CC BY
20
ИССЛЕДОВАНИЕ ИНГИБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ АМИНООЛИГОМЕРНОЙ СОЛИ "GN" ПРОТИВ МИЦЕЛИЯ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ ALTERNARIA ALTERNATA И FUSARIUM OXYSPORUMF.SP.NICOTIANAE
Николай С. Николов, Нешка Пиперкова - Аграрный Университет - Пловдив
В мировой практике защиты растений, используют широкий спектр фунгицидов (Фетваджиева и др., 1986). Некоторые из них, такие как ртутьорганические и капта-новые, высокотоксичные для теплокровных организмов, и поэтому запрещены для использования во многих странах мира (Нац. служба РЗ, 2011). Исследования Крушкова и др. (2001) доказали, что тиокарбаматные фунгициды имеют тератогенное действие. Остаточные количества некоторых фунгицидов, по словам Стоянова и др. (1999), накапливаются в овощах и фруктах, что связано с риском их потребления. Поэтому ученые и специалисты, работающие в этом направлении, начали искать альтернативные средства для защиты растений, которые обеспечивают экологически чистую продукцию растениеводства.
В последние десятилетия большое распространение, по словами МепапоБ I. (1991), получили дезинфицирующие средства из группы катионных ПАВ и прежде всего ЧАС.
Биоцидное действие ЧАС обусловлено разрушением клеточных мембран микроорганизмов, денатурацией белков и инактивацией ферментов.
Обладая такими положительными особенностями, как отсутствие запаха, низкая токсичность для теплокровных животных, наличие моющих свойств, и отсутствие биоаккумуляции в растениях, в то же время проявляют значительную активность к вегетативным формам бактерий, грибов и других микроорганизмов. Уапас^ег и др. (1991) использовали алкильаммониевые соли (Хорти Дезин, Суперкват и др.) как дезинфектанты для фитосанитарного контроля в садоводстве.
Как дезинфицирующие средства в промышлености наиболее известными ЧАС являются бензалкониум хлорид и цетил-пиридиниевый хлорид (ТишЬи, 2008).
От группы ЧАС как наиболее перспективные Иоффе и др. (1988) указывают аминополимерные соединения, как напри-
мер, поливи-нилбензилтри-метильаммоний хлорид, поли-винилпириди-ниевый хлорид и др., обладающие высокой биоцидной активностью.
Большинство из биоактивных полимеров, включая ЧАС, растворяются в воде, что является важным преимуществом для их практического применения.
Сакакушева и др. (2005) использовали некоторые ЧАС для борьбы с возбудителями коричневой пятнистости листьев у томатов - Alternaría pori.f.sp. solani.
В качестве синергетически активных смесей с фунгицидной и бактерицидной активностью используют комбинации полимерных ЧАС с некоторыми фенолами, формальдегидами, глутаровыми альдегидами и др. По словам Ланге (2005), соединения этого типа используются для дезинфекции посуды в пищевой промышленности, в борьбе с вредной микрофлорой в сельском хозяйстве, в качестве микробиоцидов для обработки воды и т. д.
Целью данной работы является получение аминополимерной соли GN, на основе ПВА и ДАБ, и исследование ее ин-гибирующего действия в условиях "in vitro" против развития мицелия возбудителей альтернариоза помидоров - Altemaria alternate (изолят А§1) и увядания табака -Fusarium oxysporum f.sp.nicotianae (изолят Fti).
