Исследование полиморфизма генов ltf и gdf-9 у млекопитающих (Bos Taurus l) методом ПЦР-ПДРФ анализа для решения задач фармакогенетики

Прошин Сергей Николаевич; Усенбеков Есенгали Серикович; Шакибаев Ерден Бахитбекович; Бименова Жанат Жолшыбайкызы; Жумаханова Раиса Мухамедияровна; Глушаков Руслан Иванович; Дементьева Наталья Викторовна

УДК: 615

исследование полиморфизма генов ltf и gdf-9 у млекопитающих (bos taurus l) методом пцр-пдрф анализа для решения задач фармакогенетики

1 ГБоУ впо «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» минздрава россии;

2 Казахский национальный аграрный университет, Алмааты;

3 ФГБнУ «всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных» минздрава россии, Санкт-Петербург

Резюме. Установлена тесная взаимосвязь между полиморфизмом гена лактоферрина (LTF) с заболеваемостью маститом и содержанием соматических клеток в молоке у млекопитающих. Продукты гена лактоферрина связаны с устойчивостью к ряду заболеваний, и прежде всего, к маститам. Лактоферрин (LTF) - многофункциональный малый гликопротеин молока, основная функция которого - защита молочной железы. Считается, что можно использовать генетические варианты лактоферрина в качестве ДНК-маркера для прогнозирования содержания соматических клеток в молоке и заболеваемости маститом: аллель А гена LTF связан с заболеваемостью маститом у таких млекопитающих как коровы. Также установлено влияние полиморфизма генов ВМР 15 и GDF9 у овец на количество овулируемых фолликулов и уровень овуляции. Так, аллели гена, Bone morphogenetic protein - ВМР 15 у овец, оказывают влияние на процесс фолликулогенеза и гетерозиготные овцы по данному локусу овулируют с двумя-тремя ооцитами. Авторы данного исследования рекомендуют использовать полиморфизм гена ВМР 15 у овец в качестве ДНК маркера для повышения плодовитости животных в овцеводстве. Известно, что продукты гена GDF9 контролируют процесс роста и развития фолликулов у коров. Полиморфизм данного гена хорошо исследован в медицине, у женщин, имеющих мутацию в кодирующей части гена GDF9 встречаются признаки преждевременного угасания функции яичников. Изучение полиморфизма гена лактоферрина имеет теоретическое и прикладное значение, так как существует положительная корреляция между содержанием в молоке соматических клеток и генетическими вариантами лактоферрина. Таким образом, авторы работы предлагают использовать полиморфизм гена GDF9 у коров в качестве ДНК маркера для прогнозирования репродуктивной функции у млекопитающих. Цель работы: изучение полиморфизма ДНК генов LTF, GDF9 и выявление животных с желательным генотипом по изучаемым локусам, как перспективной модели для поиска новых фармакологических средств.

Ключевые слова: ДНК маркеры, GDF9, лактоферрин.

investigation of ltf AND gdf-9 GENE polymorphism AND IN MAMMALs (bos taurus l) by pcr-rflp analysis for pharmacogenetics

1 Saint Petersburg State Pediatric Medical University, Russia;

2 Kazakh National Agrarian University, Republic of Kazakhstan;

3 Federal research institute for farm animal genetics and breeding, Russia

Abstract. It has been established the close relationship between gene polymorphism of lactoferrin (LTF) with an incidence of mastitis and somatic cell counts in milk of mammals. Lactoferrin gene products are associated with resistance to several diseases, and particularly for mastitis. Lactoferrin (LTF) is a multifunctional small glycoprotein of milk. Its main function is to protect the breast. It is considered that genetic variants of DNA lactoferrin could be used as a marker for the prediction of somatic cells in milk and mastitis incidence. Allele A of LTF gene is associated with the incidence of mastitis in mammals such as cows. It has also been established that the polymorphism of BMP15 and GDF9 genes of sheep influence the number and rate of ovulation. Thus the alleles of Bone morpho-genetic protein (BMR15) gene influence the process of folliculogenesis in sheep. Sheep heterozygous on this locus ovulate two or three oocytes. The authors of this study recommend the use of polymorphism BMP15 gene as DNA markers to increase fertility in sheep. It is well known that products of GDF9 gene control the process of growth and development of follicles in cows. Polymorphisms

56

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

of the gene is well studied in medicine. Women who have a mutation in the coding region of the gene GDF9 found signs of premature ovarian failure. The study of lactoferrin gene polymorphism has theoretical and practical importance since there is a positive correlation between the content in milk of somatic cells and genetic variants of lactoferrin. Thus, the authors suggest the use of GDF9 gene polymorphism in cows as a DNA marker for the prediction of reproductive function in mammals. The aim: to study DNA polymorphism of genes LTF, GDF9 and identified animals (Bos Taurus L) with the desired genotype for the studied loci to build model for searching new pharmacological agents.

