CC BY
73
Перейти в содержание Вестника РНЦРР МЗ РФ N12 Текущий раздел: Молекулярная медицина
Исследование уровня повреждений ДНК в лимфоцитах периферической крови больных раком простаты
Воробьева Н.Ю.3*, Антощина М.М.2, Пелевина И.И. 1, Осипов А.Н. 1,
Боженко В.К.3
1 ФГБУ науки Институт химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук,
2 ГУ Медицинский радиологический научный центр РАМН,
3 ФГБУ «Российский научный центррентгенорадиологии» Минздравсоцразвития РФ, г. Москва.
Адрес документа для ссылки: http://vestnik.mcrr.ru/vestnik/v12/papers/vorob_v12.htm Статья опубликована: 25 октября 2012 года
Контактная информация:
1119991, Москва, ул. Косыгина, 4, ИХФ РАН, факс: (495) 938-21-56 Пелевина И.И. ,
Осипов АН.
2 249036, Калужская обл., Обнинск, ул. Королева, 4, ГУ МРНЦ РАМН Антощина М.М.
3 117997, Москва, ГСП-7, ул. Профсоюзная, д. 86, ФГБУ «РНЦРР»
Воробьева Н.Ю.
Боженко В.К.
Контактное лицо: Воробьева Наталья Юрьевна, тел 8 (499) 120-1114; e-mail: nuv.rad@mail.ru
Резюме
В лимфоцитах периферической крови больных раком предстательной железы (28 человек) и здоровых доноров (26 человек) изучен уровень поврежденности ДНК методом ДН-комет. Показано, что уровень повреждения ДНК, определяемый методом ДНК-комет при нейтральном рН у онкологических больных ~ в 1.8 раза выше, чем у здоровых индивидуумов. Различие статистически достоверно при p<0.001. У тех же больных обнаружено статистически достоверное (p<0.001) увеличение частоты лимфоцитов крови с микроядрами. Между уровнем повреждения ДНК и долей клеток с микроядрами отмечается статистически достоверная корреляционная связь (r=0.72, p<0.05). Полученные результаты свидетельствуют о том, что
увеличение частоты лимфоцитов крови с микроядрами у больных раком простаты обусловлено главным образом нерепарированными двунитевыми разрывами ДНК.
Ключевые слова: рак простаты, лимфоциты, метод ДНК комет, двунитевый разрывы ДНК, микроядра.
The investigation of DNA damage level in lymphocytes of prostate cancer patients
Vorobyeva N.Yu3., Antoshina M.M2., Pelevina LI1., Osipov A.N1., Bojenko V.K. 3
1 Institute of Chemistry Physics by N.N. Semenov, RAS, 11999, Moscow, Kosygina str,4 fax(495) 938-21-56;
2 Medical Radiological Scientific Center, 249036, Kaluga region, Obninsk, Koroleva str, 4
3 Federal State Budget Establishment Russian Scientific Center of Roentgenoradiology (RSCRR) of Ministry of Health and Social Development of Russian Federation, Moscow. 117997, Moscow, Profsoyusnaya str., 86, e-mail: nuv.rad@mail.ru
Summary
DNA damage level was investigated by DNA comet assay in the peripheral blood lymphocytes of prostate cancer patients (28 men) and healthy donors (26 men). It was shown that the level of DNA damage analysed by DNA comet assay in neutral pH was 1,8 higher than in healthy donors. Difference is statistically significant at P <0.001. In the same patients we revealed a statistically significant (P <0.001) increase in the frequency of blood lymphocytes with micronuclei. It was a statistically significant correlation (r = 0.72, p <0.05).. between the level of DNA damage and the proportion of cells with micronuclei. These results indicate that the elevated frequency of micronuclei in blood lymphocytes from patients with prostate cancer is mainly due to non-repaired DNA double strand breaks.
Key words Prostate cancer, lymphocytes,DNA comet assay, DNA double strand breaks, micronucleus
Оглавление:
Введение
Цель исследования Материалы и методы Результаты исследования Список литературы
Введение
Рак простаты является одним из самых распространенных онкологических заболеваний у мужчин. Только в США ежегодно диагностируют около 200-250 тысяч случаев этого заболевания, в том числе ~ 30 тыс. со смертельным исходом [1]. В настоящее время одним из основных маркеров развития рака простаты является простат-специфический антиген (ПСА) [2]. Однако увеличение концентрации ПСА с определенной
вероятностью свидетельствует о наличии опухоли, но не позволяет выявить лиц с предрасположенностью к ее возникновению. Предполагается, что одной из причин увеличения риска возникновения рака простаты с возрастом является снижение эффективности работы защитных систем, таких как система репарации ДНК, и, как следствие, увеличение количества повреждений ДНК [3,4]. Можно предположить, что анализ повреждений ДНК в соматических клетках может позволить выделить группы лиц с повышенным риском возникновения опухоли.
Перейти в оглавление статьи >>>
Цель настоящей работы состояла в изучении степени поврежденности ДНК в лимфоцитах периферической крови больных раком простаты по сравнению со здоровыми индивидуумами.
