CC BY
68
№ 4 - 2013 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 577.175.722:615.038
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ
ПЕРОРАЛЬНОГО НАНОКОМПОЗИТНОГО ПРЕПАРАТА
ИНСУЛИНА
12 3 1 1^1
К. И. Ершов ' , А. А. Серяпина , В. В. Спиридонов , Е. М. Парыгина , Э. В. Редозубов
1ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава
России (г. Новосибирск) 2ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН (г. Новосибирск)
3 ^
ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологий» (г. Новосибирск)
Целью данного исследования было определение особенностей всасывания пегилированного инсулина (ПИ), меченного FITC. Были использованы такие методы, как инкубация ткани в камере Уссинга, конфокальная микроскопия образцов, полученных в результате эксперимента in situ, введение ПИ крысам с аллоксановым диабетом I типа. Полученные данные свидетельствуют о том, что ПИ обладает высоким уровнем биоадгезии, высокой скоростью и большой площадью абсорбции, устойчивостью к разрушению ферментами желудочно-кишечного тракта, а также эффективно снижает уровень глюкозы в крови у животных с аллоксановым диабетом.
Ключевые слова: инсулин, пегилирование, всасывание, тощая кишка, аллоксановый диабет.
Ершов Константин Игоревич — кандидат биологических наук, ассистент кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», старший научный сотрудник лаборатории лимфотропной терапии и лимфодиагностики ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН, e-mail: ershov_k@bk.ru
Серяпина Алиса Алексеевна — инженер-химик ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологий», e-mail: 1broadsword@mail.ru
Спиридонов Василий Васильевич — студент 4-го курса стоматологического факультета ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: ershov_k@bk.ru
Парыгина Евгения Михайловна — студент 4-го курса стоматологического факультета ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: ershov_k@bk.ru
Редозубов Эдуард Витальевич — студент 4-го курса стоматологического факультета ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: ershov_k@bk.ru
Введение. По данным ВОЗ, сахарный диабет признан неинфекционной эпидемией конца XX — начала XXI века, он занимает третье место по распространенности после сердечнососудистых и онкологических заболеваний и представляет собой серьезную медико-социальную проблему. К его осложнениям относятся такие патологии, как гипогликемическая кома; диабетический кетоацидоз; диабетическая ретинопатия, которая может привести к полной потере зрения; диабетическая нефропатия; диабетическая нейропатия (так называемая диабетическая стопа) [5].
Широко используемые для лечения сахарного диабета инъекционные препараты инсулина обладают физико-химической нестабильностью, врожденной иммуно- и антигенностью и достаточно быстрым клиренсом из большого круга кровообращения. Изменение стереохимической структуры у белковых препаратов путём присоединения к ним инертных полимеров приводит к изменению их физико-химических свойств и появлению у них новых эффектов. Одним из вариантов получения подобного рода субстанций является реакция пегилирования — присоединения молекул полиэтиленгликоля к белковым и пептидным соединениям с помощью технологии электронно-лучевого синтеза. В ходе проведения токсикологических исследований различных препаратов, получаемых с помощью этой технологии, во всех случаях было показано отсутствие общей и специфических видов токсичности, свидетельствующее об их высокой безопасности [1].
Кроме того, пегилирование предоставляет широкие возможности для перорального применения белковых препаратов, поскольку позволяет повысить их биодоступность, обычно низкую из-за большой молекулярной массы, чувствительности к рН среды, ферментативного расщепления в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) и других физико-химических свойств белков и пептидов. Пероральное введение инсулина гораздо предпочтительнее практикуемого в настоящее время инъекционного ввиду удобства и простоты осуществления, неинвазивности метода и возможности пролонгации действия инсулина.
Целью данного исследования было определение особенностей всасывания и устойчивости к разрушению ферментами ЖКТ нанокомпозитного полимера инсулина, меченного FITC. В работе использовали 6-месячных самцов крыс Wistar с массой тела 200-250 г.
Материалы и методы. Камера Уссинга. В данном исследовании была использована разработанная нами методика инкубации ткани тонкой кишки в камере Уссинга [2]. Фрагмент кишки с двух сторон находился в растворах: с серозной стороны в культуральной среде Лейбовица (L15); со слизистой — раствор 4,5 мкМ инсулина, меченного FITC, в L15. Инкубация длилась в течение 20, 40 и 60 мин. По окончании инкубации с обеих сторон собирались полученные растворы. Их флуоресценцию определяли на флуориметре F-3000 (Hitachi, Япония). Количество инсулина определялось по калибровочным кривым. Биоадгезией считали потерю инсулина, находящегося в ткани тонкого кишечника либо на ее поверхности. Масса биоадгезивного инсулина (те) рассчитывалась по формуле:
те = ти - т,
(ти — масса инкубационного инсулина, та — масса абсорбированного инсулина) с учетом автофлуоресценции.
