CC BY
52
© коллектив авторов, 2013
УДк 616.65-007.61-092:612.018:577.175.62]-07
А.А. Отпущенников1, Е.П. Хвостова2, С.Э. Красильников3,4, Л.Ф. Гуляева2,4
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ-ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА АНДРОГЕНОВ ПРИ ДОБРОКАЧЕСТВЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИИ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
1Центральная клиническая больница СО РАН, Новосибирск; 2ФГБУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН; 3областной онкологический диспансер, Новосибирск; 4Новосибирский государственный университет
Доброкачественная гиперплазия простаты (ДГП) продолжает оставаться одной из важнейших проблем современной урологии. Нами была изучена экспрессия генов-ферментов метаболизма андрогенов, участвующих в синтезе андрогенов, непосредственно в органах-мишенях у 20 больных ДГП при помощи ПЦР в реальном времени. Выявлено достоверное увеличение уровня мРНК генов HSD17B3 ~ в 1,7раза, SRD5A2 ~ в 2 раза, HSD3B1 ~ в 2раза, STS ~ в 2,3 раза иЛК ~ в 2,5 раза и снижение HSD17B2~ в 4 раза в образцах гиперплазии по сравнению с участками неизмененной простаты.
Ключевые слова: доброкачественная гиперплазия простаты; андрогеновый рецептор; ферменты метаболизма андрогенов
В России доброкачественная гиперплазия простаты (ДГП) продолжает оставаться одной из важных проблем современной урологии. Это связано прежде всего с большой распространенностью данного заболевания. ДГП встречается у 60% мужчин в возрасте 60 лет и старше и у 80% пациентов после 80 лет [1]. Дистальные симптомы мочевыводящих путей (LUTS - lower urinary tract symptoms), обусловленные нарушением оттока мочи из мочевого пузыря вследствие сдавле-ния уретры гиперплазированной простатой, отмечаются, по данным разных авторов, у 15-60% мужчин в возрасте старше 40 лет [14]. Причины возникновения ДГП многообразны и окончательно не выяснены. В патогенезе данного заболевания основное место отводится нарушению гормонального баланса, что является критическим в изменении активности и количества стероидных рецепторов, воспринимающих гормональные сигналы [18]. Несмотря на то что количество общего тестостерона (T) в крови с возрастом снижается, его концентрация внутри тканей остается на прежнем уровне, что свидетельствует о местной или интракринной продукции андрогенов [12].
В последнее время большое распространение получила теория локального синтеза андрогенов в тканях простаты in situ [12]. Различная экспрессия генов-ферментов метаболизма стероидных гормонов в опухолях определяет успех в разработке таргетных противоопухолевых препаратов, основанных на ин-гибировании стероидогенных ферментов [12]. Таким образом, изменение активности ферментов в тканях простаты может приводить к увеличению концентрации активных андрогенов in situ, что может повышать не только риск развития опухолевого заболевания в органе-мишени андрогенов, но и приводить к формированию резистентных форм рака простаты. Поэтому выявление изменений в экспрессии генов, ответственных за метаболизм андрогенов, является важным фактором выбора адекватного лечения, а также прогностическим фактором.
Материалы и методы. Для определения уровня экспрессии генов, вовлеченных в синтез и метаболизм гормонов, использовали ткань больных (n=20) из зоны опухолевого очага, удаленную в ходе хирургического вмешательства. Нормальными образцами считали ткань железы из наименее измененных удаленных участков одного и того же пациента (n=20). Операционный материал получали в Центральной клинической больнице СО РАН. Забор образцов проводился врачом урологического отделения А.А. Отпущенникова (см. таблицу).
Для корреспонденции:
Хвостова Екатерина Петровна, науч. сотр. лаб. мол. механизмов канцерогенеза
Адрес: 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2 E-mail: ivanovakatysha@mail.ru
Эксперименты соответствовали этическим стандартам биоэтического комитета ГУ НИИМББ СО РАМН, разработанным в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными приказом Минздрава РФ № 266 от 19.06.03 r. Все лица, участвующие в исследовании, дали письменное информированное согласие на участие в исследовании. Сразу после получения биоптата образец ткани опухоли помещали в емкость с жидким азотом до процедуры выделения РНК. Образец считали пригодным для исследования, если количество опухолевых клеток в образце превышало 60%.