Key words: DNA markers; lactoferrin and GDF9 genes.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Исследованиями установлена тесная взаимосвязь между полиморфизмом гена лактоферрина (LTF) с заболеваемостью маститом, содержанием соматических клеток в молоке. Продукты гена лактоферрина связаны с устойчивостью к заболеваниям, прежде всего, к маститам. Лактоферрин крупного рогатого скота (LTF) — многофункциональный малый гликопротеин молока, основная функция которого — защита молочной железы [2]. Ген LTF локализован на хромосоме 22q24, состоит из 17 экзонов и полная последовательность гена 34,5 тыс п. н. Исследованиями ученых установлена частота генетических вариантов АА, ВВ и АВ лактоферрина у коров голштинской породы, 32,5, 10 и 57,5 % соответственно. Авторы рекомендуют использовать генетические варианты лактоферри-на в качестве ДНК маркера для прогнозирования содержания соматических клеток в молоке и заболеваемости маститом, аллель А гена LTF связана с заболеваемостью маститом у коров [3]. Также, установлено влияние полиморфизма генов ВМР 15 и GDF9 у овец на количество овулируемых фолликулов и уровень овуляции. Так, аллели гена, Bone morphogenetic protein — ВМР 15 у овец, оказывают влияние на процесс фолликулогенеза и гетерозиготные овцы по данному локусу овулируют с двумя-тремя ооцитами. Авторы данного исследования рекомендуют использовать полиморфизм гена ВМР 15 у овец в качестве ДНК маркера для повышения плодовитости животных в овцеводстве [1].

В 2013 году появилось первое сообщение о полиморфизме гена GDF9 (Growth differentiation factor 9) у Bos Taurus L и о связи аллелей данного гена с выходом пригодных для трансплантации эмбрионов у животынх-доноров, с общим количеством эмбрионов. Ген GDF9 у Bos Taurus L имеет длину 3824 пар нуклеотидов, экзонная часть гена оказалась консервативной и не имеет мутации, а в интронной части обнаружены две точечные мутации. Известно, что продукты гена GDF9 контролируют процесс роста и развития фолликулов у коров. Полиморфизм данного гена хорошо исследован в медицине, у женщин, имеющих мутацию в кодирующей части гена GDF9 встречаются признаки преждевре-

менного угасания функции яичников [4, 5]. Китайскими учеными установлено, что высокий выход качественных эмбрионов для трансплантации был у коров-доноров с генотипом A485TT, также была выявлена положительная корреляция с общим количеством эмбрионов и генотипом коров-доноров A625AA. Изучение полиморфизма гена лактоферрина имеет теоретическое и прикладное значение, так как существует положительная корреляция содержанием в молоке соматических клеток и с генетическими вариантами лактоферрина.

Таким образом, авторы работы предлагают использовать полиморфизм гена GDF9 у коров в качестве ДНК маркера для прогнозирования репродуктивной функции у Bos Taurus L.

Цель работы: изучение полиморфизма ДНК генов LTF, GDF9 и выявление животных с желательным генотипом по изучаемым локусам, как перспективной модели для поиска новых фармакологических средств.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на 88 коровах голштинской породы племенного хозяйства ТОО «Байсерке-Агро» Талгарского района Алматинской области. Кровь для анализа брали из яремной вены в ваккум-ную пробирку с антикогулянтом — ЭДТА. Работу проводили в учебно-научно-диагностической лаборатории Казахстанско-Японского инновационного центра КазНАУ. ДНК из крови выделяли с помощью набора «ДНК сорб В».

Для детекции полиморфизма гена LTF использовали следующую пару праймеров:

F — 5'-GCCTCATGACAACTCCCACAC-3', R 5'-CAGGTTGACACATCGGTTGAC-3'.

Условия проведения ПЦР: денатурация при 94 °C — 45 сек, отжиг праймеров — 62 °C 45 сек и элонгация при температуре 72 °C 45 сек и количество циклов 35-40. Объем реакционной смеси: 50 мкл, имеющий следующий состав: 5 мкл 10 х ПЦР буфера, 1,5 мМ MgCl2, 2,5 мкл 25 мкМ прямого и обратного праймеров, 5 мкл 0,2 мМ концентрации каждого dNTP, 0,5 мкл фермента Taq Polymerase с активностью 5и/ц1, 5 мкл ДНК и 26,5 мкл дистиллированной воды.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

242

301

201 100

Рис. 1. Электрофореграмма амплификата гена LTF после рестрикции эндонуклеазой EcoRI

Для генотипирования по локусу лактоферрина используется эндонуклеаза EcoRI, которая имеет сайт рестрикции GAATT/C и продукт амплификации длиной 301 п. н. после рестрикции амплификата ре-стриктазой EcoRI образуются два фрагмента длиной 201 п. н. и 100 п. н. Как видно электрофореграмме, лунка 1 — ДНК маркер, лунки 1, 6, 8, 13 животные с генотипом АА, лунки 2, 3, 5, 7, 10, 12 с генотипом АВ и лунки 4, 9, 14 с генотипом ВВ (рис. 1).