Конфокальная микроскопия. Для получения конфокальных снимков ткани кишки проводился эксперимент in situ [3]. Для перфузии использовали фосфатно-солевой буфер (ФСБ) c 23,0 мкМ инсулина, меченного FITC. После инкубации в течение 1 ч при постоянной температуре 37,7 ± 1,0 °С вырезали фрагмент дистального отдела тощей кишки, фиксировали его в течение 40 мин в 4 % формалине при 4 °С, промывали в растворе ФСБ и замораживали при —20 °С. Затем фрагменты ткани нарезали на криостате. Дальнейшие исследования проводили на приборе LSM 510 META (Zeiss, Германия) методом конфокальной микроскопии с использованием фильтров BP 505-530, LP 615.
Аллоксановый диабет. Животным однократно вводили аллоксан в дозе 17 мг/100 г массы тела внутрибрюшинно через 18-19 ч после кормления. На 3-5-е сутки у крыс развивался сахарный диабет I типа. Для подтверждения диабета проводили тест на толерантность к глюкозе, для чего животным внутрибрюшинно вводили 0,5 г D-глюкозы на 100 г массы тела и через 3 ч после инъекции измеряли содержание глюкозы в крови (тест-полоски One Touch Ultra), взятой из хвостовой вены [4].
Крысам с аллоксановым диабетом I типа перорально однократно вводили дистиллированную воду, инсулин и модифицированный инсулин (20 МЕ в 2 мл на животное) для оценки влияния препаратов на уровень глюкозы в крови.
Статистическая обработка результатов включала подсчет среднеарифметических значений (M) и их ошибки (m). Для выявления достоверности полученных значений применяли тест множественных сравнений Дункана (Duncan's test, ANOVA) с использованием пакета компьютерных программ Statistica 6.0. Отличия считали достоверными при р < 0,05.
Результаты исследования. В ходе эксперимента in vitro (камера Уссинга) установлено, что пегилированный инсулин обладает высокой биоадгезией к ткани стенки тощей кишки (рис. 1B), в 4 раза превышающей биоадгезию немодифицированного инсулина (после инкубации в течение 60 мин изолированного фрагмента кишки в камере Уссинга при 37 °С). Также in vitro показано, что нанокомпозитный препарат обладал высокой скоростью всасывания и начинал проникать в раствор с серозной стороны уже к 20 мин эксперимента (рис. 1А), в то время как у немодифицированного инсулина фиксировалось только следовое присутствие. В процессе инкубации в течение всего эксперимента скорость всасывания у обоих препаратов постепенно нарастает, но более интенсивно у модифицированного инсулина. Через 1 ч инкубации абсорбция пегилированного инсулина в 4 раза выше, чем у немодифицированного.
Рис. 1. Особенности всасывания препаратов инсулина; А — скорость всасывания препаратов инсулина; В — биоадгезивные свойства препаратов к ткани стенки тонкой кишки; * — р < 0,05 отличия по сравнению с более ранней временной точкой; # — р <
0,05 отличия между препаратами
Снимки, полученные с помощью конфокальной микроскопии (эксперимент ¡тИп), позволяют получить наглядное представление о степени и особенностях абсорбции препарата (рис. 2). На снимках хорошо различима внутренняя строма ворсин, светящаяся в красном диапазоне, что подтверждает жизнеспособность и целостность лимфатических и капиллярных сосудов, тканей кишки в процессе операции. Слабая автофлуоресценция отмечается по всей длине ворсин слизистой оболочки в зеленом и красном спектре (рис. 2А). FITC обеспечивает зеленое свечение меченных им препаратов инсулина. Так, при инкубации обычного инсулина, меченного FITC, видна адсорбция лишь на апикальном полюсе кишечных ворсин (рис. 2В), в то время как пегилированный инсулин активно адсорбируется на всей поверхности кишечной ворсины (рис. 2С).
Рис. 2. Конфокальные снимки после 1 ч инкубации растворов в тонкой кишке крыс (in vivo); А — фосфатно-солевой буфер; B — инсулин, меченный FITC; C —
пегилированный инсулин с FITC
Стоит отметить, что проведенные в данной работе эксперименты in vitro и in situ являются идеальной моделью, которая подразумевает отсутствие агрессивных факторов воздействия на белковые препараты (ферментов желудка и начальных отделов тонкой кишки, резкой смены pH среды). Поэтому требовался эксперимент in vivo, чтобы смоделировать реальные физиологические условия всасывания препаратов в ЖКТ. Так, при пероральном введении нанокомпозитного препарата отмечалось снижение уровня глюкозы в крови у крыс с аллоксановым диабетом I типа на 50 % уже через час после введения, уровень глюкозы сохранялся в течение всех 4 часов наблюдения (рис. 3). Внутрижелудочное введение воды и немодифицированного инсулина не вызывало снижения уровня глюкозы.
Рис. 3. Уровень глюкозы в крови у крыс с аллоксановым диабетом; * — р < 0,05 отличия по сравнению с более ранней временной точкой; # — р < 0,05 отличия между препаратами
Выводы. Таким образом, полученные результаты позволяют утверждать, что пегилированный инсулин (по сравнению с непегилированным) обладает следующими свойствами:
^ ^ 2
1. высокой биоадгезивной способностью (0,08 ± 0,01 мг/см за 1 ч);
о
2. высокой скоростью абсорбции (117,91 ± 27,35 пто1/см за 1 ч), начинает всасываться с 20 мин эксперимента (50,74 ± 12,31 пто1/см2);
3. адсорбируется по всей длине кишечной ворсины;
4. устойчив к разрушению ферментами ЖКТ;
5. эффективно снижает уровень глюкозы в крови в экспериментальной модели сахарного диабета I типа (аллоксановый диабет).