Перейти в оглавление статьи >>>
Материалы и методы
Были обследованы две группы людей:
1) Группу контроля составили 26 физически здоровых, некурящих мужчин-доноров в возрасте от 30 до 50 лет. У всех контрольных доноров было получено согласие на проведение данного исследования.
2) Во вторую группу вошли онкологические больные (28 пациентов ФГБУ «РНЦРР» Минздравсоцразвития с диагнозом рак предстательной железы). Диагноз был подтвержден морфологически на материале биопсий [2].
Выделение лимфоцитов из гепаринизированной крови проводили путем центрифугирования в градиенте плотности фикол-верографин (Histopaque, Sigma) в соответствии с прилагаемой инструкцией. После выделения лимфоциты отмывали и ресуспензировали в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) до конечной концентрации 1-2 x106 клеток/мл.
Степень повреждения ДНК в лимфоцитах определяли модифицированным методом электрофореза ДНК единичных клеток при нейтральном рН (метод ДНК-комет) [5].
Степень фрагментации двунитевой ДНК, определяемая этим методом, оценивается по увеличению количества мигрировавшей из ядерной области ДНК и расстояния ее миграции после проведения электрофореза ДНК иммобилизованных в агарозе единичных клеток.
Для окраски ДНК использовали акридиновый оранжевый (Sigma) (2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, рН 7.4). Визуализацию ДНК-комет проводили с помощью микроскопа Люмам P-8 (ЛОМО, Россия) с использованием системы визуализации микрофотоизображений «Микмед-1600-3ф» (ОМО, Россия). Для анализа ДНК-комет использовали программу CometScore v. 1.5 (TriTek Corp. http://tritekcorp.com). Оценивали момент хвоста ДНК-комет (Оливе момент хвоста) равный произведению расстояния от центра ядра до центра плотности хвоста кометы на % ДНК в хвосте.
В лимфоцитах образцов крови определяли частоту клеток с микроядрами (МЯ) по описанной ранее методике с использованием цитокинетического блока цитохалазином В [6]. Подсчитывали число двуядерных клеток с МЯ на 1000 двуядерных клеток. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0.
Изменение степени фрагментации ДНК, определяемое с помощью метода ДНК-комет при нейтральном рН, отражает изменения количества двунитевых разрывов ДНК различной природы, как ферментативных, так и индуцированных различными повреждающими агентами, в том числе и свободными радикалами. На предварительном этапе работы нами было показано, что значения момента хвоста ДНК-комет статистически значимо (r=0.91, Р < 0.01) коррелирует с количеством фосфолирированного гистона Н2АХ (у-Н2ЛХ), то есть с количеством распознанных двунитевых разрывов ДНК.
Перейти в оглавление статьи >>>
Результаты исследования
Результаты исследований показали, что в контрольной когорте наблюдаются существенные индивидуальные различия в уровнях двунитевых разрывов ДНК, но при этом, ни один из доноров не выходил за границы 95%-ного доверительного интервала группы.
У больных раком простаты до лечения отмечается существенная вариабельность уровня двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов крови (рисунок 1). Дисперсии распределения значений момента хвоста ДНК-комет в группах онкологических
больных и контрольных доноров статистически значимо различались по Б критерию Фишера (/’<0.001).
Рис. 1. Степень фрагментации ДНК (момент хвоста ДНК-комет, усл. ед.) лимфоцитов крови контрольных доноров и больных раком простаты.
Статистический анализ полученных данных показал, что в группе онкологических больных до лечения среднее значение момента хвоста ДНК-комет было статистически значимо (P<0.001) выше среднего значения для контрольных доноров - в ~ 1.8 раза (Таблица 1).
Табл. 1. Степень фрагментации ДНК (момент хвоста ДНК-комет, усл. ед.) и доля лимфоцитов крови с микроядрами у контрольных доноров и онкологических больных
Группа Момент хвоста, усл. ед. Доля клеток с микроядрами, о/оо
Контрольные доноры (1) 9.54± 0.57 9.85± 0.88
Больные раком простаты (2) 17.36± 1.24 15.60± 1.38
t-1-2 -5.61, P<0.001 -3.56, P<0.001
Б
1-2
5.09, /<0.001
2.38, /<0.05
Примечание. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка; 1 -
значения 1-критерия Стьюдента;
Анализ данных литературы свидетельствует о том, что у онкологических больных с другими типами опухолей нередко наблюдается повышенный уровень повреждений ДНК в клетках нормальных тканей, в частности в лимфоцитах периферической крови [7,8]. Предполагается, что этот феномен является следствием дефектов систем репарации или/и систем антиоксидантной защиты клеток [9,10]. Однако в опубликованных 2 года назад исследованиях большой когорты больных раком простаты не обнаружено достоверно значимого увеличения уровня однонитевых разрывов ДНК в лимфоцитах крови [11]. В то же время авторы отмечают повышенную чувствительность лимфоцитов крови больных раком простаты к воздействию перекиси водорода, то есть о явном снижении антиоксидантного потенциала клеток. В таком случае любые факторы, провоцирующие оксидативный стресс, должны приводить к увеличению уровня разрывов ДНК в лимфоцитах крови онкологических больных. Отсутствие повышенного уровня однонитевых разрывов ДНК в лимфоцитах крови онкологических больных может объясняться тем, что авторы исследовали криоконсервированные лимфоциты, которые подвергали длительным процедурам замораживания и оттаивания клеток, что может нивелировать исходную разницу в уровнях однонитевых разрывов ДНК. Необходимо также учитывать, что процесс репарации однонитевых разрывов ДНК происходит быстро (до 80 % за 10-15 мин). В нашей работе в свежевыделенных лимфоцитах крови исследовали уровень двунитевых разрывов ДНК, репарируемых медленно, что позволило измерить уровень разрывов ДНК, существующий в лимфоцитах крови.
