CC BY
93
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДА СВЕРХКРИТИЧЕСКОЙ ФЛЮИДНОЙ ЭКСТРАКЦИИ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ БАГУЛЬНИКА
© Попова А.С.*
Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова, г. Архангельск
Представлены результаты экспериментальных исследований БАВ багульника, собранного в Архангельской области, методом сверхкритической флюидной экстракции, а также изучения влияния температуры и давления на качественный и количественный состав проэкстраги-рованных веществ.
Ключевые слова сверхкритическая флюидная экстракция; сверхкритический флюид спектрофотометрия; биологически активные вещества; хлорофилл; каротин; ацетон; багульник.
Сверхкритическая флюидная экстракция применяется для эффективного извлечения биологически активных веществ (БАВ) из различных растительных объектов, которые широко используется в разных областях промышленности и медицине. Экстракты багульника также нашли широкое применение в медицине и легкой промышленности. Эфирные масла используются в парфюмерной отрасли и мыловарении, вытяжки используются наружно при артритах, ушибах и невралгии, а отвары применяются при заболеваниях органов дыхания.
В фармацевтической промышленности большое значение имеют листья растения. Для заготовки срезают и сушат молодые побеги длиной не более 10 см во время цветения. Цветки и листья багульника обладают фитонцидной активностью. Содержание эфирного масла в них составляет около 2 %, в его состав входят ледол, палюстрол и другие компоненты, обладающие бальзамическим запахом и бактерицидным действием. Растение богато витаминами, органическими кислотами, флавоноидами, гликозид арбутином, тритерпеновыми соединениями, кумаринами, красящими, дубильными и другими веществами, микроэлементами [1].
Для багульника болотного характерно высокое содержание (до 1,6 % сухого сырья) хлорофилла (А и В). Растение является одним из источников бета-каротина, количество которого также изменяется в зависимости от времени сбора и места произрастания [2].
* Студент кафедры Теоретической и прикладной химии.
Авторами проведены опыты извлечения БАВ багульника при помощи сверхкритического флюида - вещества, находящегося при температуре и давлении выше критической точки.
Вещество в сверхкритическом состоянии обладает промежуточными свойствами между его жидким и газообразным состоянием. Сверхкритический флюид обладает вязкостью, характерной для газообразного состояния, и плотностью, характерной для жидкости. Поверхностное натяжение отсутствует при отсутствии границы раздела фаз. Вещества в подобном состоянии заменяют органические растворители в лабораторной практике. Чаще всего используется диоксид углерода, реже - сверхкритическая вода. Далее будет рассматриваться сверхкритический диоксид углерода, для которого температура выше критической - выше 304 К, а давление выше критического - выше 7,4 МПа [3].
Для извлечения БАВ используются различные способы экстракции, в которых часто используют органические соединения (спирт и ацетон). Органические растворители применяют для получения из растительного сырья наиболее полных по своему химическому составу экстрактов.
Свойства сверхкритического (СК) СО2 важны для экстракции веществ. СК СО2 - селективный неполярный растворитель, отделяющий необходимые составляющие, исключающий включение токсических остатков растворителей в экстрактах и распад выделяемых продуктов в результате термического воздействия [4]. Технология СК СО2 экстракции позволяет получать концентрат БАВ с сохранением полного природного соотношения и биохимических характеристик, присущих растению. Важны следующие свойства СК СО2, как неполярного растворителя:
- чем больше похожи по своим химическим и физическим свойствам растворитель и растворяемое вещество, тем выше растворимость вещества;
- для ряда веществ с соизмеримой полярностью летучесть понижается с повышением молекулярного веса, также понижается и растворимость в данном растворителе.
Любое увеличение растворяющей способности приводит не только к повышению растворимости вещества, но и к увеличению ряда веществ, растворимых в данном количестве растворителя. То есть, чем больше составляющих смеси растворяет сольвент, тем более низкой селективностью он обладает. Низкая способность к растворению означает высокую селективность [5].