Список литературы
1. Фармакологические свойства пегилированного с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза соматотропина / А. М. Дыгай [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 2012. — Т. 153, № 2. — С. 232-234.
2. Ершов К. И. Изучение механизмов всасывания флуоресцеина в тощей кишке у крыс Wistar / К. И. Ершов, А. А. Серяпина // Вестн. Новосибирского государственного университета. Серия : Биология, клиническая медицина. — 2012. — Т. 10, вып. 3. — С. 19-23.
3. Исследование пути всасывания флуоресцеина из тощей кишки крыс Wistar в систему «кровь-лимфа» / К. И. Ершов, В. В. Асташов, О. В. Казаков [и др.] // Вестн. Новосибирского государственного университета. Серия : Биология, клиническая медицина. — 2012. — Т. 10, вып. 4. — С. 41-46.
4. Пальчикова Н. А. Количественная оценка чувствительности экспериментальных животных к диабетогенному действию аллоксана / Н. А. Пальчикова,
B. Г. Селятицкая, Ю. П. Шорин // Проблемы эндокринологии. — 1986. — № 4. —
C. 65-68.
5. Muggeo M. Accelerated complications in Type 2 diabetes mellitus : the need for greater awareness and earlier detection / M. Muggeo // Diabet Med. — 1998. — N15 (suppl 4). — Р. S60—62.
RESEARCH OF EFFICIENCY OF PERORAL NANOCOMPOSITE INSULIN PREPARATION
12 3 1 1 1
K. I. Ershov ' , A. A. Seryapina , V. V. Spiridonov , E. M. Parygina , A. V. Redozubov
1SBEIHPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health» (Novosibirsk c.) 2FSBE «Novosibirsk scientific research institute of clinical and experimental lymphology»
SB RAMS (Novosibirsk c.) CJSC «Siberian Center of Pharmacology and Biotechnologies» (Novosibirsk c.)
Determination of features of absorption of the pegylated insulin (PI), labeled FITC was the objective of the research. Such methods, as tissue incubation in Ussing apparatus, confocal microscopy of the samples received as a result of experiment in situ, PI intake to rats with alloxan Diabetes of the I type were used. The obtained data testify that PI possesses high level of bioadhesion, high rate and the big area of absorption, fastness to destruction by enzymes of gastrointestinal tract, and also effectively reduces glucose level in blood at animals with alloxan Diabetum.
Keywords: insulin, pegylation, absorption, jejunum, alloxan Diabetum.
About authors:
Ershov Konstantin Igorevich — candidate of biological sciences, assistant of pharmacology chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», senior research associate of lymphotropic therapy and lymphodiagnostic laboratory at FSBE«Novosibirsk scientific research institute of clinical and experimental lymphology» SB RAMS, e-mail: ershov_k@bk.ru
Seryapina Alisa Alekseevna — chemical engineer at CJSC «Siberian Center of Pharmacology and Biotechnologies», e-mail: 1broadsword@mail.ru
Spiridonov Vasily Vasilyevich — student of the 4th course of stomatologic faculty at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», e-mail: ershov_k@bk.ru
Parygina Evgenia Mikhaelovna — student of the 4th course of stomatologic faculty at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», e-mail: ershov_k@bk.ru
Redozubov Edward Vitalyevich — student of the 4th course of stomatologic faculty at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», e-mail: ershov_k@bk.ru
List of the Literature:
1. Pharmacological properties of electron beam synthesis of Somatotropinum pegylated by means of nanotechnology / A. M Dygay [etc.] // Bulletin of exper. biology and medicine. — 2012. — V. 153, № 2. — P. 232-234.
2. Ershov K. I. Studying of mechanisms of fluoresceine absorption in jejunum at Wistar rats / K. I. Ershov, A. A. Seryapina // Bull. of Novosibirsk state university. Series: Biology, clinical medicine. — 2012. — V. 10, Iss. 3 . — P. 19-23.
3. Research of method of fluoresceine absorption from jejunum at Wistar rats in blood lymph system / K. I. Ershov, V. V. Astashov, O. V. Kazakov [etc.] // Bull. of Novosibirsk state university. Series: Biology, clinical medicine. — 2012. — V. 10, Iss. 4. — P. 41-46.
4. Palchikova N. A. Quantitative assessment of sensitivity of experimental animals to diabetogenic effect of alloxan / N. A.Palchikova, V. G. Selyatitskaya, Y. P. Shorin // Endocrinological Problems. — 1986. — № 4. — P. 65-68.
5. Muggeo M. Accelerated complications in Type 2 diabetes mellitus : the need for greater awareness and earlier detection / M. Muggeo // Diabet Med. — 1998. — N15 (suppl 4). — P. S60—62.