Для амплификации нужного фрагмента гена GDF9 A485T были использованы праймеры, разработанные авторами TangK. Q. и др. (2013), которые имеют следующие последовательности: прямые F 5'-AGGGAAGAAGAAAGATCTTTTGC-3' обратные R: 5'- TCTACCCAGGCTTTAGTCCC-3'. Использование данной пары праймеров позволяет амплифицировать участок гена GDF 9 длиной 208 пар нуклеотидов. В данном случае для генотипирования животных применяется рестриктаза NsiI, которая имеет сайт рестрикции ATGCA/T.

Для детекции второй точечной мутации в ин-тронной части изучаемого гена A625T нами были использованы праймеры:

прямые F: 5'-ATGCCCTCATGGGTTGATGTAGGCTA-3' обратные R: 5'- CTCCCATCTCTCTCATACACACAAG-3'.

Комплементарность последовательностей вышеуказанных праймеров нами были проверены с помощью компьютерной программы, обе пары праймеров оказались комплементарными исследуемому участку гена GDF9. Рестрикцию продукта ПЦР во втором опыте проводили с помощью рестриктазы Dral, которая имеет сайт рестрикции TTT/AAA.

результаты исследования

Всего генотипировано 88 животных (голштин-ская порода) ТОО «Байсерке-Агро», частота генетических вариантов по локусу лактоферрина составила: с генотипом АА — 28 животных (31,8 %), АВ — 54 животных (61,3 %) и ВВ — 6 животных (6,8 %). Диагностику на субклинический мастит проводили методом подсчета соматических кле-

ток в молоке коров с помощью прибора Fossomatic 5000 и димастиновой пробы, по результатам исследования у 12 животных был выявлен субклинический мастит. Они имели гетерозиготный генотип АВ по локусу лактоферрина и полученные результаты соответствуют литературным данным.

Так, по локусам A485T и A625T гена фактора роста и дифференцировки (GDF9) у исследуемой популяции животных выявлены все три генетических варианта генотипа, однако из-за небольшой не выявлена корреляция между генетическими вариантами гена GDF9 и репродуктивной функцией у Bos Taurus L.

выводы

Таким образом, результаты нашего исследования по изучению полморфизма гена лактоферрина у млекопитающих (Bos Taurus L), показывают, что существует положительная корреляционная связь между генетическим вариантом АВ лактоферрина и заболеваемостью субклиническим маститом. Использование метода полимеразной цепной реакции совместно с ПДРФ позволяет в течение 5-6 часов провести генотипирование животных по локусам A485T и A625T гена фактора роста и дифференцировки (GDF9). Таким образом, представляется перспективным поиск фармакологических средств на основе новых данных о полиморфизме генов лактоферрина и фактора роста и дифференцировки (GDF9).

ЛИТЕРАТУРА

1. Barzegari A., Atashpaz S., GhabiLi K., Nemati Z., et al. Polymorphismsin GDF9 and BMP15 associated with fertility and ovulation rate in Moghani and Ghe-zel sheep in Iran. Reprod. Domest. Anim. 2010; 45: 666-9.

2. Sharifzaden A., Doosti A. Study of Lactoferrin Gene Polymorphism in Iranian Holstein Cattle Using PCR-RFLP Technique. Global Veterinaria. 2011; 6 (6): 530-6.

3. Schwerin M., ToLdo S. S., Eggen A., Brunner R. M., Sey-fert H. M., Fries R. The bovine Lactoferrin gene (LTF) maps to chromosome 22 and syntenic groupU12. MammaLin Genome. 1994; 5, 486-9.

4. Tang K. 0., Yang W. C., Li S. J. and Yang L. G. PoLymorphisms of the bovine growth differentiation factor 9 gene associated with superovuLation performance in

Chinese Holstein cows. Genetics and Molecular Research. 2013; 12 (1): 390-9 5. Wang T. T., Wu Y. T., Dong M. Y., Sheng J. Z. et al. G546A polymorphism of growth differentiation factor-9 contributes to the poor outcome of ovarian stimulation in women with diminished ovarian reserve. Fertil. Steril. 2010; 94: 2490-2.

