CC BY
88
ГЕНЕТИКА ПОПУЛЯЦИЙ И ЭВОЛЮЦИЯ
© н. н. Рыжова 1, м. о. Бурляева 2,
Е. А. Кочиева 1,
М. А. Вишнякова 2
1 Центр «Биоинженерия»
РАН РФ, Москва;
2 Государственный научный центр РФ Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н. И. Вавилова РАСХН, Санкт-Петербург
' Проведен анализ нуклеотидного полиморфизма ITS1-5.8S-ITS2 последовательностей представителей трибы Vicieae из коллекции ВИР. Выявлены нуклеотидные замены и индели различной длины в ГТС1-5^-Г^2 районе, характеризующие как отдельные виды, так и группы видов Lathyrus и Vicia. Получен целый ряд данных, подтверждающий видовой/родовой статус образцов, имеющих спорное таксономическое положение.
' Ключевые слова: триба Уісіеае, таксономия, нуклеотидный полиморфизм, ITS-последовательности
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ITS-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЙ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ТРИБЫ VICIEAE (ADANS.)
BRONN СЕМ. FABACEAE LINDL.
ВВЕДЕНИЕ
Триба виковых — Vicieae сем. Fabaceae объединяет ряд экономически важных родов, представители которых используются как зерновые, кормовые, овощные, декоративные, технические, лекарственные и си-дерационные культуры. По оценкам большинства современных авторов триба включает 5 родов — Lathyrus Ь.(чина), Vicia L.(вика), Pisum L. (горох), Lens Mill. (чечевица), Vavilovia An. Fed. (вавиловия), объединяющих 300 — 400 видов [7, 26, 27, 13].
Представители трибы распространены в Евразии, северной Африке, Северной и Южной Америке, немногие виды найдены во флоре тропической восточной Африки [3, 24]. Центрами наибольшего разнообразия виковых считаются Средиземноморье и Ирано-Туранская флористическая провинция. Однако до настоящего времени вопрос о месте зарождения трибы остается нерешенным. Существует несколько гипотез о ди- или полифилетическом, либо парафилитическом происхождении виковых.
С точки зрения морфобиологических дескриптеров триба Vicieae считается одной из наиболее сложных. Выделяемые в настоящее время роды трибы характеризуются генетической однородностью и существованием слабо дифференцированных видов [14, 21, 27, 32]. Морфологическая гомоплазия Vicieae, параллелизм, прогрессивная эволюция и редукция признаков сильно затрудняют классификацию и служат причиной множества мнений о числе реальных родов в трибе и их видовом составе.
Существует несколько точек зрения как на структуру трибы, так и на систему родов Vicia и Lathyrus, их объем и внутриродовую классификацию [26, 27, 3]. Согласно одной из последних классификаций [27] выделяются 13 секций Lathyrus: Orobus (L.) Gren. et Godr., Lathyrostylis (Griseb.) Bassler, Pratensis Bassler, Neurolobus Bassler, Orobon Tamamsch, Orobastrum Boiss., Viciopsis Kupicha, Linearicarpus Kupicha, Lathyrus L., Aphaca (Miller) Dumort, Nissolia (Miller) Dumort, Clymenum (Adans.) DC., Notolathyrus Kupicha.
Однако целый ряд исследователей некоторым секциям рода Lathyrus присваивают ранг самостоятельных родов — Orobus L., Ochrus L. [17], Nissolia, Aphaca [8], Clymenum Mill. [6, 3]. Не менее проблематична ситуация и с родом Vicia. Так, выделяемые F. K. Kupicha (1983) виды V. narbonensis L., V. faba L., V. hirsuta (L.) Gray., V. ervilia (L.) Willd., согласно классификации А. К. Станкевич (1999) наравне с Lens приобретают статус отдельных родовых категорий Bona Medik., Faba Mill., Ervum L., и Ervilia (L.) Link. Усложняют классификацию видов в трибе Vicieae, выделяемые еще со времен Линнея, так называемые, виковые оробоиды: О. lathyroides L. (= V. unijuga A. Br.), O. venosus Wiild., V. oroboides
Wulfen, V. dumetorum L., L. atropatanus (Grossh.) Sirj., V. pseudoorobus Fisch.(= V. nipponica Matsum. = O. fischerianus Stankev.), сочетающие в себе признаки Vicia и Lathyrus.
В настоящее время для оценки межвидовой и внутривидовой вариабельности у представителей многих родов растений наиболее часто используется область спейсера ITS1-5.8S-ITS2 рибосомного оперона. Последовательности внутренних транскрибируемых спей-серов генов рРНК считаются весьма эффективными для установления таксономической структуры многих семейств и родов, уточнения филогенетических связей и идентификации образцов, в особенности на видовом уровне [ 12]. Последовательность спейсера ITS1-5.8S-ITS2 использовалась в таксономических и филогенетических исследованиях и у бобовых, как, например, у Lupinus L. [9], Lotus L. [11], Lens [28], комплекса Phaseolus-Vigna [20].
