CC BY
117
УДК 579.61:616.327.2-093
ИССЛЕДОВАНИЕ СПОСОБНОСТИ К ОБРАЗОВАНИЮ БИОПЛЕНКИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ МИКРОБИОЦЕНОЗА СЛИЗИСТОЙ НОСОГЛОТКИ ПРАКТИЧЕСКИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ
Е.В. Беляева, В.В. Кичикова, В.А. Никифоров,
ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной»
Никифоров Валерий Алексеевич - e-mail: iabnikif@yandex.ru
У бактерий, выделенных со слизистой носоглотки военнослужащих по призыву, определена степень адгезии к полистиролу как показатель возможности формирования биопленки. Подавляющее большинство культур, представляющих нормофлору, обладало свойством пленкообразования, которое повышалось при более тяжелых формах дисбиоза слизистой носоглотки. Гемофильные палочки и стрептококки проявили низкие адгезивные свойства, а культуры S. aureus и K. pneumoniae показали высокую способность к формированию биопленки.
Ключевые слова: микрофлора слизистой носоглотки, дисбиоз, формирование биопленки, адгезивные свойства.
The degree of adhesion to polystyrene of bacteria isolated from nasopharyngeal mucosa of recruits was determined as an indicator of the possibility of biofilm formation. The vast majority of isolates representing the normal flora had the property of film formation, which increased by the more severe forms of dysbiosis of nasopharyngeal mucosa. Haemophilus and Streptococcus showed low adhesive properties but S. aureus and K. pneumoniae showed a high ability to form biofilms.
Key words: nasopharyngeal microflora, dysbiosis, biofilm formation, adhesive properties.
Одним из наиболее важных биотопов в организме человека являются верхние дыхательные пути, характеризующиеся биоразнообразием нормальной флоры и возможным проникновением извне патогенов. В организованных коллективах, особенно в период формирования, в условиях длительного и постоянного контакта, активно работающего аэрозольного механизма передачи происходит перекрестное обсеменение микрофлорой верхних дыхательных путей. Результатом такого обсеменения даже у практически здоровых людей могут стать микроэкологические нарушения биоценоза слизистых оболочек, что обусловливает возможную колонизацию условно-патогенными и патогенными микроорганизмами. В последнее время все большее внимание исследователей привлекает проблема бактериальных биопленок, которые играют существенную роль в развитии инфекционных патологий различной локализации [1]. С другой стороны, формирование биопленки индигенной микрофлорой, колонизирующей слизистые оболочки респираторного тракта, препятствует адгезии патогенных микроорганизмов к эпителию. В этом процессе большое значение имеет и состояние местного иммунитета ЫдА, лизоцим, фагоцитоз и метаболиты нейтрофилов). Однако в какой мере именно способность к образованию биопленки нормоф-лорой может противостоять проникновению патогенов, все еще остается вопросом дискуссии. Нам представилось интересным сравнить эти показатели у представителей биоценоза носоглотки военнослужащих-новобранцев как практически здоровых людей в организованном коллективе.
Цель работы: оценить способность к образованию биопленки у представителей нормофлоры слизистой носо-
глотки и колонизирующих ее условно-патогенных микроорганизмов.
Материал и методы
Исследованы 450 культур микроорганизмов, выделенных со слизистой носоглотки 193 военнослужащих по призыву, не имеющих жалоб на здоровье на момент обследования. Идентификация бактерий до вида была проведена общепринятыми методами с использованием классических питательных сред, а также индикаторных бумажных систем для идентификации бактерий (НПО «Микроген») и «СТРЕПТОтеста 16» («ЛАХЕМА», Чехия). Способность к образованию биопленки определяли методом адгезии к полистиролу в плоскодонных пластиковых планшетах [2]. Суточные бульонные культуры наносили по 0,15 мл в лунки планшета в 4 повторно-стях с последующей инкубацией при 37°С 18-20 час. Затем жидкую фазу декантировали, а осадок прилипших бактерий промывали физиологическим раствором 3 раза и окрашивали 1%-ым спиртовым раствором кри-сталлвиолета. После инкубации в течение 45 минут краситель из лунок декантировали, промывали дистиллированной водой 3 раза, добавляли по 0,2 мл этанола и инкубировали при комнатной температуре 45 минут для экстрагирования красителя. Затем измеряли оптическую плотность (ОП) на микропланшетном ридере при 540 нм. Значения ОП<0,5 расценивали как низкую способность к пленкообразованию, 0,5-1 - как среднюю и ОП>0,5 -как высокий показатель.