Так как именно багульник имеет достаточно широкое применение, а его химический состав сильно варьируется в зависимости от ареала произрастания, то в исследовании были поставлены следующие цели и задачи. Цель -изучение химических составляющих растительного сырья багульника, собранного в Архангельской области; провести несколько серий опытов по экстракции сырья багульника и изучить влияние температуры и давления на
качественный и количественный состав проэкстрагированных веществ. Задача - исследование БАВ багульника методом сверхкритической флюидной экстракции, так как метод очень перспективный и эффективный для выделения веществ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Оборудование. Реагенты и материалы. Для проведения экстракции с помощью сверхкритического флюида была использована система марки «Waters», имеющая название «MV-10 ASFE» (аналитическая система сверхкритической флюидной экстракции с несколькими экстракционными емкостями). Создали процесс, в котором будут контролироваться следующие параметры: давление; поток углекислого газа; сорастворитель (как правило, этанол); доля сорастворителя в общем потоке; продолжительность цикла экстракции; температура экстракции.
Затем были проведены следующие серии процессов: поток углекислоты составлял 2,85 мл/мин., поток сорастворителя (этанола) - 0,15 мл/мин. (что составило 5 % в общем потоке). Продолжительность циклов экстракции составляла 20 мин, далее планируется увеличить время до 40 и 60 мин. Были проведены четыре различных процесса при температурах 303, 313, 333 и 343 К. Кроме того, для каждого значения температуры были проведены процессы при давлениях 10, 20, 30 и 35 МПа. Для каждого значения температуры и давления были созданы три параллельных процесса.
Проведено спектрофотометрическое определение выхода некоторых экстрагируемых веществ (хлорофилла) с помощью спектрофотометра марки «analytikjena» «SPECORD 250». Хроматографическим методом измерено содержание хлорофиллов А и В, в- и а-каротина на хроматографе марки «SHIMADZU».
Дополнительные процедуры для получения результатов. Проведены процессы сверхкритической флюидной экстракции сырья багульника и взятие навесок, как указано в табл. 1.
Далее проведено измерение влажности сырья багульника для дальнейшего определения выхода веществ в процентах от абсолютно сухого сырья. Измерения влажности проводилось три раза: два параллельных были проведены с помощью прибора для измерения влажности и один проведен по методике получения абсолютно сухой навески. Для получения массы абсолютно сухой навески был использован предварительно доведенный до постоянной массы бюкс, Щзюкса = 46,6779 (г). Далее в бюкс была помещена навеска измельченного сырья багульника, Щ5юкса с швее™ = 48,8450 (г), и доводилась до постоянной массы при температуре 103 ± 2 °C три раза (по 1,5 ч и два раза по 40 мин.), пока разность двух последовательных взвешиваний не перестали отличаться более чем на 0,5 (мг). Таким образом: Щюкса с навеской после высушивания = 47,8755 (г), Щбюкса = 46,6791 (г), то есть щ,. с. навески = 1,1964 (г) [6].
Приведём методику и пример расчёта спектрофотометрического определения содержания хлорофилла в пробе. После проведения процесса сверхкритической флюидной экстракции сырья багульника экстракт был помещён в мерную колбу, объём был доведён до 50 мл растворителем (ацетоном). Далее процентное содержание хлорофилла определялось с помощью спектрофотометра марки «апа1уйк]епа» «8РБСОКЭ 250» следующим образом: в одну кювету отбиралось 2 мл исследуемого раствора, а в кювету сравнения - 2 мл ацетона. Затем, с помощью снятого спектра определялась оптическая плотность, необходимая для расчета концентрации хлорофилла по закону Бугера-Ламберта-Бера [7].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Проведён расчёт влажности навески, выяснено, что среднее содержание сухого вещества: 56,98 %.
Расчет концентрации хлорофилла, А, из закона Бугера-Ламберта-Бера
А = е • 1 • С, (1)
( л ^
где е - коэффициент экстинкции хлорофилла ацетоном I-I (82,6);
^ г • см^
1 - толщина кюветы (1 (см));
С - концентрация раствора хлорофилла |—|.
Следовательно, концентрация раствора хлорофилла может быть описана выражением
^ А
с = —. (2) е • 1
Из данной концентрации рассчитывается масса хлорофилла в экстракте (50 мл).
Процентное содержание хлорофилла в навеске можно рассчитать по формуле:
хлорофилла в экстракте Ю =-.