Выделение суммарной РНК из образцов и ДНКазную обработку проводили с использованием наборов Qiagen (Rneasy Lipid Tissue® Mini Kit и RNase-Free DNase Set соответственно, "Qiagen") согласно рекомендациям производителя. Количество РНК в пробе определяли спектрофотометрическим методом. Качественный анализ выделенной РНК проводили путем электрофоретического разделения в 1,5% агарозном геле.
Для определения уровня экспрессии исследуемых генов проводили ПЦР в режиме реального времени с использованием Maxima SYBR Green qPCR Master Mix ("Fermentas") на амплификаторе IQ5 ("Bio-Rad Laboratories"). В качестве гена сравнения использовали «ген домашнего хозяйства» b-actin или GAPDH. В работе использовали праймеры для генов: HSD3B1, HSD17B2, HSD17B3, AKR1C3, AKR1C2, SRD5A2, STS, UGT2B17 и AR [11]. Каждую ПЦР, содержащую 1 мкл кДНК, проводили в объеме 25 мкл в следующих условиях: 95°С - 3 мин, 95°С - 15 с (40 циклов), 58°С - 20 с, 72°С -20°С. Для контроля специфичности ПЦР использовали кривые плавления и гель-электрофорез. В каждом эксперименте на один планшет помещали образцы исследуемых кДНК с праймерами на целевые гены и ген сравнения (по 3 повтора). Параметры ПЦР рассчитывали по дозозависимым кривым: эффективность реакции не менее 90%, коэффициент корреляции не менее 0,98, наклон кривой (slope) 3,4±0,4.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы MedCalc, значение р<0,05 считали статистически значимым. Среднее, ошибка среднего, достоверность различий между двумя параметрами рассчитывали по критерию Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение. Нами исследована группа ферментов, участвующих в синтезе и метаболизме андрогенов в периферических тканях, т. е. непосредственно в стромальном и эпителиальном компоненте простаты.
При исследовании экспрессии генов в образцах тканей от пациентов с диагнозом ДГП наблюдали достоверное увеличение экспрессии HSD17B3 ~ в 1,7раза (p=0,0378), SRD5A2 ~ в 2 раза (¿=0,0115), HSD3B1 ~ в 2 раза (p=0,0366), STS ~ в 2,3 раза
БИОМАРКЕРЫ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ ПАТОЛОГИИ
Клиническая характеристика больных с доброкачественной гиперплазией простаты (n = 20)
Возраст, годы ИМТ ПСА, нг/мл V простаты, мл
58 33,9 33,01 105
74 29,4 15,07 114
73 28,8 - 74
66 25,9 7,42 46
79 22,9 4,6 122
83 22,7 - 102
62 22,6 10,69 99,7
73 21,3 1,75 79
61 22,9 8,01 49
71 20,7 3,1 50
77 25,4 - 40
72 36,6 7,17 85
71 23,8 4,3 50
83 25,4 30,5 235
74 20,71 8 125
63 27,7 6 151
62 26,9 18 111
75 25,9 - 66
63 22,3 16 24,8
65 30,4 18 41
(р=0,0366) и АЯ ~ в 2,5 раза (¿>=0,0011) в сравнении с участками неизмененной простаты.
Фермент 3р-гидроксистероиддегидрогеназа 1(HSD3B1) экс-прессируется базальными эпителиальными клетками простаты и является важным компонентом пути метаболизма ан-дрогенов. HSD3B1 катализирует реакцию превращения де-гидроэпиандостерона (ДГЭА) в андростендион [4], а также принимает участие в биосинтезе Т и может инактивировать ДГТ в самой железе [7]. Образовавшийся андростендион является дальнейшим субстратом для образования активных форм андрогенов, а также эстрогенов, роль которых в опухолевых процессах простаты активно обсуждается [8].