Для исследования таксономических вопросов, связанных с трибой Vicieae, с использованием последовательностей внутренних транскрибируемых спей-серов (ITS1, ITS2) генов рибосомной РНК, в данную работу были отобраны образцы Lathyrus, Lens, Pisum и Vicia генбанка ГНУ ГНЦ РФ ВИР. Ключевыми задачами исследования стали: 1) анализ нуклеотидной вариабельности ITS 1 -5.8S-ITS2-последовательности у представителей трибы Vicieae; 2) оценка возможности молекулярного обоснования состава трибы и секционного деления Lathyrus и Vicia; 3) молекулярная характеристика коллекции Lathyrus генбанка ГНУ ГНЦ РФ ВИР и определение таксономического статуса спорных образцов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работу были отобраны 35 образцов, представляющих 29 основных видов трибы Vicieae из коллекции чины ГНУ ГНЦ РФ ВИР.
Выделение растительной ДНК производили на основании протокола, предложенного K. Edwards с сотрудниками (1991). Количество выделенной ДНК определяли на спектрофотометре BECKMAN K-100. В дальнейший PCR анализ бралась ДНК с OD 260/280 > 1,5.
Для полимеразной цепной реакции использовали наборы реактивов производства «Диалат ЛТД». Область ITS1-5.8S-ITS2 амплифицировалась с использованием праймеров ITS5 (5’-TCGTAACAAGGTTCCCGTAGGTG-3’), комплиментарного З’-концу гена 18S и ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’), комплиментарного 5’-концу гена 26S рРНК, предложенные T. J. White и др. (1990).
Амплификацию фрагмента проводили в реакционной смеси объемом 15 мкл, содержащей 1х буфер из соответствующего набора, 1.6 мМ MgCl2,
160 мкМ каждого dNTP; 0,3 мкМ каждого праймера;
0,3 единиц Taq полимеразы и 100 нг геномной ДНК в термоциклере GeneAmp PCR System2700 (Applied Biosystems, США) в режиме: денатурация — 30 с. при 94 °С; отжиг праймера — 45 с. при 59 °С; синтез ДНК — 1 мин при 72 °С с числом циклов — 36 и предварительной денатурацией — 5 мин (94 °С). Заключительную элонгацию PCR-фрагментов проводили 10 мин при 72 °С.
Продукты реакции амплификации разделяли электрофорезом в 1,5%-м агарозном геле в 1х ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотодокументирова-ли. В качестве маркера длины фрагментов ДНК использовали 1kb DNA ladder (“Gibco BRL’).
Нуклеотидные последовательности ITS1-5.8S-ITS2-области были получены с помощью системы Big-dye (Applied Biosystems), с использованием как ITS4, так и ITS5 праймеров на ABI 310 cappilary DNA Analyzer. Выравнивание последовательностей, анализ и реконструкция филогении проводилась с помощью программы MEGA 3.0 [25]. Расчет матриц расстояний строился на использовании двухпараметрической модели Кимуры. Инсерции-делеции рассматривались как потенциально филогенетически-информативные сайты и включались в анализ. Бутстреп тест филогении проводился с использованием алгоритма ближайшего соседа NJ [30] при числе реплик равном 1000. Для сравнительного анализа и получения корректной филогенетической информации в кладистический анализ были включены уже известные последовательности ITS района представителей отдельных видов трибы, полученные Кенайсер с сотрудниками [24]. В качестве внешней группы использовались последовательности Cicer arietinum L., Trifolium hybridum L. из базы данных NCBI.
Чтобы избежать возможных технических ошибок, возникающих при секвенировании околопраймерных областей последовательности концевых участков ITS фрагментов (~ 40 нуклеотидов 5‘- конца и ~ 20 нуклеотидов 3‘- конца полноразмерной области ITS1-5.8S-ITS2) были исключены из анализа.
Дополнительно для сравнительного анализа полученных сиквенсов использовались последовательности из базы данных NCBI, принадлежащих различным видам исследуемой трибы (табл.1) и близкой к ней трибы Trifolieae (Bronn) Benth. (Trifolium hybridum L.).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ нуклеотидных последовательностей ITS1-5^-П^2-области представителей трибы Vicieae
В работу были отобраны 35 образцов 29 видов трибы Vicieae коллекции ГНУ ГНЦ РФ ВИР, относящихся к 4 родам Lathyrus L., Pisum L., Vicia L., Lens Mill. (табл. 1).
ITS1-5.8S-ITS2-области взятых в анализ представителей Vicieae были амплифицированы с использованием праймеров ITS4 и ITS5, гомологичных последовательностям генов 18Э и 26S рРНК. В результате амплификации для каждого образца были получены фрагменты длиной около 700 п. н., включавшие полноразмерный регион ITS1-5.8S-ITS2. С использованием тех же праймерных последовательностей эти фрагменты были секвенированы впрямую как с 3’-, так и
5’- концов. Полученные сиквенсы были выровнены и проанализированы с помощью программы MEGA 3.
