрансформации метальдегида является ацетальдегид.
References
1. Petrova D. V., Balakireva S. V., Mallyabaeva M. I. Vozdeistvie pestitsidov na okruzhaiushchuyu sredu i cheloveka [The impact of pesticides on the environment and human]. Sb. nauch. tr. mezhdunar. nauch.-tekhn. konf. «Radioekologiya. Novye tekhnologii obespecheniya ekologicheskoi bezopasnosti» [Proc. of the Int. Sci. and Techn. Conf. «Radioecology. New technologies ensure ecological safety»]. Ufa, USPTU Publ., 2012, pp. 188-195.
2. Yagafarova G.G., Leont'eva S.V., Fedorova Yu.A., Safarov A.Kh. Mikrobnaya transforma-tsiya ekotoksikantov [Microbial transformation of toxicants]. Ufa, USPTU Publ., 2015, 254 p.
// Нефтепереработка и нефтехимия.— 2013.— 3. №3.- С. 38-39.
4. Хайруллина Г.Г., Зайнутдинова Э.М. Потенциал использования микроно-растительного взаимодействия для фиторемедиации // Матер. 63-й научно-техн. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ.- Уфа: изд-во УГН-ТУ, 2012.- С.61. 4.
5. Фомин Г.С., Фомин А.Г. Почва. Контроль качества и экологической безопасности по международным стандартам. Справочник.- М., 2001.- 294 с.
6. Нетрусова А. И., Егорова М. А., Захарчук Л. М., и др. Практикум по микробиологии.- М: Издательский центр «Академия», 2005.- 608 с.
7. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т.1: 5 Пер. с англ./Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига,
П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса.- М.: Мир, 1997.- 432 с.
8. Pretsch E., Buhlmann P., Badertscher M. Structure Determination of Organic Compounds Tables of Spectral Data.- Berlin Heidelberg: 6 Springer-Verlag, 2009.
9. МУК 4.1.2052-06 «Определение остаточных количеств метальдегида в воде, почве, овощах (капуста, салат, Китайская капуста, шпинат, редис 7 и др.), фруктах (яблоки, сливы и др.), ягодах (земляника, смородина и др.) и винограде методом газожидкостной хроматографии».- Утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 10 апреля 2006 г.
Mallyabaeva M.I., Tyumkina T.V., Balakireva S. V., Yagafarova G.G. Ekologicheski chistyi sposob polucheniya nizkomolekuliarnogo polipropilena [The eco-friendly way to produce low molecular weight polypropylene]. Neftepererabotka i neftekhimiya [Refining and Petrochemicals], 2013, no. 3, pp. 38-39.
Khairullina G.G., Zainutdinova E.M. Potentsial ispol'zovaniya mikrobno-rastitel'nogo vzaimo-deistviya dlya fitoremediatsii [The potential use of plant-microbe interactions for phyto-remediation]. Mater. 63-i nauchno-tekhn. konf. studentov, aspirantov i molodykh uchenykh UGNTU [Proc. of the 63rd sci. conf. of students, graduate students and young scientists USPTU]. Ufa, USPTU Publ., 2012, p.61. Fomin G.S., Fomin A.G. Pochva. Kontrol' kachestva i ekologicheskoi bezopasnosti po mezhdunarodnym standartam. Spravochnik [Quality assurance and environmental safety by international standards. Directory]. Moscow, 2001, 294 p.
Netrusova A.I., Egorova M.A., Zakharchuk L.M. Praktikum po mikrobiologii [Workshop on microbiology]. Moscow, Akademiya Publ., 2005, 608 p.
Opredelitel' bakterii Berdzhi. V 2-kh t. T. 1: Per. s angl./Pod red. Dzh. Khoulta, N. Kriga, P. Snita, Dzh. Steili, S. Uill'iamsa [The determinant of bacteria Burgi. In 2 v. V. 1]. Moscow, Mir Publ., 1997, 432 p. Pretsch E., Buhlmann P., Badertscher M. [Structure Determination of Organic Compounds Tables of Spectral Data]. Berlin Heidelberg, Springer-Verlag Publ., 2009.
MUK 4.1.2052-06 «Opredelenie ostatochnykh kolichestv metal' degida v vode, pochve, ovoshchakh (kapusta, salat, Kitaiskaia kapusta, shpinat, redis i dr.), fruktakh (iabloki, slivy i dr.), iagodakh (zemlianika, smorodina i dr.) i vinograde metodom gazozhidkostnoi khroma-tografii». Utv. Glavnym gosudarstvennym sanitarnym vrachom RF 10 aprelia 2006 g. [MUK 4.1.2052-06 «Determination of residues of metaldehyde in water, soil, vegetables (cabbage, lettuce, Chinese cabbage, spinach, radishes, etc.), Fruit (apples, plums, etc.), Berries (strawberries, currants, etc.) and grape GLC». Approved. Chief State Sanitary Doctor of the Russian Federation April 10, 2006]