Используемые сокращения:
ПАВ - поверхностно-активные вещества; ЧАС - четвертичные аммониевые соединения (соли); ПВА - поливиниловый алкоголь; ДАБ - N, №диметил-4-амино-бензалдехид; ДМСО - диметилсульфок-сид; КДА - картофельно-декстрозный агар
54
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Синтез аминополимерной соли GN
К 100 g ПВА (Merck) мольной массы 72 000, разбавленной в 400 ml дистиллированной воды, добавляют 10 мл 37% соляной кислоты (чда). Концентрация кислоты - 370 g/kg. Смесь нагревают до 323 Кик ней добавляют 20,4 g ДАБ (GFS Chemicals Inc.), растворенных в 50 ml этанола (спирта абс.) в течение 1 h. Синтез продолжается в течение 4 h при 323 К. Затем реакционную смесь охлаждают и к ней добавляют 150 ml этанола и 5 ml аммиака до рН 8-9. Полученный аминополимер осаждали добавлением 200 ml ацетона (чда). Водную фазу, содержащую ацетон, ДАБ и соль переливают. Аминополимер сушат при 378 К в продолжение 2 h. Пробы из аминополимера выделяют для 1Н-ЯМР анализа на содержание связанного азота. Потом аминополимер метилируют и допольнително кватернизируют диметил-сульфатом с чистотой 99,3% (АД "Не-охим"), добавляя сверхэквивалентное количество, при соотношении аминополимер : диметилсульфат = 1:3. Процес кватерни-зирования проводится при температуре 343-354 К в присутствии гидроксида натрия (Merck), в количестве, эквивалентном выделяемому, при реакции хлористого водорода. Диметилсульфат и водный раствор гидроксида натрия дозируется в раствор аминополимера в продолжение 1 h, поддерживая температуру в границах 343-354 К. Реакционную смесь выдерживают в продолжение 24 h. Водную фазу с солями переливают, аминополимерную ЧАС экстрагируют диэтиловым эфиром. Растворитель отгоняют и очищенный ЧАС разбавляют дистиллированной водой до концентрация 200 g/kg и сохраняют в холодильнике.
2. Анализ промежуточного аминополимера
Для характеристики промежуточного аминополимера был использован 1Н-ЯМР анализ, при помощи 1Н-ЯМР спектрофотометра "Brucker DRX", 250 MHz. В качестве растворителя был использован ДМСО. Содержание связанного азота в двух параллельных образцах аминополи-мера определяли методом Кьельдаля с аппаратом "VELP", (Сиггия С. и др., 1983).
55
3. Биотесты "in vitro"
Тестирован ингибирующий эффект аминополимерной соли GN (0,1% и
0.05%), на развитие мицелия фитопатоген-ных грибов: альтернариоза - Alternaria al-ternata (изолят Äg1 от помидоров) и увядание табака - Fusarium oxysporum f.sp.nicotianae (изолят Ft1 от табака). Опыт проводился в условиях "in vitro" методом Thornberry (Лилли и др.,1958). Были использованы семидневные культуры изоля-тов, выращенных на КДА. В качестве эталонов были использованы фунгициды хло-роталониль (Банко 500 - 0,2%) для Alternaria alternata, тиофанат метиль (Топсин 70 ВП - 0,1%) для Fusarium oxysporum f.sp.nicotianae и четвертичная соль N,N-дицетил-Ы^-диметильаммоний хлорид (Хорти Дезин 0,2%) для обоих возбудителей. Эксперимент был установлен в пяти вариантах, и каждый из них был в четырех повторностях. Развитие в термостате при температуре 296-298 К. Диаметр колоний рассчитывали на 3-й, 5-й, 7-й и 9-й день после начало тестов. Ингибирующий эффект (I,%) был отмечен по формуле:
I = P, - P • 100 P1
где: Pi - диаметр развитых колоний в контроле; Р - диаметр развитых колоний в соответствующем опытном варианте. Petrlik Styz. 1978 (Наков Б, 1982).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. 1H-NMR спектр. Интерпретация пиков:
1Н-ЯМР-спектр промежуточного аминополимера илюстрирован на рисунке 1. Пик в 9,7 ppm соответствует альдегидным протонам непрореагировавшего ДАБ, а в 7,4-7,3 ррm - ароматическим протонам, связанным с аминополимером ДАБ. Пики в 7,7 и 6,8 ppm являются спутниковыми. Пик в 5,5 ррт соответствует аце-тальному протону ДАБ, связанному с ПВА. Пик в 3,8 ррm соответствует СН-ОН протонов ПВА + вода у DMSO-d6. В 3,0 ррm - метильным группам ДАБ. В 2,48-2,5 ррт - растворитель ^MCO-d6 (дейтериран-ный). Пик в 1,0-1,9 ррт соответствует СН2 из ПВА. Из интегралов ацетального протона (5,5 ррт) и СН2 из ПВА (1,0-1,9 ррт), получается содержание ДАБ ацетальных групп - 5,3 мол. %.