Протяженность выровненных и используемых для анализа последовательностей ITS- района представителей трибы Vicieae составила 568 п. н. При этом длины этого фрагмента, исключая индели, варьировали от вида к виду от 520 до 556 пн. В целом при практически равной длине проанализированных участков спейсерных последовательностей, ITS1 характеризовался почти в 2 раза
Таблица 1
Образцы видов трибы Vicieae (Adans.) Bronn, взятые для анализа ITS-последовательностей ядерной ДНК и их таксономический статус в соответствии с классификациями А. К. Станкевич (1999) и F. K. Kupicha (1976, 1983)
Номер Название вида (по F. K. Kupicha), происхождение Род / подрод / секция по системе А. К. Станкевич (1999) Род / подрод / секция по системам F. K. Kupicha (197б, 1983)
1 22 Lathyrus sativus L., Индия Lathyrus / sect. Cicercula Lathyrus / sect. Lathyrus
2 13 Lathyrus sativus L., Иран Lathyrus / sect. Cicercula Lathyrus / sect. Lathyrus
3 407 Lathyrus sativus L., Кипр Lathyrus / sect. Cicercula Lathyrus / sect. Lathyrus
4 35б Lathyrus cicera L., Сирия Lathyrus / sect. Cicercula Lathyrus / sect. Lathyrus
5 1709 Lathyrus hirsutus L., Франция Lathyrus / sect. Cicercula Lathyrus / sect. Lathyrus
б 1757 Lathyrus tingitanus L., Австралия Lathyrus / sect. Cicercula Lathyrus / sect. Lathyrus
7 1790 Lathyrus annuus L., ГДР Lathyrus / sect. Cicercula Lathyrus / sect. Lathyrus
8 И-б04554 Lathyrus odoratus L., США Lathyrus / sect. Cicercula Lathyrus / sect. Lathyrus
9 135б Lathyrus tuberosus L., Краснодарский кр. Lathyrus / sect. Lathyrus Lathyrus / sect. Lathyrus
10 И-308541 Lathyrus sylvestris L., Франция Lathyrus / sect. Lathyrus Lathyrus / sect. Lathyrus
11 И-З101бЗ Lathyrus latifolius L., Италия Lathyrus / sect. Lathyrus Lathyrus / sect. Lathyrus
12 1293 Lathyrus aphaca L., Индия Lathyrus/ sect. Aphaca Lathyrus / sect. Aphaca
13 143б Lathyrus nissolia L., Венгрия Lathyrus / sect. Nissolia Lathyrus / sect. Nissolia
14 380 Lathyrus ochrus ( L.) DC, Турция Clymenum Lathyrus / sect. Clymenum
15 17б8 Lathyrus ochrus ( L.) DC, Греция Clymenum Lathyrus / sect. Clymenum
1б 1370 Lathyrus clymenum L., Болгария Clymenum Lathyrus / sect. Clymenum
17 1329 Lathyrus inconspicuus L., Грузия Lathyrus Lathyrus / sect. Linearcarpus
Таблица 1 (продолжение)
Образцы видов трибы Vicieae (Adans.) Bronn, взятые для анализа ITS-последовательностей ядерной ДНК и их таксономический статус в соответствии с классификациями А. К. Станкевич (1999) и F. K. Kupicha (1976, 1983)
Номер Название вида (по F. K. Kupicha), происхождение Род / подрод / секция по системе А. К. Станкевич (1999) Род / подрод / секция по системам F. K. Kupicha (197б, 1983)
18 И-0139312 Lathyruspratensis L., Карелия Lathyrus / sect. Pratensis Lathyrus / sect. Pratensis
19 И-0138125 Lathyrus gmelinii Fritsch, Алтай Orobus / subgen. Lathyrostylis Lathyrus / sect. Orobus
20 И-01З9З1б Lathyruspalustris L., Карелия Orobus / subgen. Lathyrostylis Lathyrus / sect. Orobus
21 И-0139208 Lathyrus maritimus (L.) Bigel., Карелия Orobus / subgen. Lathyrostylis Lathyrus / sect. Orobus
22 224 Lens culinaris Medik., Воронежская обл. Lens Lens
23 517 Vicia ervilia Willd., Украина Ervilia Vicia / subgen. Vicilla/ sect. Ervilia
24 32547 Vicia bithynica L., Украина Ervum / subgen. Ervum / sect. Ara-chus Vicia / subgen. Vicia / sect. Faba
25 35828 Vicia unijuga A. Br., Новосибирская обл. Orobus / subgen. Viciostyles Vicia / subgen. Vicilla / sect. Vicilla
2б Збб5З Vicia sativa L., московская обл. Vicia / subgen. Vicia / sect. Vicia Vicia / subgen. Vicia / sect. Vicia
27 Зб771 Vicia peregrina L., Азербайджан Vicia / subgen. Hypechusa / sect. Peregrinae Vicia / subgen. Vicia / sect. Peregrinae
28 3702б Vicia villosa Roth, Тамбовская обл. Vicia / subgen Cracca / sect. Longitubulateae Vicia / subgen. Vicilla/ sect. Cracca
29 Зб787 Vicia narbonensis L., Алжир Bona Vicia / subgen. Vicia / sect. Faba
30 Зб792 Vicia hirsuta (L.) Gray, Португалия Ervum / subgen. Ervum / sect. Len-ticulae Vicia / subgen. Vicilla/ sect. Cracca
31 1б28 Vicia faba L., Украина Faba Vicia / subgen. Vicia / sect. Faba
32 5 Pisum sativum L., Памир Pisum Pisum
33 23 Pisum sativum L., Африка Pisum Pisum
34 Сорт Тройка Pisum sativum L., Россия Pisum Pisum
35 AY839337 Vicia unijuga A. Br. Orobus / subgen. Viciostyles Vicia / subgen. Vicilla/ sect. Vicilla
Зб AY839338 Vicia nipponica Matsum = V. pseudoorobus Fisch. Orobus / subgen. Viciostyles Vicia / subgen. Vicilla/ sect. Vicilla