Показано, что количество белка фермента HSD3B1 увеличивается у взрослых мужчин по сравнению с уровнем белка в пубертатном и постпубертатном возрасте [2]. Учитывая тот факт, что ДГП чаще всего развивается у мужчин в возрасте после 50 лет, изменение экспрессии HSD3B1 является одним из факторов риска развития опухолевого процесса в простате. Кроме того, на активность фермента может влиять увеличение количества субстрата - ДГЭА, который образуется из де-гидроэпиандостеронсульфата (ДЭАС) [3]. Этот «слабый» ан-дроген может конвертироваться в более активные стероиды во многих тканях, в том числе в простате, при помощи фермента стероидной сульфатазы (STS). Несмотря на то что количество образуемого таким образом Т невелико, в тканях-мишенях это может оказывать значительное влияние для поддержания роста опухолевых клеток. Количество циркулирующего в крови ДЭАС примерно в 100 раз выше уровня Т [5]. Отношение концентраций ДГЭА/ДЭАС в плазме коррелирует с повышенным риском развития рака простаты (РП) и других злокачественных новообразований. Следовательно, сульфаты стероидов являются как метаболитами, экскретируемыми из организма с мочой, так и важным источником потенциально активных стероидов. В нашем исследовании мы показали достоверное увеличение уровня мРНК гена STS.
Основным ферментом, превращающим андростендион в Т в клетках Лейдига, является 17р-гидрокси-
стероиддегидрогеназа-3 (HSD17B3) [10]. Увеличение активности данного фермента приводит к увеличению Т, который, в свою очередь служит предшественником ДГТ - наиболее активного андрогена [12].
Увеличение экспрессии гена 5а-редуктазы (SRD5A2) приводит к увеличению концентрации ДГТ in situ [5]. В крови здоровых мужчин содержание ДГТ в 2-6 раз ниже, чем Т, тогда как в тканях простаты наблюдается обратная картина [16]. Показано, что ДГТ непосредственно контролирует деление клеток и способствует пролиферации эпителия простаты, что может приводить к ее железистой гиперплазии. Более того, ДГТ имеет гораздо большее сродство к AR (Kd Т - 10-9 М; Kd ДГТ - 10-11 М). Несмотря на то что с возрастом количество тестостерона значительно снижается, уровень ДГТ в простате остается постоянным, что свидетельствует о вну-триопухолевом синтезе андрогенов [12].
При исследовании ферментов метаболизма андрогенов было выявлено достоверное снижение экспрессии HSD17B2 в ДГП по сравнению с контролем. Известно, что данный фермент катализирует реакции инактивации андрогенов [13]. Таким образом, снижение его активности приводит к более активному образованию андрогенов.
Достоверных изменений в экспрессии генов AKR1C2, AKR1C3, UGT2B17 выявлено не было, однако отмечено снижение уровня мРНК данных ферментов в опухолевых образцах. Альдокеторедуктаза (AKR1C2) - фермент, инак-тивирующий ДГТ в простате, конвертирующий его в 5а-андростан-3р,17р-диол (3р-андростандиол), который в свою очередь является лигандом для ERp либо экскретируется из организма под действием уридин-дифосфатглюкуронозил трансферазы (UGT) [9]. Таким образом, при снижении экспрессии данного гена и гена UGT2B17 увеличивается количество ДГТ. Показано, что в клетках, имеющих сниженный уровень экспрессии генов UGT2B15 и UGT2B17, отмечается увеличение экспрессии генов-мишеней AR [8].
Кроме того, отмечено достоверное увеличение экспрессии гена AR, ключевой молекулой в восприятии гормонального сигнала и передаче его генам-мишеням. В подавляющем числе опухолей простаты именно AR ответствен за стимуляцию пролиферации опухолевых клеток и является митогенным фактором, поддерживающим рост опухолей [17]. В последнее время показано, что активация AR может модулировать транскрипцию многих генов, часть из которых участвует в регуляции жизненного цикла клетки [15].