среднее содержание сухоговещества• т
а.с. навески
На рис. 1, 2 приведены примеры спектра и хроматограммы СК экстракта багульника, растворённого в ацетоне. Масса навески - 0,960 (г), температура - 343 К, давление - 20 МПа. Концентрация хлорофилла, определенная спектрофотометрически, составляет 0,0088 (г/л), процентное содержание хлорофилла от абсолютно сухой навески, определенное спектрофотометри-чески, составляет 0,065 %.
Подробный расчёт для всех экстрактов приведен в табл. 1. Приведем пример расчёта содержания хлорофилла в абсолютно сухой навеске, получен-
ного спектрофотометрическим методом, для условий, которые приведены выше для примера спектра: при длине волны 663 нм (для хлорофилла пик наблюдается при 663-665 нм), оптическая плотность раствора составляет 0,7283.
Рис. 1. Пример спектра СК экстракта багульника
Рис. 2. Пример хроматограммы СК экстракта багульника
Тогда С = 0,7283 = 0,0088 Г -
82,6-1 и
Таким образом, будет получена концентрация хлорофилла в литре раствора, нужно пересчитать концентрацию в 50 мл раствора - 0,000441 г.
В табл. 1 представлены данные о содержании хлорофилла и р-каротина в полученных экстрактах.
Таблица 1
Данные о проведённых экстракциях и извлеченных веществах
Ъ, к Р, МПа & г С, г/л ■да х. с., % ■ хлор. А ■ хлор. В ■Р-кар. V, мл
г/л г/л г/л
10,0 0,942 0,0123 0,09 0,00095 0,14 0,00018 0,03 0,00004 0,010
313 20,0 0,955 0,0109 0,08 0,00082 0,12 0,00016 0,02 0,00003 0,010
30,0 0,950 0,0021 0,02 0,00011 0,02 0,00003 0,01 0,00001 0,001
35,0 0,952 0,0144 0,01 0,00010 0,01 0,00002 0,01 0,00001 0,001
10,0 0,950 0,0078 0,06 0,00018 0,03 0,00006 0,01 0,00002 0,003
313 20,0 0,955 0,0087 0,07 0,00059 0,09 0,00016 0,02 0,00003 0,005
30,0 0,950 0,0044 0,04 0,00048 0,08 0,00012 0,02 0,00002 0,004
35,0 0,950 0,0111 0,08 0,00039 0,06 0,00010 0,02 0,00003 0,004
10,0 0,960 0,0046 0,04 0,00008 0,01 0,00006 0,01 0,00002 0,004
313 20,0 0,960 0,0065 0,05 0,00009 0,01 0,00007 0,01 0,00002 0,004
30,0 0,960 0,0130 0,09 0,00070 0,09 0,00019 0,02 0,00004 0,006
35,0 0,960 0,0103 0,08 0,00060 0,08 0,00016 0,02 0,00003 0,005
10,0 0,918 0,0012 0,02 0,00000 0,00 0,00000 0,00 0,00001 0,001
333 20,0 0,949 0,0049 0,04 0,00003 0,01 0,00003 0,01 0,00001 0,001
30,0 0,978 0,0106 0,06 0,00006 0,01 0,00005 0,01 0,00002 0,002
35,0 0,966 0,0144 0,10 0,00090 0,03 0,00018 0,02 0,00004 0,005
10,0 0,960 0,0030 0,03 0,00002 0,01 0,00002 0,01 0,00001 0,002
333 20,0 0,960 0,0046 0,03 0,00006 0,01 0,00002 0,01 0,00002 0,002 50
30,0 0,960 0,0095 0,07 0,00012 0,02 0,00003 0,01 0,00001 0,002
35,0 0,960 0,0160 0,09 0,00039 0,06 0,00008 0,01 0,00003 0,004
10,0 0,960 0,0044 0,03 0,00002 0,01 0,00005 0,01 0,00002 0,003
333 20,0 0,960 0,0046 0,03 0,00006 0,01 0,00004 0,01 0,00002 0,003
30,0 0,960 0,0095 0,07 0,00006 0,01 0,00014 0,02 0,00003 0,004
35,0 0,960 0,0131 0,09 0,00051 0,07 0,00015 0,02 0,00004 0,005
10,0 0,960 0,0048 0,032 0,00022 0,03 0,00005 0,01 0,00002 0,002