Рис 1. 1Н-ЯМР-спектр промежуточного аминополимера
PPm
2.. Содержание связанного азота в аминополимере
Так как биологически активное действие полимерной ЧАС обусловлено наличием четвертичных катионов, связанных с полимерной матрицей, то определяется и содержание азота промежуточного аминополимера. Содержание связанного азота, установленного методом Кьельдаля, составляет 6,8 g/kg.
3. Ингибирующий эффект GN Экспериментальные данные биотестов иллюстрированы в таблицах №№ 1, 2. ПолуТаблица 1 - Ингибирующий эффект (I) GN против развития мицелия альтернариоза
------------- )
ченные результаты (табл.1) показывают, что при варианте (I) - 0,1% GN, ингибирующий эффект на развитие мицелия возбудителя альтернариозы - Alternaría al-ternata был 100%.
При вариант II - 0,05% GN, ингибирующий эффект 83,3%, сопоставим с эталоном Хорти Дезин, применяемым в концентрации 0,2% - 88,7%. По сравнению с ингибирующим действием эталона Банко 500 (0,2%) - 65%, эффективность GN (II) на 8,3% выше (табл.1),
№ Вариант Конц. Alternaría alternata (изолят Ag1)
(%) Диаметр колоний после дней, mm I (%)
3-й 5-й 7-й 9-й
1 Контроль - 21,5 64,0 76,0 80,0 0,0
2 Банко 500 0,2 - 15,3 21,0 28,0 65,0
3 Хорти Дезин 0,2 - 7,0 7,0 9,0 88,7
4 GN(I) 0,1 - - - - 100
5 GN (II) 0,05 - 13,5 13,5 13,5 83,3
Ингибирующии эффект GN, (вариант I - 0,1%) на развитие мицелия Fusarium ox-ysporumf.sp.nícotíanae (табл.2) был 100%.
В варианте (II) - 0,05% ОЫ, установлена эффективность 80,2% которая соразмерна с эффективностью эталонов Топсин 70 ВП -84,2% и Хорти Дезин - 83,8 %.
Таблица 2 - Ингибирующии эффект (I) GN против развития мицелия увядание табака (Fusarium
№ Вариант Конц. (%) Fusarium oxysporum f.sp.nicotianae, изолят R-,
Диаметр колоний после дней, mm I (%)
3-й 5-й 7-й 9-й
1 Контроль - 21,3 60,1 73,6 81,4 0,0
2 Топсин70 ВП 0,1 - 11,3 12,1 12,1 84,2
3 Хорти Дезин 0,2 - 7,0 10,0 13,0 83,8
4 GN(I) 0,1 - - - - 100
5 GN (II) 0,05 7,0 12,8 14,0 16,0 80,2
56
Анализ полученных результатов двух биотестов показывает, что ингибирующии эффект полимерной ЧАС "ОК" зависит от его концентрации. Ингибирующии эффект 100% регистрирован еще при концентрации 0,1%, а при 0,05% эффективность по отношению ин-гибирования мицелия обоих возбудителей ближе к эффективности, установленной по эталонам Топсин70 ВП, Банко 500 и Хорти Дезин, применяемым в более высоких концентрациях - 0,1% и 0,2%.
После завершения биотестов, часть от обоих грибных мицелиев помещается в чистую среду (КДО), в котором мицелий вырос на вес чашки Петри. Это доказывает, что препараты Хорти Дезин и ОЫ имеют фунгистати-ческое действие.