Таким образом, в случае опухолевой трансформации тканей простаты наблюдаются изменения как в системе метаболизма андрогенов, так и на уровне регуляции AR. Можно предположить, что изменения в системе метаболизма ан-дрогенов в сторону увеличения экспрессии генов основных ферментов, которые приводят к образованию более активных форм андрогенов, ведут к первоначальным изменениям в клетках простаты, что в свою очередь ведет к ее доброкачественной гиперплазии. Дальнейшие изменения клеточной пролиферации, злокачественная трансформация и поддержание опухолевого роста происходят за счет других механизмов, вероятнее всего, связанных с AR, которые являются основными регуляторами клеточной пролиферации.
Работа поддержана грантом РФФИ № 12-04-31587.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абдурахманов А.К., Кувакин В.И. Клинико-эпидемиологические особенности доброкачественной гиперплазии предстательной железы в Набережных Челнах. Общественное здоровье и здравоохранение. 2007; 1: 30-4.
2. Almeida J., Conley A.J., Mathewson L., Ball B.A. Expression of steroidogenic enzymes during equine testicular development. Reproduction. 2011; 141 (6): 841-8.
3. Basu S., TindallD. Androgen action in prostate cancer. Horm. Cancer. 2010; 1 (5): 223-8.
4. Chang B., Zheng S., Hawkins G., Isaacs S., Wiley K., Turner A. et al. Joint Effect of HSD3B1 and HSD3B2 Genes Is Associated with
Hereditary and Sporadic Prostate Cancer Susceptibility. Cancer Res. 2002; 62 (6): 1784-9.
5. Cai C., BalkS. Intratumoral Androgen Biosynthesis in Prostate Cancer Pathogenesis and Response to Therapy. Endocr. Relat. Cancer. 2011; 18 (5): 175-82.
6. Chumsri S., Howes T., Bao T., Sabnis G., Brodie A. Aromatase, Aro-matase Inhibitors, and Breast Cancer. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2011; 125: 13-22.
7. Hu D., Mackenzie P. Forkhead box protein A1 regulates UDP-glucuronosyltransferase 2B15 gene transcription in LNCaP prostate cancer cells. Drug. Metab. Dispos. 2010; 38 (12): 2105-9.
8. Ho S.M., Lee M.T., Lam H.M., Leung Y.K. Estrogens and prostate cancer: etiology, mediators, prevention, and management. Endocrinol. Metab. Clin. North. Am. 2011; 40 (3): 591-614.
9. Ji Q., Chang L., Stanczyk F.Z., Ookhtens M., Sherrod A., Stolz A. Impaired dihydrotestosterone catabolism in human prostate cancer: critical role of AKR1C2 as a pre-receptor regulator of androgen receptor signalling. Cancer Res. 2007; 67 (3): 1361-9.
10. Li J., Ding Z., Wang Z., Lu J., Maity S., Navone N., Logothetis C., Mills G. Androgen regulation of 5a-reductase isoenzymes in prostate cancer: implications for prostate cancer prevention. PLoS. One. 2011; 6 (12): 28840.
11. Montgomery R., MostaghelE., VessellaR., HessD., Kalhorn T., Hi-gano C. et al. Maintenance of intratumoral androgens in metastatic
prostate cancer: a mechanism for castration-resistant tumor growth. Cancer Res. 2008; 68 (11): 4447-54.
12. Penning T.M. New frontiers in androgen biosynthesis and metabolism. Cur. Opin. Endocrinol. Diabetes Obesit. 2010; 17: 233-9.
13. Pfeiffer M.J., Smit F.P., Sedelaar J.P., Schalken J.A. Steroidogenic enzymes and stem cell markers are upregulated during androgen deprivation in prostate cancer. Mol. Med. 2011; 17 (7-8): 657-64.
14. Parsons K.J. Benign Prostatic Hyperplasia and Male Lower Urinary Tract Symptoms: Epidemiology and Risk Factors. Curr. Bladder Dysfunct. Rep. 2010; 5: 212-8.
15. Rotinen M., Celay J., Alonso M., Arrazola A., Encio I., Villar J. Estradiol induces type 8 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase expression: crosstalk between estrogen receptor alpha and C/EBPbeta. J. Endocrinol. 2009; 200 (1): 85-92.
16. Senggunprai L., Yoshinari K., Yamazoe Y. Selective role of sulfo-transferase 2A1 (SULT2A1) in the N-sulfoconjugation of quinolone drugs in humans. Drug. Metab. Dispos. 2009; 37 (8): 1711-7.