343 20,0 0,960 0,0114 0,074 0,00054 0,08 0,00013 0,02 0,00003 0,004
30,0 0,960 0,0133 0,096 0,00068 0,09 0,00018 0,03 0,00004 0,005
35,0 0,960 0,0086 0,062 0,00053 0,08 0,00013 0,02 0,00002 0,003
10,0 0,960 0,0021 0,015 0,00012 0,02 0,00003 0,01 0,00002 0,003
343 20,0 0,960 0,0088 0,065 0,00038 0,06 0,00012 0,02 0,00003 0,005
30,0 0,960 0,0199 0,146 0,00083 0,12 0,00025 0,04 0,00006 0,008
35,0 0,960 0,0105 0,077 0,00050 0,07 0,00015 0,02 0,00003 0,005
10,0 0,960 0,0021 0,016 0,00009 0,01 0,00002 0,01 0,00002 0,003
343 20,0 0,960 0,0087 0,064 0,00045 0,07 0,00011 0,02 0,00003 0,004
30,0 0,960 0,0117 0,086 0,00058 0,09 0,00015 0,02 0,00003 0,005
35,0 0,960 0,0062 0,046 0,00050 0,07 0,00009 0,01 0,00003 0,004
Окончание табл. 1
1 К Р, МПа & г С, г/л W х. с., % W хлор. А W хлор. В WР-кар. V, мл
г/л г/л г/л
303 10,0 0,960 0,0035 0,03 0,00013 0,02 0,00004 0,01 0,00000 0,000
20,0 0,960 0,0083 0,06 0,00017 0,03 0,00009 0,01 0,00001 0,002
30,0 0,960 0,0113 0,08 0,00043 0,06 0,00012 0,02 0,00002 0,002
35,0 0,960 0,0081 0,06 0,00019 0,03 0,00009 0,01 0,00001 0,001
303 10,0 0,960 0,0043 0,03 0,00010 0,01 0,00004 0,01 0,00001 0,001
20,0 0,960 0,0073 0,05 0,00020 0,03 0,00006 0,01 0,00001 0,001
30,0 0,960 0,0110 0,08 0,00043 0,06 0,00013 0,02 0,00002 0,003
35,0 0,960 0,0079 0,06 0,00021 0,03 0,00007 0,01 0,00001 0,001
303 10,0 0,960 0,0038 0,03 0,00008 0,01 0,00003 0,01 0,00001 0,001
20,0 0,960 0,0069 0,05 0,00025 0,04 0,00009 0,01 0,00001 0,001
30,0 0,960 0,0103 0,08 0,00032 0,05 0,00011 0,02 0,00001 0,002
35,0 0,960 0,0084 0,06 0,00016 0,02 0,00006 0,01 0,00001 0,001
В табл. 1 приняты следующие обозначения:
g - навеска сырья, г;
1 - температура экстракции, К;
Р - давление экстракции, МПа;
С - концентрация хлорофилла, определенная спектрофотометрически, г/л;
W х. с. - процентное содержание хлорофилла от абсолютно сухой навески, определенная спектрофотометрически, %;
W хлор. А, W хлор. В, W Р-кар. - процентное содержание хлорофилла А, В и бета-каротина соответственно от абсолютно сухой навески, определенная хроматографически, % и г/л;
V - объём экстракта, мл.
Содержание хлорофилла в сырье установлено методом настаивания; растворителем являлся ацетон. Навеска составляла 0,9787 (г).
Хлорофилл экстрагировался растворителем по 15 мл через 20 мин три-четыре раза, пока последняя порция ацетона не становилась бесцветной.
Концентрация хлорофилла определялась спектрофотометрически. Данные приведены в табл. 2.
Таблица 2
Определение полного содержания хлорофилла
Измерение Длина волны, нм А С, г/л С в 50 мл раствора, г W х. с., %
1 663 1,2243 0,0148 0,000741 0,10
2 663 1,1618 0,0141 0,000703 0,10
3 663 1,3022 0,0158 0,000788 0,11
Таким образом, содержание хлорофилла в образце составило 0,10 %. В табл. 3 и 4 приведены средние содержания хлорофилла, в табл. 5 - бета-каротина, в зависимости от условий экстракции.