Для обработки данных использовали программу BioStat 2009 с применением методов непараметрической статистики (тест Краскела-Уоллиса и Манна-Уитни).
Результаты и их обсуждение
В составе индигенной микрофлоры носоглотки здоровых лиц обычно встречаются представители родов Neisseria spp. и Streptococcus spp. [3]. У обследованных нами солдат срочной службы непатогенные нейссерии и стрептококки со слизистой носоглотки высевались с частотой 89,1% и 83,4%, соответственно, однако был отмечен большой процент выделения добавочной микрофлоры -гемофильных палочек H. influenzae (36,3%), H.haemolyticus (7,3%) и H. parainfluenzae (1,6%), а также условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) с выраженными факторами вирулентности - стафилококки S. aureus (15,0%), ß-гемолитические стрептококки (20,2%), пневмококки (4,7%), в единичном случае - клебсиелла K. pneumoniae. Это позволило разделить обследованных по составу выделенной микрофлоры на 4 группы с различными микроэкологическими типами биотопа [4]: у 28,0% военнослужащих регистрировался нормоценоз, у 12,4% - I степень дисбиотических нарушений, у 33,7% -II степень и у 25,9% солдат - III степень дисбиотических нарушений носоглотки.
Устойчивое существование микробиоценоза во многом определяется комплексом биологических свойств бактерий-ассоциантов, одним из которых, несомненно, является способность бактерий образовывать биопленку на поверхности слизистых оболочек. В условиях in vitro с некоторым приближением это свойство можно оценить по адгезии бактерий к полистиролу, причем принято считать, что интенсивность окрашивания биопленки в лунках планшета >0,5 единиц оптической плотности при 540 нм (ОП540) свидетельствует о хорошей способности к пленкообразо-ванию исследуемых культур [5].
В таблице 1 представлены сводные данные по определению степени адгезии к полистиролу у стрептококков, нейс-серий, гемофильных палочек, стафилококков, а также отдельных видов выделенных бактерий.
В целом большинство культур стрептококков обладало способностью к образованию биопленки, из них 87,5% оральных (представители индигенной микрофлоры) и 85,7% патогенных (пневмококки, ß-гемолитические стрептококки). При этом как оральные, так и патогенные стрептококки в основном проявляли низкую способность к образованию биопленки - 98,2% и 96,4%, соответственно. Исключение составили по одной культуре S. vestibularis, S. oralis/mitis 1 и ß-гемолитического стрептококка. Гемофильные палочки также отличались низкой адгезивной способностью, причем 20,7% гемофильных палочек не проявили способность к образованию биопленки на поверхности полистирола. Что касается нейссерий, то все исследованные штаммы, кроме пяти культур (2%), проявляли способность к пленкообразованию, при этом в целом 75,0% нейссерий демонстрировали показатели ОП540, не превышающие 0,5 ед. (0,12±0,01). Однако среди нейссерий встречались представители со средними и высокими показателями ОП540: 27,5% штаммов N. sicca, 26,3% -N. canis, 28,5% - N. cinerea, 50,0% - N. denitrificans, 22,2% -N. mucosa, 15,4% - N. flavescens и 18,5% -N. subflava. Самую высокую адгезивную активность в отношении полистиролового планшета проявили культуры УПМ - K. pneumoniaе и S. aureus (58,8% штаммов показа-
ли ОП540 >0,5 единиц). Коагулазоотрицательные стафилококки в основном показали низкую способность к образованию биопленки.
Полученные данные подтверждают способность подавляющего большинства представителей индигенной микрофлоры, в большей степени нейссерий, чем стрептококков, формировать биопленку на слизистой носоглотки практически здоровых людей, тем самым поддерживая колонизационную резистентность. Представители аллох-тонной микрофлоры (коринебактерии, стоматококки и гемофильные палочки) отличались низкой способностью к пленкообразованию, а УПМ с выраженными факторами патогенности в основном проявляли высокую способность к формированию биопленки.
ТАБЛИЦА 1.