♦ Информация об авторах

Прошин Сергей Николаевич — д-р мед. наук, профессор, Proshin Sergei Nikolaevich — MD, PhD, Dr Med Sci Professor, Head.

заведующий, кафедра фармакологии. ГБОУ ВПО «Санкт- Department of pharmacology. St. Petersburg State Pediatric Medi-

Петербургский государственный педиатрический меди- cal University. 2, Litovskaya St., St. Petersburg, 194100, Russia.

цинский университет» Минздрава России. 194100, Санкт- E-mail: psnjsn@rambler.ru. Петербург, ул. Литовская, д. 2. E-mail: psnjsn@rambler.ru.

Усенбеков Есенгали Серикович — канд. биол. наук, доцент, за- UsenbekovEssengali Serikovich — PhD, Associate Professor, Head.

ведующий, кафедра клинической ветеринарной медицины. Department of Clinical Veterinary Medicine. Kazakh Agrar-

Казахский национальный аграрный университет. 150013, ian National University. 8, Abaya prospect, Almaaty, 150013,

Алмааты, пр. Абая, д. 8, Республика Казахстан. Republic of Kazakhstan. E-mail: usen03@mail.ru. E-mail: usen03@mail.ru.

Шакибаев Ерден Бахитбекович — аспирант, кафедра клини- ShakibaevErden Bakhitbekovich — Postgraduate Student. De-

ческой ветеринарной медицины. Казахский национальный partment of Clinical Veterinary Medicine. Kazakh Agrarian Na-

аграрный университет. 150013, Алмааты, пр. Абая, д. 8, Респу- tional University. 8, Abaya prospect, Almaaty, 150013, Republic

блика Казахстан. E-mail: shakibaev.erden@mail.ru. of Kazakhstan. E-mail: shakibaev.erden@mail.ru.

Бименова Жанат Жолшыбайкызы — аспирант, кафедра клини- Bimenova Zhanat Zholshybaikyzy — Postgraduate Student. De-

ческой ветеринарной медицины. Казахский национальный partment of Clinical Veterinary Medicine. Kazakh Agrarian Na-

аграрный университет. 150013, Алмааты, пр. Абая, д. 8, Респу- tional University. 8, Abaya prospect, Almaaty, 150013, Republic

блика Казахстан. E-mail: 070702007@mail.ru. of Kazakhstan. E-mail: 070702007@mail.ru.

Жумаханова Раиса Мухамедияровна — старший преподаватель, Zhumakhanova Raisa Mukhamediyarovna — Senior teacher.

кафедра акушерства, хирургии и биотехнологии воспроиз- Department of Obstetrics, Surgery and Reproduction Biotech-

водства. Казахский национальный аграрный университет. nology. Kazakh Agrarian National University. 8, Abaya prospect,

150013, Алмааты, пр. Абая, д. 8, Республика Казахстан. Almaaty, 150013, Republic of Kazakhstan.

E-mail: usen03@mail.ru. E-mail: usen03@mail.ru.

Глушаков Руслан Иванович — канд. мед. наук, доцент, кафедра Glushakov Ruslan Ivanovich — MD, PhD, Associate Professor.

фармакологии. ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государ- Department of pharmacology. St. Petersburg State Pediatric

ственный педиатрический медицинский университет» Минз- Medical University. 2, Litovskaya St., St. Petersburg, 194100,

драва России. 194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, д. 2. Russia. E-mail: glushakovruslan@gmail.com. E-mail: glushakovruslan@gmail.com.

Дементьева Наталья Викторовна — канд. биол. наук, стар- Dement'eva Natal'ya Viktorovna — PhD, Senior researcher.

ший научный сотрудник, отдел биотехнологии, лаборатория Department of pharmacology. Department of biotechnology

молекулярной цитогенетики. ФГБНУ «Всероссийский научно- of the Laboratory of molecular cytogenetics.

исследовательский институт генетики и разведения сель- Federal research institute for farm animal genetics and

скохозяйственных животных» Минздрава России. 196601, breeding. 55а, Moskovskoye shosse, Pushkin, St. Petersburg,

Пушкин, Санкт-Петербург, Московское шоссе , д. 55а. 196601, Russia.

E-mail: dementevan@mail.ru. E-mail: dementevan@mail.ru.

Investigation of LTF and GDF-9 gene polymorphism and in mammals (Bos Taurus L) by PCR-RFLP analysis for pharmacogenetics

Текст научной работы на тему «Исследование полиморфизма генов ltf и gdf-9 у млекопитающих (Bos Taurus l) методом ПЦР-ПДРФ анализа для решения задач фармакогенетики»