Таблица 1 (окончание)
Образцы видов трибы Vicieae (Adans.) Bronn, взятые для анализа ITS-последовательностей ядерной ДНК и их таксономический статус в соответствии с классификациями А. К. Станкевич (1999) и F. K. Kupicha (1976, 1983)
Номер Название вида (по F. K. Kupicha), происхождение Род / подрод / секция по системе А. К. Станкевич (1999) Род / подрод / секция по системам F. K. Kupicha (1976, 1983)
37 AY839339 Vicia cracca L. Vicia / subgen. Cracca / sect. Cracca Vicia / subgen. Vicilla/ sect. Cracca
38 AY839344 Lathyrus annuus L. Lathyrus / sect. Cicercula Lathyrus / sect. Lathyrus
39 AY839345 Lathyrus aphaca L. Lathyrus/ sect. Aphaca Lathyrus/ sect. Aphaca
40 AY839348 Lathyrus cicera L. Lathyrus / sect. Cicercula Lathyrus / sect. Lathyrus
41 AY839349 Lathyrus clymenum L. Clymenum Lathyrus / sect. Clymenum
42 AY839361 Lathyrus japonicus Willd. Orobus / subgen. Lathyrostylis Lathyrus / sect. Orobus
43 AY839372 Lathyrus nervosus Lam. Lathyrus / sect. Notolathyrus Lathyrus / sect. Notolathyrus
44 AY839375 Lathyrus nissolia L. Lathyrus / sect. Nissolia Lathyrus / sect. Nissolia
45 AY839376 Lathyrus ochrus (L.) DC Clymenum Lathyrus / sect. Clymenum
4б AY839379 Lathyruspalustris L. Orobus / subgen. Lathyrostylis Lathyrus / sect. Orobus
47 AY839384 Lathyrus pratensis L. Lathyrus / sect. Pratensis Lathyrus / sect. Pratensis
48 AY839385 Lathyrus pubescens Hook. and Arn. Lathyrus / sect. Notolathyrus Lathyrus / sect. Notolathyrus
49 AY839393 Lathyrus sphaericus Retz. Lathyrus Lathyrus / sect. Linearcarpus
50 AY839394 Lathyrus sphaericus Retz. Lathyrus Lathyrus / sect. Linearcarpus
51 AY839399 Lathyrus tingitanus L. Lathyrus / sect. Cicercula Lathyrus / sect. Lathyrus
52 AYI43447, Pisum fulvum Sibth. Et Smith Pisum Pisum
53 AYI43456 Pisum sativum subsp. abyssinicum (A. Br.) Berger Pisum Pisum
54 AYI43455 Pisum sativum subsp. elatius (Bieb.) Schmalh. Pisum Pisum
55 AYI43465 Pisum sativum subsp. sativum var. speciosum subvar. arvense (Alef.) Makash. Pisum Pisum
5б AF228072 Lens nigricans (M. B.) Godr. Lens Lens
57 AJI3083I Vicia bithynica L. Ervum / subgen. Ervum / sect. Ara-chus Vicia / subgen. Vicia / sect. Faba
58 XI7535 Vicia faba L. Faba Vicia / subgen. Vicia / sect. Faba
59 DQ35I827 Vicia hirsuta (L.) Gray Ervum / subgen. Ervum / sect. Len-ticulae Vicia / subgen. Vicilla/ sect. Cracca
б0 AJI30833 Vicia narborensis L. Bona Vicia / subgen. Vicia / sect. Faba
б1 AJ566206 Vicia peregrina L. Vicia / subgen. Hypechusa / sect. Peregrinae Vicia / subgen. Vicia / sect. Peregrinae
б2 AJ0I0804 Vicia sativa L. Vicia / subgen. Vicia / sect. Vicia Vicia / subgen. Vicia / sect. Vicia
бЗ #AY594660 Cicer arietinum L. CicerL.
б4 # AF053159 Trifolium hybridum L.
большим числом как вариабельных, так и парсимони-информативных сайтов, чем спейсер ITS2 (табл. 2). Как и следовало ожидать, область гена 5.8S рРНК была весьма консервативна, и у исследованных образцов выявлено всего 5 вариабельных сайтов.
При анализе полученных последовательностей были детектированы как индели, так и нуклеотидные замены. Протяженные делеции обнаружены в ITS-последовательностях видов L. nissolia (делеция 12 пн), V. villosa и V. cracca (одинаковая делеция 14 пн), V. sativa (делеция 16 пн), L. sphaericus (две делеции 8 и 25 пн), L. inconspicuous (15 пн). При этом делеции локализовались, как правило, в 5’-области ITS2 и только у вида V. sativa делеция была расположена в 5’-областиITS 1 -района.
Анализ нуклеотидного полиморфизма ITS-района для большинства видов Lathyrus и Vicia исследуемого набора образцов также выявил свои видоспецифические нуклеотидные замены.
Среди Lathyrus, виды L. sphaericus (8 замен), L. nissolia (8 замен), L. inconspicuus (4 замены) характеризовались наибольшим числом видоспецифических (аутапоморфных) замен. Число аутапоморфных замен в ITS 1 -5.8S-ITS2 у остальных видов Lathyrus не превышало 3. Для каждого вида вик, за исключением V. nipponica, также были идентифицированы видоспецифичные замены. Наибольшее число аутапоморфных замен было детектировано у V. hirsuta (6 замен), V. ervilia (6 замен), V. faba (6 замен), V. narbonensis (5 замен). Остальные виды V. sativa, V. bithynica, V. villosa, V. peregrina характеризовались меньшим числом замен.
Помимо видоспецифических замен были детектированы замены для отдельных групп видов как среди представителей Vicia, так и Lathyrus.
