CC BY
39
Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 12, No. 4, 2016, pp. 72-77 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2016 by Goncharova
ORIGINAL ARTICLE
OPEN
9
ACCESS
Influence of N-phenyl-2-naphthylamine on the Activity of Adenylate Cyclase Signaling System and the Virulence of Clavibacter michiganensis subsp.
Sepedonicus
A.M. Goncharova
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch of RAS, Irkutsk, Russia
*E-Mail: gonclummtfy sifibr.irk.ru
Received November 1, 2016
The effect of N-phenyl-2-naphthylamine was obtained from exudates of pea root on growth, virulence and signaling-specific of potato phytopathogen Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. It is shown that the compound in a physiological concentration of the peas 9 mkM had no effect on C. michiganensis subsp. sepedonicus, but when exposed to N-FNA in a concentration of 45 mkM was observed reduction in growth of planktonic culture C. michiganensis subsp. sepedonicus, as well as changes in the activity of adenylyl cyclase signaling system components in this phytopathogen.
Key words: adenylyl cyclase, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, cAMP, N-phenyl-2-naphthylamine, phosphodiesterase.
Abbreviations: АСС - аденилатциклазная сигнальная система; АЦ - аденилатциклаза;
рАЦ - растворимая аденилатциклаза; тАЦ - трансмембранная аденилатциклаза; ФДЭ - фосфодиэстераза; тФДЭ - трансмембранная фосфоди-эстераза; рФДЭ - «растворимая» аденилатциклаза; N-ФНА - N-фенил-2-нафтиламин; Cms - Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus; Rvl -Rhizobium leguminosarum bv. viciae; Psp - Pseudomonas syringae pv. рisi
Как известно, в контроле метаболизма бактерий и экспрессии генов факторов вирулентности участвуют различные аутоиндукторы, а также вторичные мессенджеры различных сигнальных систем. Примерами таких регуляторов являются вторичный мессенджер аденилатциклазной сигнальной системы (АСС) цАМФ и синтезирующая его аденилатциклаза (АЦ) (Kereszt et al.; 2011; Smith et al., 2004). Помимо аденилатциклазы, концентрацию цАМФ определяет фермент фосфодиэстераза (ФДЭ), переводящая цАМФ в неактивную нециклическую форму. Также из литературных данных известно, что аденилатциклаза и фосфодиэстераза присутствуют в клетках бактерий в растворимых и трансмембранных формах (Яковлев и др., 2009).
Большинство данных о роли цАМФ и аденилатциклаз в процессах роста бактерий и экспрессии факторов вирулентности относятся к патогенам животных (McDonough, Rodriguez, 2012; Ono et al., 2014), в то время как растительные патогены и симбионты остаются практически не изучены.
Известно, что длительная коэволюция позволила растениям выработать различные механизмы защиты от патогенных бактерий (Горбачева и др., 1991; Метлицкий и др., 1985). Например, различные фенольные соединения, выделяемые корнями бобовых в ризосферу, играют значительную роль в защите растения от патогенных бактерий (Макарова, 2010).
Фенольное соединение N-фенил^-нафтиламин (N-ФНА) относительно недавно был выделен из экссудатов корней гороха Pisum sativum l.v. (Макарова и др., 2012). Ранее нами было показано, что N-ФНА в физиологической для гороха концентрации 9 мкМ значительно ингибировал рост планктонной культуры, а также изменял активность компонентов АСС у специфичного для гороха мутуалиста Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rvl) и бактериального патогена Pseudomonas syringae pv. рisi (Psp) (Ломоватская и др., 2016).
Целью настоящей работы было изучить влияние N-ФНА на активность компонентов АСС и факторов вирулентности планктонной культуры биотрофного
патогенна, возбудителя кольцевой гнили картофеля, davibacter michiganensis sps. sepedonicus (Cms).
MATERIALS AND METHODS
В настоящей работе использовали бактерии Cms, штамм 6889, полученный от ФГБУ Всероссийского центра карантина растений Московской области.
Глубинную (планктонную) культуру бактерий выращивали в колбах на среде (рН 7.0), содержащей картофельный отвар, глюкозу - 7,5 г/л.
N-ФНА выделяли из экссудатов корней гороха посевного сорта Ямальский методом газожидкостной хроматографии (Макарова и др., 2012). После автоклавирования в среду культивирования бактерий добавляли раствор N-ФНА в метаноле до конечных концентраций 9 мкМ (опыт 1) и 45мкМ (опыт 2). Контролем служили образцы без добавления N-ФНА. Титр бактерий определяли на планшетном спектрофотометре "Immunochem 2100" ("HighTechnologylnc.", США) при 655 нм.