При выборе соответствующего фунгицида следует иметь в виду его эффективность, рыночную цену, токсичность и биоразлагае-мость, связанные с его воздействием на окружающую среду. С учетом ценных качеств и преимуществ ЧАС, приведенных в обзоре литературы и в полученных результатах исследований, можно сказать, что они являются
прекрасной альтернативой фунгицидов, используемых для защиты томатов от альтер-нариоза и табака от увядания.
Выводы
1. Аминополимерная соль GN в концентрации 0,1% ингибирует вполне (100%) развитие мицелия возбудителя фитопатоген-ных грибов альтернариоза и увядание табака -Alternaria alternate и Fusarium oxysporum f.sp.nicotianae, а при концентрации 0,05% эффективность GN II в пределах 80,2%-83,3%.
3. Используемая в качестве эталона четвертичная соль N, Ы-дицетил-N, N-диметильаммоний хлорид (Хорти Дезин 0,2%) имеет высокий ингибирующии эффект к мицелию возбудителя альтернариоза и увяданию табака в границах 83,3%-88,7%.
2. Результаты биотестов показывают высокий фунгистатичный эффект GN и Хорти Дезин и требуют дальнейших исследований в лабораторных и полевых условиях, против воздействии указанных микроорганизмов и других возбудителей экономически значимых заболеваний растений.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Б. С. Иоффе, Е. Л. Бабаян, Р. Е. Злотник, Синтез и применение катионных ПАВ, Москва, Химия, , с.24-27,1988 г.
2. Крушков Ив., Ив. Ламбев, Фармако-терапевтичен справочник, Медициною изд. "Арсо", София, . с.547, 2001 г.
3. Ланге К. Р. Поверхностно-активные вещества. Синтез, свойства, анализ, применение, изд.Профессия, Москва,, с.5-32, 2005 г.
4. Национална Служба РЗ, Списък на разрешените за предлагане на пазара и употре-ба продукти за РЗ, торове, мелиоранти и биологично активни вещества. София, 2011 г.
5. Сакакушева К., Д.Христова, Проуч-ване инхибиращото въздействие на някои ал-терн-ативни фунгицидни препарати спрямо причинителя на кафявите листни петна по до-матите, Юбил. научна конференция "Състоя-ние и проблеми на аграрната наука и образование", Науч. Тр. АУ Пловдив, т. I, кн.6, 351354, 2005 г.
6. Сиггия С, Дж.Ханна, Количественный анализ органических соединений по функциональным группом, Москва, Химия, 1983.
7. Стоянов С., И.Алтънкова, Химически вещества в околната среда - токсично ув-
реждане на черния дроб и имунната система, изд. "Пенсофт" София, с.28-33,1999 г.
8. Фетваджиева, Н. В. Страка, П. Михайлова, И. Балинов, Я. Любенов, А. Балинова, В. Пелов, В. Карова, Д. Цветков, Справочник по пестицидите, София, Земиздат, 1994 г.
9. Junshu L. Synthesis, Characterization and Application of High Potency Antimicrobial Colorants, Agricultural and Environmental Chemistry, US, p.7-15, 2008
10. J.W.Hopton, E.C.Hill, Industrial Microbiological Testing, Blackwell Sc. Publ., Society for Applied Bacteriology, Technical Series 23, US , 1987
11. Merianos J.J. Quaternary ammonium antimicrobial compounds. In: Block S.S., editor. Disinfection , sterilisation and preservation, Philadelphia: Lea & Febiger;. p. 225-255, 1991
12. Petrlik Styz., 1978, цитирован в: НаковБ., диссертация, София, 1981 г.
13. Vanachter, A., M.Vangheel, С. Van Asche, E. Van Wambeke, Screening of some alternative disinfectants for general sanitary use in intensive horticulture, Fac. Landbow Rijks, Univ. Gent, 56, 3, 1991.
57