Особый интерес представлял проблематичный вид V. unijuga, сочетающий морфологические признаки и Vicia, и Lathyrus. Проведенный анализ ITS-области вида V. unijuga показал наличие в его последовательности всех родоспецифичных замен, характерных для анализируемых видов Vicia. Этот факт объединяет вид V. unijuga с другими представителями Vicia.
Последовательность V. unijuga оказалась практически идентична ITS-последовательности V. nipponica за исключением одной нуклеотидной замены, обнаруженной в положении 436 * пн (T-A). При этом было идентифицировано шесть специфических замен, характерных для ITS-областей этих двух видов и, таким образом, отличающих виды V. unijuga и V. nipponica от остальных анализируемых видов вик.
В свою очередь, виды V. cracca и V. villosa характеризовались присутствием протяженной 14 нуклеотидной делеции в 5’- области ITS2 и четырьмя общими заменами. Вместе с тем последовательности обоих видов имели также и свои видоспецифичные замены, отличающие их друг от друга.
Среди последовательностей представителей Lathyrus наибольшее число синапоморфных замен было детектировано для пар видов L. nervosus — L. pubescens (4 замены и 1 мононуклеотидная инсерция) и L. japonicus — L. maritimus (L.) Bigelow (3 замены).
В целом число вариабельных сайтов проанализированной области ITS1-5.8S-ITS2 у чин составило 20,3 %. Для представителей вик этот показатель составил 15,3 %. Для сравнения, дополнительный анализ последовательностей видов рода Pisum (2 вида: P. fulvum и 3 подвида P. sativum) и рода Lens (6 видов: L. tomentosus, L. lamottei, L. odemensis, L. ervoides, L. nigricans, 2 подвида L. culinaris), представленных в своем полном составе, выявил лишь около 3 % вариабельных сайтов от общей длины выровненного аналогичного участка ITS1-5.8S-ITS2.
Кладистический анализ представителей трибы Vicieae
Выявленный нуклеотидный полиморфизм ITS-области был использован для расчета генетических расстояний (двупараметрическая модель Кимуры) и построения NJ-дендрограммы (рис. 1).
На дендрограмме все представители трибы Vicieae формировали единый кластер (индекс бутстрепа (ИБ) 72 %). Виды Cicer arietinum и Trifolium hybrydum, взятые в анализ в качестве внешних групп, как и ожидалось, формировали отдельные сестринские ветви по отношению к этому кластеру. Внутри кластера три-
* — здесь и далее по тексту: порядковый номер нуклеотидов от начала ITS1-последовательности T. hybridum AF053159, взятой в анализ в качестве внешней группы.
Таблица 2
Характеристики П^1-5^-Г^2-района у 35 представителей трибы Vicieae (Adans.) Вгопп
ITS1 5.8S ITS2 Общая
Выровненная длина пн. 201 164 202 568
Длина без пробелов пн. 176-196 164 164-192 520-556
GC состав, % 54,2 % 50,5 % 48,7 % 51 %
Число константных сайтов 99 159 136 394
Число вариабельных сайтов 100 5 62 167
Число парсимони-информативных сайтов 79 (39,3 %) 4 (2,4 %) 41 (20,3 %) 124 (21,8 %)
■с
с
С:
L. ochrus (380)
L. ochrus L. ochrus (1768)
L. clymenum (1370) clymenum L. inconspicuus (604722) L. pratensis L. pratensis (0139312)
L. nissolia L. nissolia (1436)
L. gmelinii L. palustris
L. palustris (0139316)
L. anniius annuus (1790)
L. sativus (22)
L. sativus (13)
L. hirsutus (1709)
L. odoratus (604554)
L. cicera L. cicera (356)
L. sativus (407)
L. tuberosus (1356)
L. latifolius (310163)
L. sylvestris (308541)
L. tingitanus (1757)
L. tingitanus L. maritimus (0139208)
L. japonicus L. nervosus pubescens P. sativum (188)
P. sativum (1836)
P. sativum cvTroika L. sphaericus 93 sphaericus (597150)
L. aphaca (1293)
L. aphaca
V. narborensis (36787)
V. bithynica (32547)
V. sativa (36653)
V. peregrina (36771)
V. faba (1628)
V. unijuga V. nipponica V. unijuga (35828)
V. villosa (37026)
V. cracca
Lens culinaris (224)
V. hirsuta (36792)
V. ervilia (517)
Trifblium hybridum Cicer arietinum
4
Рис. 1. Дендрограмма генетических различий исследованных представителей трибы Vicieae (Adans.) Bronn, построенная с использованием методов Neighbor Joining на основе данных нуклеотидного полиморфизма внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS) генов рРНК
бы Vicieae также с высокими значениями ИБ (86 %) выделяется обширный подкластер, включающий всех исследованных представителей рода Lathyrus, а также представителей рода Pisum. Внутренняя дифференциация этого подкластера помимо внутривидовых группировок выявила несколько групп, объединяющих разные виды, как, например L. clymenum — L. ochrus (ИБ — 91 %), L. maritimus — L. japonicus (ИБ — 99 %), L. sativus — L. cicera (ИБ — 88 %), L. sativus — L. annuus (ИБ — 79%).