17. Shiota M., Yokomizo A., Naito S. Increased androgen receptor transcription: a cause of castration-resistant prostate cancer and a possible therapeutic target. Mol. Endocrinol. 2011; 47 (1): 25-41.
18. Vaucher L., Paduch D.A., Jichlinski P. Testosterone and prostate. Med. Suisse. 2011; 7 (320): 2399-400.
Поступила 01.07.13
© коллектив авторов, 2013
УДК 616.314.17-002.2:615.46]-07:616.31-008.831
Е.А. Соловых, Т.Б. Караогланова, Н.Е. Кушлинский, О.О. Янушевич
МАТРИКСНЫЕ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ И ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЦИТОКИНЫ В РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫМ ПАРОДОНТИТОМ С РАЗЛИЧНЫМИ КОНСТРУКЦИОННЫМИ МАТЕРИАЛАМИ РЕСТАВРАЦИЙ ЗУБОВ И ЗУБНЫХ РЯДОВ
ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова Минздрава РФ
Представлены результаты сравнительного иммуноферментного исследования содержания матриксных металлопротеиназ (ММП) 2, 8, 9, интерлейкинов (ИЛ) 1в и 6, тканевых ингибиторов ММП (ТИМП-1, ТИМП-2) и фактора некроза опухоли а (ФНОа) в ротовой жидкости практически здоровых людей с интактным пародонтом и больных хроническим генерализованным пародонтитом с различными конструкционными материалами реставраций зубов и зубных рядов. Выявлено, что ММП-9 в ротовой жидкости может служить маркером хронического генерализованного пародонтита независимо от наличия или отсутствия металлических реставраций зубов и зубных рядов. Уровень ММП-8 повышен относительно нормы только в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом с металлическими реставрациями. Характер корреляционных взаимосвязей между исследованными показателями в различных группах пациентов свидетельствует об относительной схожести регуляции процессов секреции ММП, ИЛ и ТИМП в ротовой жидкости у людей с интактным пародонтом. У пациентов с воспалительно-деструктивными заболеваниями пародонта, как с металлическими реставрациями зубов и зубных рядов, так и без таковых выявленные корреляционные коэффициенты свидетельствуют о возникновении целого каскада биохимических реакций, сопровождающихся активацией продукции цитокинов в ответ на воздействие этиологических факторов. Более выраженную реакцию наблюдали в группе пациентов с пародонтитом и металлическими ортопедическими конструкциями. Наличие в полости рта этих пациентов ортопедических конструкций из хромокобальтового или хромонике-левого сплавов ведет к увеличению содержания ММП-2, ИЛ-1в и ИЛ-6 в ротовой жидкости.
Ключевые слова: пародонтит; матриксные металлопротеиназы 2, 8, 9; ИЛ-1в; ИЛ-6; ФНОа; ротовая жидкость; конструкционные материалы
В клинической оценке степени тяжести заболевания и формировании групп пациентов с повышенным риском возникновения и прогрессирования пародонтита, а также появления необратимых деструктивных изменений могли бы оказать современные неинвазивные молекулярно-биохимические методы исследования состояния пародонта [1, 2].
Для корреспонденции:
Кушлинский Николай Евгеньевич, д-р мед. наук, проф., член-корр. РАМН, зав. лаб. клин. биохимии Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24 E-mail: biochemia@mtu-net.ru
Протеолитическая деградация коллагена I типа считается одним из ключевых факторов неконтролируемого разрушения внеклеточного матрикса (ВКМ) пародонта [3, 4]. Коллагеноли-тическая активность присуща в первую очередь матриксным металлопротеиназам (ММП) - представителям мультигенного семейства, состоящего из более 20 цинкзависимых эндопепти-даз, субстратами которых, помимо большинства компонентов ВКМ, могут быть также другие протеазы, хемотаксические молекулы, латентные формы факторов роста, растворимые и мембранно-ассоциированные белки, связывающие факторы роста, цитокины [5, 6]. Активность ММП в межклеточном пространстве специфически подавляется тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (ТИМП) - структурно родственны-