Способность бактерий к формированию биопленки на поверхности полистирола
Микроорганизмы/ количество штаммов Показатель пленкообразования (ОП540)
низкий (<0,5) средний (0,5-1,0) высокий (>1,0)
кол-во штаммов ОП540 кол-во штаммов ОП540 кол-во штаммов ОП540
Streptococcus spp. / 140 137 0,05±0,01 1 0,83 2 1,19±0,12
Haemophilus spp. / 29 29 0,05±0,02 - - - -
Neisseria spp. / 248 186 0,12±0,01 37 0,72±0,03 25 1,49±0,09
N.sicca / 91 66 0,16±0,02 16 0,71±0,04 9 1,69±0,20
N.canis / 19 14 0,19±0,03 4 0,64±0,04 1 1,01
N.cinerea / 42 30 0,18±0,02 8 0,75±0,06 4 1,39±0,05
N.denitrificans / 12 7 0,26±0,09 2 0,82±0,13 4 1,40±0,13
N.flavescens / 13 11 0,21±0,05 2 0,73±0,13 - -
N.mucosa / 9 7 0,13±0,03 1 0,87 1 1,27
N.subflava / 54 44 0,12±0,02 4 0,69±0,11 6 1,42±0,23
N.polysaccharea / 7 7 0,11±0,06 6 0,13±0,06 - -
N.lactamica / 1 1 0,23 - - - -
Staphylococcus spp. / 29 18 0,25±0,03 8 0,65±0,04 3 1,08±0,02
S. aureus / 17 7 0,30±0,05 7 0,66±0,05 3 1,08±0,02
K.pneumoniae / 1 - - - - 1 1,38
C.pseudodiphthericum / 1 1 0,2 - - - -
E. faecium / 1 1 0 - - - -
Stomatococcus spp. / 1 1 0,16 - - - -
ТАБЛИЦА 2.
Способность к пленкообразованию нормофлоры носоглотки в зависимости от степени дисбиотических нарушений
Степень дисбиоза Нейссерии Стрептококки Нейссерии + стрептококки
Показатель пленкообразования (ОП540) Кол-во Показатель пленкообразования (ОП540) Кол-во Показатель пленкообразования (ОП540) Кол-во
нормоценоз 0,27+0,04 Ме=0,1 * 72 0,05+0,01 Ме=0,04 35 0,20+0,03 Ме=0,07 * 108
ДисбиозI 0,35+0,07 Ме=0,24 29 0,03+0,01 Ме=0,02 22 0,21+0,05 Ме=0,06 51
Дисбиоз II 0,47+0,05 Ме=0,28 * 80 0,09+0,04 Ме=0,04 40 0,35+0,04 Ме=0,12 * 120
Дисбиоз III 0,39+0,06 Ме=0,2 67 0,07+0,05 Ме=0,01 15 0,34+0,05 Ме=0,16 82
Примечания: *p=0,003, **p=0,04 *, **p=0,03, ***p=0,044, **** p=0,045.
ТАБЛИЦА 3.
Способность к формированию биопленки условно-патогенных микроорганизмов, населяющих слизистую носоглотки, в зависимости от степени дисбиотических нарушений
Для того чтобы оценить роль адгезивных свойств бактерий в поддержании структуры микробиоценоза, была исследована способность микрофлоры к формированию биопленки в зависимости от степени дисбиоза носоглотки. Как видно из таблицы 2, представители нормофлоры проявляли тенденцию к увеличению показателей пленкообра-зования при отягощении дисбиотических нарушений, причем нейссерии показали достоверное повышение адгезивных свойств при дисбиозах II и III степени по сравнению с нормоценозом, а суммарные показатели пленкообразова-ния нормофлоры (нейссерий и стрептококков) были достоверно выше при дисбиозах II и III степени по сравнению как с нормоценозом, так и с дисбиозом I степени. Таким образом, можно предположить, что способность к формированию биопленки нормофлорой является динамическим свойством и усиливается при возрастании до определенных пределов агрессивного воздействия патогенных факторов. Все это происходит при устойчивой тенденции к снижению активности лизоцима при дисбиозах II и III степени, что было показано нами ранее [4].
Такие представители УПМ, как гемофильные палочки и патогенные стрептококки, отличались низкой способностью к образованию биопленки на поверхности полистирола вне зависимости от степени дисбиоза слизистой носоглотки (таблица 3). Возможно эти низкие показатели адгезии у аллохтонной микрофлоры - гемофильных палочек - обусловливали их частое, иногда массивное присутствие на слизистой оболочке носоглотки без проявления выраженной патологии. В то же время стафилококки демонстрировали тенденцию к увеличению адгезивных свойств по мере наращивания дисбиотических нарушений микрофлоры носоглотки. Этот показатель лишний раз подчеркивает агрессивную роль стафилококков, особенно S.aureus, в формировании патологических состояний слизистых оболочек.