Как уже упоминалось, одним из основных вопросов, связанных с систематикой трибы Vicieae, считается вопрос таксономического положения представителей секции Orobus. Эта весьма разнообразная секция включает по оценкам разных систематиков от 25 до 54 видов. Некоторые авторы выделяют их представителей в отдельный древний род Orobus, предположительно давший начало остальным видам трибы [3, 10, 16 и др.]. В данное исследование были включены последовательности 4 видов секции Orobus — L. palustris, L. japonicus, L. gmelinii, L. maritimus, а также V. unijuga, V. nipponica, выделяемых А. К. Станкевич вместе с видами L.
L. pisifomis, L. vemus в отдельный род. Однако по результатам проведенного анализа представители этих видов не формировали общей родовой группы в трибе, а фактически распределились политомичными ветвями среди остальных представителей Lathyrus, что говорит о высокой дивергентности всех видов этой группы. Единственным исключением по данным анализа нуклеотидной вариабельности ITS-региона стало высокое сходство образцов L. тагШт^ с L. japonicus. Эти две последовательности отличались единственной заменой в положении 361 (А^). Действительно многие ботанические классификации рода Lathyrus рассматривают L. maritimus и L. japonicus как один вид [6, 27 и др.]. На построенной по данным молекулярного анализа дендрограмме L. тагШт^ и L. japonicus образуют общую группу (ИБ — 99 %), одновременно не проявляя значительного сходства с другими представителями ОюЬ^, подтверждая синонимичность данных видовых таксонов.
Высокий уровень полиморфизма видов, относящихся к ОюЬ^, также был показан и в работе Кешсег с сотрудниками (2005). Клада, содержащая европейские, североамериканские образцы, а также голарктические виды, характеризовалась политомичным строением. Стоит отметить, что определение филогенетических отношений у видов этой секции вызывало большие затруднения и у других авторов [5, 15].
Что касается, так называемых виковых оробоидов V. шцща и V. шррошса, как это упоминалось выше, все выявленные в анализе особенности ITS-области этих видов показывают их родство с Vicia. По всей видимости, выделение V. шцща, V. шррошса, а также видов L. palustris, L. japonicus, L. gmelinii, L. maritimus, L. Иш^И^, L. pisiformis, L. vemus в отдельный родо-
вой таксон не может быть поддержано полученными данными.
Представители другой проблематичной группы видов рода Lathyrus: L. clymenum-L. ochrus, выделяемых некоторыми систематиками в отдельный род Clymenum [6, 3], согласно полученным молекулярным данным, включаются в общий кластер с другими видами Lathyrus. Положение этой группы на дендрограмме, а также наличие всего лишь одной синапоморфной замены, объединяющей виды L. clymenum и L. ochrus, сохраняет секционный статус группы Clymenum в составе рода Lathyrus, предложенного F. K. Kupicha (1983). Для сравнения такой «типичный род», как Pisum (виды P. fulvum, P. sativum и подвиды P. sativum ssp. abyssinicum, P. sativum ssp. elatius, P. sativum var. arvense), также вошедший в состав кластера Lathyrus, характеризовался наличием восьми синапоморфий.
Что касается остальных группировок кластера Lathyrus, то бутстреп-поддержка в большинстве случаев была невелика. Таким образом, в целом никаких групп, соответствующих внутриродовым секциям Lathyrus, обнаружено не было. Представители отдельных видов, как правило, формировали политомичные ветви в кластере Lathyrus, не выдерживая секционного деления. Это может быть связано как с недостаточной разрешающей способностью ITS-последовательности для Vicieae, так и возможной искусственностью такого рода секционного де -ления трибы. Аналогичные трудности при использовании этого классического ITS-метода для решения филогенетических и таксономических аспектов отдельных таксонов отмечались также у представителей рода Lens [28].
В отличие от Lathyrus представители рода Vicia не отличались целостностью своего кластера. Два вида V. hirsuta и V. ervilia формировали отдельную кладу (ИБ — 55 %), наравне с Lathyrus и другими Vicia. Клада Vicia включала остальные виды вик, в котором по существу можно выделить следующие две группы: группу V.peregrina, V. faba, V. sativa, V. bithynica (ИБ — 58 %) и группу V. cracca, V. villosa, V. unijuga, V. nipponica (ИБ — 59 %). Положение V. hirsuta и V. ervilia на дендрограмме и значительное число аутапоморфных замен может характеризовать эти виды (V. hirsuta, V. ervilia), как весьма дивергентные относительно остальных Vicia, и поддерживать возможность выделения этих видов в отдельный род/роды (Ervum L. и Ervilia (L.) Link.) наравне с Lens, как это предлагается в систематике А. К. Станкевич (1999).
Согласно данным проведенного молекулярного анализа, подтвердить родовой статус V. narbonensis, равно как и выделить вместе с V. hirsuta в отдельный род Ervum вид V. bithynica, согласно системе А. К. Станкевич, (1999) не представляется возможным. Виды V. bithynica и V. hirsuta жестко разделяются на дендрограмме, попадая в разные кластеры. Интересно отметить, что кластер, включивший V. bithynica, V. peregrina, V. sativa, V. faba, а также в качестве наиболее дистанцированного его чле-
на V. narbonensis, главным образом состоит из представителей секции Faba подрода Vicia (классификация
F. K. Kupicha, 1976). В то время как другой кластер, также поддерживая систему F. K. Kupicha (1976), на дендрограмме был представлен V. crassa, V. nipponica, V. unijuga. Образованные внутри этого кластера группы V. villosa — V. crassa и V. nipponica — V. unijuga, соответствуют секциям Cracca и Vicilla подрода Vicilla [6].