Таблица 3
Степень извлечения хлорофилла в ходе СКФЭ
P, МПа W при T, К
303 313 333 343
10,0 27,64 61,46 24,92 20,10
20,0 53,27 64,76 33,98 65,73
30,0 77,51 48,54 63,43 105,48
35,0 57,96 55,05 93,53 104,52
Таблица 4
Степень извлечения хлорофилла, данные ВЭЖХ анализа
P, МПа W при T, К
303 313 333 343
10,0 19,71 71,65 5,15 25,53
20,0 40,19 89,90 10,78 81,84
30,0 72,82 76,41 21,75 98,71
35,0 36,05 59,61 102,91 89,61
Таблица 5
Степень извлечения бета-каротина, данные ВЭЖХ анализа
P, МПа W при T, К
303 313 333 343
10,0 0,0005 0,0041 0,0018 0,0027
20,0 0,0013 0,0043 0,0024 0,0041
30,0 0,0023 0,0053 0,0029 0,0060
35,0 0,0010 0,0038 0,0046 0,0042
Пример расчёта содержания хлорофилла, измеренного спектрофотометрически, для проб, полученных при 343 К и 20,0 МПа. Расчёт среднего отклонения для них. Сначала проведём расчет среднего арифметического содержания хлорофилла в трёх пробах из трёх параллельных опытов:
0,074 + 0,065 + 0,064 А —-----= 0,06 /.
3
Вычислим процент, который составляет данное значение от оптимально извлекаемого чистым ацетоном:
0067-100 = 65,73%
0,103 .
Среднее отклонение рассчитано по формуле:
3 I — I
- -W (3)
d = ^--, (3)
3
где - процент от оптимально извлекаемого чистым ацетоном.
В результате вычисления получим ё = 3,99 %.
Для данного значения вычислим относительную и абсолютную погрешности. Абсолютная погрешность результатов измерений: так как истинное значение неизвестно, то воспользуемся формулой [4] (значение будет аналогичное - 3,99 %)
3 , _ ,
у ш - Ш
дш = _1. (4)
3
Относительная погрешность результатов измерений:
8х = ДШ-100, (5)
Ш , ( )
3 99
5х = -399- -100 = 6,07%
65,73 , .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Работа выполнена в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Арктика» Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова. В работе установлено, что СК СО2, модифицированный 5 % этиловым спиртом, эффективно извлекает хлорофилл и р-каротин из багульника в интервале температур и давлений от 30 до 70 °С и от 100 до 350 атмосфер соответственно.
Оптимальные условия извлечения хлорофилла и бета-каротина составили: температура 343 К, давление 30,0 МПа, время 20 мин, скорость пода-
( мл ^ ( г
чи СК СО2 - 2,85 1 — 1, плотность СК СО2 - 787,6 I -
Список литературы:
1. Толмачев А.И. К познанию евроазиатских видов рода Ledum L. // В кн.: Ботанические материалы гербария Ботанич. института АН СССР. Т. 15. - М.; Л., 1953.
2. Белоусова Н.И. Состав эфирных масел багульников флоры Сибири и российского Дальнего Востока: автореф. дисс. ... канд. хим. наук. - Новосибирск, 1996.
3. Гумеров Ф.М., Сабирзянов А.Н., Гумерова Г.И. Суб- и сверхкритические флюиды в процессах переработки полимеров. - Казань: ГУП ПИК «Идел-Пресс», 2000. - 300 с.
4. Stahl E., Quirin K.W., Gerard D. Verdichtete Gase zur Extraktion und Raffination. - Berlin: Heidelberg; New York; London; Paris; Tokyo: Springer, 1987.
5. Heidi Brogle CO2 as a solvent: its properties and applications // Chamistry and Industry. - 19 June, 1982.
6. Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы. - М: Экология, 1991.
7. Кутакова Н.А., Селянина Л.И., Селянина С.Б. Анализ БАВ и древесной зелени: метод. указ. к вып. лаб. работ. - Архангельск: Изд-во АГТУ, 2003.