Активность растворимой аденилатциклазы (рАЦ), растворимой фосфодиэстеразы (рФДЭ), целлюлазы (КФ 3.2.1.4) и пектиназы (КФ 3.1.1.11), а также уровень цАМФ определяли в среде роста бактерий после отделения бактериальных клеток. В клетках бактерий определяли активность растворимой и мембранной аденилатциклаз, фосфодиэстераз, а также пектиназы и целлюлазы.
Трехсуточную культуру исследуемых бактерий центрифугировали при 3000 оборотах в течение 10 минут. Осадок бактерий ресуспендировали в 3 мл инкубационной среды: 50 мМ трис-HCl буфер, рН 7,2, 1мМ дитиотреитол («Sigma», США). Далее суспензию помещали в ультразвуковой соникатор "BransonUltrasoniccorp" (USA) на 2 цикла и центрифугировали при 105 000 g в течение 90 минут. Осадок ресуспендировали в 3 мл инкубационной среды. Далее, к 500 мкл исследуемого образца добавляли 50 мкл 0,5мМ АТФ. Для трансмембранной аденилатциклазы (тАЦ) в качестве кофактора добавляли3 мМ MgSO4 («Реахим» Россия), а для рАЦ - 3мМ MnCl2 («Реахим» Россия).
Для определения активности различных форм
ФДЭ (тФДЭ и рФДЭ) использовали ингибиторный анализ со специфическим ингибитором ФДЭ 0.1 мМ теофиллином («Sigma», США), который добавляли в инкубационную среду в образцы для определения активности АЦ. При выделении ФДЭ в инкубационную среду и в часть образцов теофиллин не добавляли. Реакцию проводили при 27 °С в течение 30 минут и останавливали кипячением в течение 3 минут на водяной бане. Об активности ФДЭ судили по разнице в концентрации цАМФ в пробах с теофиллином и без него. Активность ферментов выражали в наномолях цАМФ/мг белка в мин.
Образцы для определения концентрации цАМФ кипятили сразу. Очистку образцов от присутствия других циклических нуклеотидов и различных примесей проводили на колонке с нейтральной окисью алюминия (Lomovatskaya et al., 2006). Количество цАМФ определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (Lomovatskaya et al., 2011). Белок определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976).
Активность целлюлазы и пектиназы бактерий оценивали по методу определения редуцирующих сахаров (Вешняков и др., 2008). Активность ферментов выражали в мг/мл восстанавливающих сахаров, образующихся в результате гидролиза карбоксиметилцеллюлозы и пектата натрия
соответственно в течение 3 ч при 27°С.
Эксперименты проводили в трех аналитических повторностях.
Полученные результаты обрабатывали статистически с вычислением ошибки среднего.
RESULTS
Результаты проведенных исследований показали, что N-ФНА в концентрации 9 мкМ не оказывал влияния ни на рост, ни на активность компонентов АСС фитопатогена Cms (данные не представлены). Однако, в присутствие 45 мкМ N-ФНА наблюдалось снижение титра бактерий (рис. 1). В этих условиях значительно возрастал уровень цАМФ как в клетках бактерий, так и в среде их культивирования (рис. 2). При этом значительно возрастала активность рАЦ, как в самих бактериях, так и в среде их роста (рис. 3), тогда как рФДЭ активировалась лишь в клетках бактерий, а в среде роста существенно подавлялась (рис. 4). Активность трансмембранных форм АЦ и ФДЭ практически не менялась (данные не представлены).
Одним из факторов вирулентности Cms выступают пектиназы и целлюлазы, разрушающие клеточные стенки растений. В присутствии N-ФНА активности пектиназы и целлюлазы как в самих бактериях Cms, так и в среде их роста, практически не менялись (рис.5).
Figure 1. Влияние N-ФНА (45мкМ) на рост Cms
Figure 2. B.i/mHiie N-0HA Ha концентрацl/lк> цАМ0 y Cms
Figure 3. B.i/mHiie N-0HA Ha aKTiiBHOCTb рАЦ y ^s
Figure 4. B.i/mHiie N-0HA Ha aKTiiBHOCTb p0^ y ^s
Figure 5. Влияние N-ФНА на активность пектиназы и целлюлазы у ^s
DISCUSSION
Исследования показали, что увеличение концентрации цАМФ у Cms при воздействии 45 мкМ N-ФНА связано с большей активацией рАЦ, по сравнению с рФДЭ. В свою очередь, избыток сигнальной молекулы цАМФ привел к снижению способности клеток Cms к размножению, но не оказал влияния на активность их эндо- и экзо-пектиназ и целлюлаз. Как было показано ранее, контроль над пектиназой и целлюлазой у Rvl и бактериального патогена Psp осуществляет тАЦ (Ломоватская и др., 2015). Вероятно, что активность этих гидролитических ферментов практически не менялась из-за сохранения 100% активности тАЦ.