В целом, однако, невысокий уровень бутстреп-под-держки клад Vicia, а также отсутствие специфичных сина-поморфных замен для групп видов, не позволяет сделать окончательный вывод относительно состава этого рода и отдельных таксономических групп в нем. Согласно полученным данным, этот род включает генетически разнородные виды, вопрос о родстве которых должен решаться с привлечением дополнительных образцов, а также вероятно анализом других последовательностей генома.
Таким образом, в результате проведенного анализа нуклеотидного полиморфизма ITS1-5.8S-ITS2-по-следовательностей представителей трибы Vicieae был выявлен целый ряд молекулярных признаков (замен и инделей), характеризующих как отдельные виды, так и группы видов Lathyrus и Vicia. При этом показана в 2 раза большая нуклеотидная вариабельность спейсе-ра ITS1 по сравнению с ITS2.
Предложенное А. К. Станкевич (1999) выделение видов L. clymenum, L. ochrus из состава Lathyrus в отдельный род Clymenum, а также видов L. palustris, L. japonicus, L. gmelinii, L. maritimus, L. linifolius, L. pisiformis, L. vernus, V. unijuga, V. nipponica в отдельный род Orobus, не поддерживается данными вариабельности ITS-региона. Полученные данные скорее подтверждают видовой состав рода Lathyrus, предложенный в последней классификации F. K. Kupicha (1983), не выявляя при этом секционной дифференциации этого рода.
Молекулярное исследование таксономического положения V. unijuga и V. nipponica, имеющих морфологические признаки как вик, так и чин, показало высокую степень сходства их ITS-последовательностей и генетическую близость к представителям рода Vicia.
Виды, включаемые в род Vicia, действительно составляют генетически разнородную группу, вероятно требующую выделения нескольких родовых таксонов. Такие виды как V. hirsuta, V. ervilia образуют дивергентные ветви в кластере Vicia и вероятно наравне с L. culinaris могли бы представлять отдельные рода (Er vum и Ervilia), как это предложено в классификации А. К. Станкевич (1999). Состав собственно рода Vicia и положение остальных таксонов внутри него остаются неоднозначными, что требует дополнительных исследований с привлечением других молекулярных методов и анализа других районов генома.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 06-04-48869-a и частично гранта РФФИ 07-04-01123-а.
Литература
1. Крашенинников И. М. Из истории развития ландшафтов Южного Урала / Крашенинников И. М. // Ред. Сукачев В. Н. — М.: Географические работы. — 1954. — С. 103-128.
2. Попов М. Г. Род Cicer и его виды. К проблеме происхождения средиземноморской флоры (Опыт морфологической и географической монографии) /
Попов М. Г. // Тр. по прикл. бот., ген. и сел. ------
1929. — Т. 21, Вып. 1. — 239 с.
3. Станкевич А. К. Вика. Культурная флора / Станкевич А. К., Репьев С. И. // Ред. Репьев С. И. — СПб.: ГНЦ-ВИР, 1999. — Т. 4. — 491 с.
4. Федченко Б. А. Lathyrus L. / Федченко Б. А. // Ред. Комаров В. Л. — М.-Л.: Флора СССР, 1948. — Т. 13. — С. 479-520.
5. ЧефрановаЗ.В. Конспект системы рода Lathyrus L. / Чефранова З. В. // Новости сист. высш. раст. — 1971. — Т. 8. — С. 191-201.
6. Чефранова З. В. Род Lathyrus L. / Чефранова З. В. // Ред. Федорова А. А. — Л.: Флора Европейской части СССР, 1987. — Т. 6. — С. 147-172.
7. Яковлев Г. П. Бобовые земного шара / Яковлев Г. П. // Ред. Меницкий Ю. Л. — Л.: Наука, 1991. — 141 с.
8. Adanson M. Families des plantes / Adanson M. // Paris, 1763. — N 2. — P 331-332.
9. Ainouche A.-K. Phylogenetic relationships in Lupinus (Fabaceae: Papilionoideae) based on internal transcribed spacer sequences (ITS) of nuclear ribosomal DNA / Ainouche A.-K. , R. J. Bayer. // American Journal of Botany — 1999. — V. 86. — P. 590-607.
10. Alefeld. F. Genus ViciaL. / Alefeld. F. // Bonpandia. — 1861. — Vol. 9. — P 66-199.
11. Allan G. J. Tribal delimitation , phylogenetic relationships of Loteae, Coronilleae (Faboideae: Fabaceae) with special reference to Lotus: evidence from nuclear ribosomal ITS sequences / Allan G. J., Porter J. M. // American Journal of Botany — 2000. — Vol. 87. — P 1871-1881.
12. Alvarez I. A. Ribosomal ITS sequences , plant phylogenetic inference / Alvarez I. A , Wendel J. F. // Molec. Phyl. Evol. — 2003. — Vol. 29. N 3. — P 417-434.
13. Asmussen C. B. Chloroplast DNA characters, phy-logeny and classification of Lathyrus (Fabaceae) / Asmussen C. B., Liston A. // Am. J. Bot. — 1998. — Vol. 85. — P. 387-401.
14. Barneby R. C. A new species of Lathyrus (Fabaceae) from the Death Valley region of California, Nevada. / Barneby R. C., Reveal J. L. // Aliso. — 1971. — Vol. 7. — P. 361-364.