Для оценки степени поврежденности генома лимфоцитов изучали также частоту клеток с микроядрами (МЯ). Предполагают два механизма индукции МЯ: кластогенный, за счет нерепарируемых двунитевых разрывов ДНК и анеугенный, обусловленный ошибками веретена деления [12]. Результаты исследований частоты клеток с МЯ также свидетельствуют о повышенной поврежденности генома лимфоцитов крови онкологических больных (рисунок 2.). У больных раком простаты отмечалось статистически значимое увеличение частоты лимфоцитов крови с МЯ в 1,6 раза (таблица 1). Более того, между уровнем разрывов ДНК и долей клеток с МЯ существует статистически достоверная корреляционная связь (г=0.72, /<0.05). Данный факт
свидетельствует о том, что увеличение частоты лимфоцитов крови с МЯ у больных раком простаты обусловлено главным образом нерепарированными двунитевыми разрывами ДНК. Не исключено, что увеличение уровня двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах крови больных раком простаты вызвано кластогенными факторами, продуцируемыми опухолевыми клетками.
Зис. 2. Доля лимфоцитов крови микроядрами у контрольных доноров и больных раком простаты.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о повышенной поврежденности ДНК лимфоцитов крови больных раком простаты по сравнению со здоровыми донорами. Представляется перспективным использование степени поврежденности генома лимфоцитов крови в качестве неспецифического прогностического маркера риска возникновения опухоли.
Перейти в оглавление статьи >>>
Список литературы:
1. Jemal A., Murray T., WardE. et al. Cancer statistics // Cancer J. Clin. 2005. V. 55. P. 10-30.
2. Минаева Н.Г., Свиридов П.В., Карякин О.Б., Паршков Е.М. Индивидуальная оценка уровня простатического специфического антигена у больных раком предстательной железы после брахитерапии // Онкоурология. 2007.№ 4. С. 44-48.
3. Malins D.C., Johnson P.M., Wheeler T.M. et al. Age-related radical-induced DNA damage is linked to prostate cancer // Cancer Res. 2001. V.61. P. 6025-6028.
4. Malins D.C., Johnson P.M., Barker E.A. et al. Cancer-related changes in prostate DNA as men age and early identifi cation of metastasis in primary prostate tumors. // Proc.Natl. Acad. Sci. USA . 2003. V. 100. P. 5401-5406.
5. Воробьева Н.Ю., Осипов А.Н., Пелевина И.И. Чувствительность лимфоцитов периферической крови летчиков и космонавтов к воздействию D-излучения: индукция двунитевых разрывов ДНК// БЭБиМ - 2007. - Т. 144. - № 10. - С. 404-407.
6. Пелевина И.И., Афанасьев Г.Г., Алещенко А.В. и др. Радиоиндуцированный адаптивный ответ у детей и влияние на него внешних и внутренних факторов// Радиац. Биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39. №1. С. 106 - 112.
7. Nadin S.B., Vargas-Roig L.M., Drago G. DNA damage and repair inperipheral blood lymphocytes from healthy individuals and cancer patients: A pilot95study on the implications in the clinical response to chemotherapy// Cancer Lett. 2006. V. 239(1). P. 84-97.
8. Nadin S.B., Vargas-Roig L.M., Drago G. Hsp27, Hsp70 and mismatch repair proteins hMLH1 and hMSH2 expression in peripheral blood lymphocytes from healthy subjects and cancer patients // Cancer Lett.- 2007. V. 252(1). P.131-146.
9. Ramos J.M., Ruiz A., Colen R. et al. Prevalence of prostate cancer among men with a prostatespecific antigen // Cancer. 2004. V. 100(7). P.:1352-1357.
10. Zheng Y.L., Loffredo C.A., Yu Z., Jones R.T. et al. Bleomycin-induced chromosome breaks as a risk marker for lung cancer: A case-control study with population and hospital controls// Carcinogenesis. 2003. V. 24(2). P. 269-274.
11. Lockett K.L., Hall M.C., Clark P.E. et al. DNA Damage Levels in Prostate Cancer Cases and Controls // Carcinogenesis. 2006. V.27. P.1187-1193.
Kirsch-Volders M., Sofuni T., Aardema M. et al. Effect of smoking habit on the frequency of micronuclei in human lymphocytes: results from the Human MicroNucleus project// Mutat. Res. 2003. V.540. P.153-163.
Перейти в оглавление статьи >>>
КБК 1999-7264 © Вестник РНЦРР Минздрава России © Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России