Таким образом, дисбиотические нарушения слизистой оболочки носоглотки у лиц в организованном коллективе коррелируют с изменением способности бактерий к плен-кообразованию, что может влиять на процесс колонизации ее патогенами.
Выводы
1. У исследованных представителей индигенной микрофлоры носоглотки (98,0% нейссерий и 87,5% оральных стрептококков) обнаружена способность к формированию биопленки, причем 25,0% нейссерий обладали средними и высокими показателями, а 98,2% стрептококков - низкими.
2. Среди представителей добавочной микрофлоры носоглотки все исследованные культуры гемофильных палочек и 96,4% патогенных стрептококков отличались низкой способностью к пленкообразованию, а наиболее выраженными адгезивными свойствами обладали S.aureus и K. pneumoniae.
3. Способность к формированию биопленки представителями нормофлоры - нейссериями и стрептококками -возрастала при более тяжелых дисбиотических состояниях слизистой носоглотки по сравнению с нормоценозом.
ш
ЛИТЕРАТУРА
1. Голуб А.В. Бактериальные биопленки - новая цель терапии? Клиническая микробиология и антимикробная терапия. 2012. Т. 14. № 1. С. 23-29.
Golub A.V. Bacterialnie bioplenki - novaya cel terapii. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimicrobnaya terapiya. 2012. T. 14. № 1. S. 23-29.
2.Карпова Т.И., Дронина Ю.Е., Алексеева Н.В. и др. Формирование биопленок Legionella spp. в эксперименте. Журнал микробиологии. 2008. № 1. С. 3-7.
Karpova T.I., Dronina U.E., Alekseeva N.V. i dr. Formirovanie bioplenok Legionalla spp. V experimente. Jurnal mikrobiologii. 2008. № 1. S. 3-7.
3. Колотилова Л.В., Акишина Т.М., Загранян О.П. и др. Нормальная микрофлора слизистой глотки. Антибиотики и химиотерапия. 1989. Т. 34. № 10. С. 751-755.
Kolotilova L.V., Akisshkina T.M., Zagranyan O.P. i dr. Normalnaya mikroflora slizistoy glotki. Antobiotiki i himioterapiya. 1989. T. 34. № 10. S. 751-755.
4. Никифоров В.А., Ефимов Е.И., Беляева Е.В. и др. Микробиота носоглотки как индикатор состояния мукозального иммунитета у новобранцев в период формирования воинского коллектива. Медицинский альманах. 2012. № 3 (22). С. 148-150.
Nikiforov V.A., Efimov E.I., Belyaeva E.V. i dr. Mikrobiota nosoglotki kak indicator sostoyaniya mukozalnogo immuniteta u novobrancev v period formirovaniya voinskogo kollektiva. Midicinskiy almanah. 2012. № 3 (22). S. 148-150.
5.Шагинян И. А., Данилина Г.А., Чернуха М.Ю. и др. Формирование биопленок штаммами бактерий комплекса Burkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик. Журнал микробиологии. 2007. № 1. С. 3-9.
Shaginyan I.A., Danilina G.A., Chernuha M.U. i dr. Formirovanie bioplenok shtammami bateriy kompleksa Burkholderia cepacia v zavisimosti ot ih fenotipicheskih i genotipicheskih harakteristik. Jurnal mikrobiologii. 2007. № 1. S. 3-9.
Степень дисбиоза Гемофильные палочки ß-гемолитические стрептококки + пневмококки Стафилококки
Показатель пленкообразо-вания (ОП540) Кол-во Показатель пленкообразо-вания (ОП540) Кол-во Показатель пленкообразо-вания (ОП540) Кол-во
Нормоценоз 0 0 0 0 0 0
ДисбиозI 0,03±0,02 Ме=0,02 3 0,15±0,13 Ме=0,015 8 0,31±0,11 Ме=0,24 5
Дисбиоз II 0,09±0,05 Ме=0,03 8 0,05±0,02 Ме=0,02 16 0,41±0,08 Ме= 0,30 14
Дисбиоз III 0,04±0,01 Ме=0,03 18 0,04±0,01 Ме=0,04 4 0,56±0,11 Ме=0,55 10