15. Bassler M. Revision der eurasiatischen Arten von Lathyrus L. sect. Orobus (L.) Gren. et Godr /
Bassler M. // Feddes Repertorium. — 1973. — Bd. 84. — Hf. 5-6. — P. 329-447.
16. Boissier E. Vicia L, Lathyrus L. / Boissier E. // Flora Orientalis. Geneve, 1872. — Vol. 2. — P. 565-622.
17. Bronn H. G. De formis plantarum Leguminosarum primitivis et derivatis / Bronn H. G. // Heidelbergae. — 1822. — P. 1-76.
18. Byoung-Hee Choi. Phylogenetic significance of stylar features in genus Vicia (Leguminosae): an analysis with molecular phylogeny / Byoung-Hee Choi, Dong-Im Seok, Yasuhiko Endo , Hiroyoshi Ohashi // Journal of Plant Research. — 2006. — Vol. 119, N 5. — P. 513-523.
19. Godron D. A. Lathyrus L. / Grenier J. C. M., Godron D. A.// Flore de France. I. — Paris et Besanson, 1848. — P. 478-492.
20. Goel S. Molecular evolution, phylogenetic implications of internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA in the Phaseolus-Vigna comple / Goel S., Raina S. N., Ogihara Y. // Mol. Phylogenet. Evol. —2002. — Vol. 22, N 1. — P. 1-19.
21. Gunn C. R. Androecium and pistil characters for the tribe Vicieae (Fabaceae) / Gunn C. R., Kluve J. // Taxon. — 1976. — Vol. 25. — P. 563-575.
22. Edwards S. K. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analyses / Edwards S.K., Johonstone C., Thompson C. // Nucleic Acids Res. — 1991. — Vol. 19, N 6. — P. 1349.
23. Engler A. Lathyrus L. / Engler A., Prantl K. // Die Naturlichen Pflanzen Familien. Leipzig. — 1894. — S. 70-388.
24. Kenicer G. J. Systematics, biogeography of Lathyrus (Leguminosae) based on internal transcribed spacer, cpDNA sequence data / Kenicer G. J., Kajita T., Pennington R. T., Murata J. // American Journal of Botany. — 2005. — Vol. 92. — P. 1199-1209.
25. Kumar S. MEGA3: Integrated Software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and Sequence Alignment / Kumar S., Tamura K., Nei M. // Briefings in Bioinformatics. — 2004. — Vol. 5. — P. 150-163.
26. Kupicha F. K. The infrageneric structure of Vicia. / Kupicha F. K. // Notes from the Royal Botanic Garden. — Edinburg. — 1976. — Vol. 34, N 3. — P. 287-326.
27. Kupicha F. K. The infrageneric structure of Lathyrus L. / Kupicha F. K. // Notes from the Royal Botanic Garden. — Edinburg. - 1983. — Vol. 41, N 2. — P 209-244.
28. Mayer M. S. The phylogeny of Lens (Leguminosae): new insight from ITS sequence analysis / Mayer M. S., Bagga S. K. // Plant Systematics, Evolution. — 2002. — Vol. 232. — P. 145-154.
29. Nuclear DNA contents, rDNAs, karyotype evolution in Vicia subgenus Vicia: II. Section Peregrinae / Frediani M., Caputo P., Venora G. [et al.] // Protoplasma. — 2005. — Vol. 226, N 3-4. — P. 181-190.
30. Saitou N. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees / Saitou N., Nei M. // Mol Biol Evol. — 1987. — V 4. — N 4. — P. 6-25.
31. Simola L. K. Comparative studies on number of leaflets, venation and epidermal structure in the genus Lathyrus / Simola L. K. // Canad. J. Bot. — 1968. — Vol. 46. — P. 71-84.
32. Steele K. P. Phylogenetic analyses if tribes Trifoleae, Vicieae based on sequences of the plastid gene matK (Papilionoideae: Leguminosae) / Steele K. P., Wojciechowski M. F. B.; eds. B. Klitgaard, A. Bru-neau. — Royal Botanic Gardens, Kew, Richmond, UK: Advances in legume systematics, 2003. — Part 10. — P. 355-370.
33. Thompson J. D. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple seguence alignment aided by quality tools / Thompson J. D., Gibson T. J., Plewniak F. [et al.] // Nucleic Acids Res. — 1997. — Vol. 24. — P. 4876-4882.
34. White T. J. Amplification and direct sequencing of
fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics / White T. J., Bruns T., Lee S. [et al.] // In: Innis M. A., Gelfand D. H., Shinsky J. J., White T. J. (editors). PCR Protocols: A Guide to Me-
thods and Applications, Academic Press, San Diego. — 1990. — P. 315-322.
Using of ITS sequences for the evaluation of taxonomic relations of the representatives of tribe Vicieae (Adans.)
Bronn сем. Fabaceae Lindl
N. N. Ryzhova, M. O. Burlyaeva, E. Z. Kochieva,
M. A. Vishnyakova
' SUMMARY: ITS1-5.8S-ITS2 nucleotide polymorphism аnalysis of Vicieae species that represent accessions of russian genebank (VIR) collection have been performed. Nucleotide substitutions in ITS1-5.8S-ITS2-sequences and indels of different length that were species-specific or specific for Lathyrus and Vicia species groups have been revealed. New data proving taxonomic status of accessions with uncertain taxonomic position have been obtained.
' Key woRDS: tribe Vicieae, taxonomy, nucleotide polymorphism, ITS-sequences