Также результаты исследований показали, что N-ФНА в физиологической для гороха концентрации 9 мкМ не оказывал влияния на бактерий Cms. Напротив, у Rvl и Psp, для которых горох является растением-хозяином, эта концентрация N-ФНА снижала титр планктонной культуры, что сопровождалось также снижением уровня цАМФ (Ломоватская и др., 2016). Таким образом, можно сделать вывод о том, что уровень цАМФ является весьма консервативным показателем для каждого вида бактерий. Поэтому как снижение, так и повышение нормы его уровня у бактерий приводит к снижению титра их планктонной культуры. В настоящее время нельзя сказать, почему на рост Cms и активность компонентов АСС оказывает влияние только 45 мкМ N-ФНА, но можно
предположить, что это носит неспецифический характер, в отличие от Psp и Rvl.
REFERENCES
Вешняков В.А., Хабаров Ю.Г., Н.Д. Камакина Н.Д. (2008) Сравнение методов определения редуцирующих веществ: метод Бертрана, эбулиостатический и фотометрический методы. Химия растительного сырья, 4, 47-50. Горбачева Л. А., Дударева Н.А., Салганик Р.И. (1991) Молекулярные механизмы устойчивости растений к патогенам. Успехи современной биологии, 111, 122- 136. Ломоватская Л.А. Макарова Л.Е., Кузакова О.В., Романенко А.С., Гончарова А.М. (2016) Влияние N-фенил^-нафтиламина на активность компонентов аденилатциклазной сигнальной системы и вирулентность бактериальных фитопатогенов и мутуалистов растений. Прикладная биохимия и микробиология, 52, 1-6. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Рыкун О.В. (2015). Трансмембранная аденилатциклаза контролирует факторы вирулентности фитопатогена Pseudomonas syringae и мутуалиста Rhizobium leguminosarum. Микробиология, 84, 404-410. Метлицкий, Л.В., Озерецковская, О.Л., Березин, И.В. (1985). Как растения защищаются от болезней. М.: Наука, 192 с. Макарова Л.Е. (2010) Физиологическое значение
фенольных соединений при формировании бобово-ризобиального симбиоза в
Kereszt A., Mergaert P., Maroti G., Kondorosi E. (2011) Innateimmuniyu effectors and virulence factors in symbiosis. Current оpinion in microbiology, 14, 76 -81.
неблагоприятных условиях. Дис. докт. биол. наук, СИФИБР СО РАН, Иркутск.
Макарова Л.Е., Смирнов В.И., Клыба Л.В., Петрова И.Г., Дударева Л.В. (2012) Роль аллелопатических соединений в регуляции и формировании бобово-ризобиального симбиоза.
Аденилатциклазная и гуанилатциклазная системы внутриклеточных вторичных посредников. Учебное пособие. Казанский государственный унивеситет. Казань.48 с.
Boswell-Smith V., Spina D., Page C. (2006) Phosphodiesterase inhibitors. Br. J. рharmacol,
the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry, 72, 248-254.
Hirsch A.M., Fujishige N.A. (2012) Molecular signals and receptors: communication between nitrogen-fixing bacteria and their plant hosts Biocommunication of Plants, 14, 255-280.
Lomovatskaya L.A., Romanenko A.S., Krivolapova N.V., Kopytchuk V.N. (2006). Biotic stress influence on the activity of the various forms of adenylate cyclase in cell organelles potato plants. J. of Stress Physiology & Biochemistry, 2, 10- 16.
Lomovatskaya L.A., Romanenko A.S., Filinova N.V., Dudareva L.V. (2011) Plant Cell Rep., 30, 125-132.
McDonough K.A., Rodriguez A. (2012) The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword. Nat. Rev. Microbiology, 10, 27 - 38.
Ono K. Oka R., Toyofuku M., Sakaguchi A., Hamada M., Yoshida S., Nomura N. (2014) cAMP signaling affects irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PAO. Microbes Environ, 29, 104 - 106.
Smith R.S., Wolfgan M.C., Lory S. (2004) Anadenylate cyclase-controlled signaling network regulates Pseudomonas aeruginosa virulence in a mouse model of acute Pneumonia. Infect. Immunology, 72, 1677 - 1684.
Прикл. биохимия и микробиология, 48, 1-9. Яковлев А.В., Яковлева О.В., Ситдикова Г.Ф (2009).
147, 252-257. Bradford M.M. (1976). A rapid and sensitive method for
