Индекс экспрессии факторов роста фибробластов tgf-β1 и FGF-2 в левом и правом желудочках крыс линии Вистар при адренергическом и холинергическом вариантах острого стресса Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.12-07:616.127-004:616-08-07

ИНДЕКС ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРОВ РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ TGF-B1 И FGF-2 В ЛЕВОМ И ПРАВОМ ЖЕЛУДОЧКАХ КРЫС ЛИНИИ ВИСТАР ПРИ АДРЕНЕРГИЧЕСКОМ И ХОЛИНЕРГИЧЕСКОМ ВАРИАНТАХ ОСТРОГО СТРЕССА

П.М.Губская, М.П.Рубанова, М.Е.Евсеев, Н.А.Кулик, В.С.Бондаренко, И.А.Атаев, Д.Р.Сулиманова

Институт медицинского образования НовГУ, zhmailova.svetlana@yandex.ru

В статье рассматриваются результаты экспериментального изучения степени экспрессии факторов роста TGF-U, FGF-2 в левом и правом желудочках сердца при различных моделях острого стресса.

Ключевые слова: экспрессия факторов роста, острый стресс, TGF-в, FGF-2, фиброз миокарда

The article presents the experimental research results of the degree of expression of the growth factors TGF-b and FGF-2 in left and right ventricles of a heart in different models of acute stress. Keywords: growth factor expression, acute stress, TGF-в, FGF-2, fibroid heart

В ранее проведенных нами экспериментальных исследованиях было показано, что морфоструктур-ные изменения левого и правого желудочков сердца при моделировании разных вариантов острого стресса развиваются асинхронно. При этом выраженные изменения сохраняются спустя месяц после одно-

кратного введения препаратов холинергического и адренергического действия. Подобная асинхронность ремоделирования левых и правых отделов сердца прослеживается и при изучении патологоанатомиче-ского материала у внезапно умерших гипертоников, и при оценке ремоделирования сердца пациентов с ги-

пертонической болезнью при помощи эхокардиогра-фии [1-3]. Учитывая известные физиологические эффекты факторов роста фибробластов TGF-fi, FGF-2 — способность стимулировать развитие миокардиально-го фиброза [4-8], который является морфологическим субстратом, в первую очередь, диастолической дисфункции сердца, — представляется интересным изучение степени экспрессии факторов роста TGF-B, FGF-2 в левом и правом желудочках сердца при различных моделях острого стресса.

Цель исследования: изучить экспрессию факторов роста фибробластов — TGF-pi и FGF-2 в миокарде крыс линии Вистар при различных вариантах острого стресса в эксперименте.

Материал и методы

Экспериментальная модель острого стресса проводилась на 2 сериях белых крыс — самцах линии Вистар (по 20 крыс в каждой серии). В I серии эксперимента острый адренергический стресс (АС) вызывали путем однократного интраперитонеального введения крысам адреналина из расчета 50 мкг/кг (доза адреналина подбиралась эмпирически, и главным условием было отсутствие при данной дозе некроза кардиомиоцитов); у крыс II серии однократным ин-траперитонеальным введением антихолинэстеразного препарата прозерин из расчета 20 мкг/кг моделировался острый холинергический стресс (ХС). Забор материала на исследование проводили через 2 часа, 6 часов, 24 часа и один месяц после однократного введения адреналина и прозерина.

Контролем служили 10 интактных крыс соответствующего возраста и массы.

Заливку и обработку материала проводили по ранее описанной методике [1]. Морфологические исследования [9] проводили в 45 полях зрения в каждом желудочке в каждой серии эксперимента. Оценивалось количество (в объемных процентах, об.%) кар-диомиоцитов, коллагена, сосудов и объема внеклеточного пространства.

Иммуногистохимические исследования проводились с использованием автоматической установки для иммуногистохимического и иммуноцитологиче-ского окрашивания препаратов Autostainer 360 (Thermo Shandon, Великобритания). Использовались мышиные моноклональные антитела к TGF pi (TB21) в разведении 1/100, кроличьи поликлональные антитела к FGF-2(147) в разведении 1/400 производства Santa Cruz Biotechnology, Inc., США, антитела к коллагену I типа, а также полимерная иммуногистохимическая система визуализации EnVision (DAKO, США) в соответствии с рекомендациями производителей реагентов. В качестве оптически плотной метки, визуализирующей продукт иммуногистохимической реакции, использовался диаминобензидин. Ядра клеток после проведения им-муногистохимической реакции докрашивались гематоксилином. Учет результатов иммуногистохимиче-ской реакции проводился с использованием светооп-тического бинокулярного микроскопа AxioscopeA1 (Carl Zeiss, Германия), TGF Р1, FGF-2 и коллаген I — позитивные клетки имели отчетливое коричневое окрашивание. В 9 полях зрения миокарда левого желудочка (ЛЖ) и правого желудочка (ПЖ) каждой крысы в проводимом эксперименте рассчитывался индекс экспрессии (ИЭ) — количество TGF-P1 и FGF-2 пози-

тивных клеток в 1 мм миокарда. Площадь 1 поля зрения, с учетом увеличения микроскопа (ув. х400), составляла 0,088 мм2 (из расчета длина изображения 0,355мм, умноженная на ширину изображения 0,248мм). Определялся индекс активности (ИА) эндо-телиоцитов, который рассчитывался как процент эндо-телиоцитов, экспрессирующих фактор роста фибробластов от общего количества клеток, экспрессирую-щих фактор роста фибробластов.

Результаты исследования показали, что индекс сильной экспрессии TGF-P1 при АС в левом желудочке и в правом желудочке значительно не отличались друг от друга. По индексу средней экспрессии TGF-P1 достоверных различий в ЛЖ и в ПЖ также не наблюдалось. Следует отметить, что наибольшее число позитивных клеток как с сильной, так и со средней экспрессией наблюдалось через 2 часа после введения адреналина. В последующих контрольных точках число экспрессирующих клеток неуклонно снижалось, достигая минимума через 24 часа (рис.1-4).

90

SO

70

60

50

40

30

, 1,3 2 часа

. 0,3 6 часов

0,3 24 часа

Индекс снльной экспрессии ~*~Индекс средней экспрессии |

Рис.1. Индекс экспрессии TGF-B1 в левом желудочке при адренергическом варианте стресса

3

2

с

о £

2 часа

"О1*--т

6 часов 24 часа 1 месяц

Индекс сильной экспрессии ■^^Индекс средней экспрессии |

Рис.2. Индекс экспрессии TGF-B1 в левом желудочке при холинергическом варианте стресса

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

12,6

2 часа

6 часов

1 месяц

■Индекс сильной экспрессии ■

■Индекс средней экспрессии |

Рис.3. Индекс экспрессии TGF-B1 в правом желудочке при адренергическом варианте стресса

. 90

Ъ

2 часа

6 часов

24 часа

1 месяц

-Индекс сильной экспрессии -

-Индекс средней экспрессии |

Рис.4. Индекс экспрессии TGF-B1 в правом желудочке при холинергическом варианте стресса

Следует особо выделить показатель ИЭ TGF-Р1 при холинергическом стрессе в ПЖ (рис.5) в контрольной точке 2 часа (88,4 клеток в 1 мм2), который был значительно выше, чем при АС и при обоих вариантах стресса в ЛЖ (рис.6).

а ' -л

i

"> ч

ч2

1 < /Л

Рис.5. Миокард правого желудочка через 2 часа после однократного введения прозерина. ИГХ реакция, ув.х400, TGF-p1 окрашен маркером (DAB) в коричневый цвет Сильная (1) и средняя (2) экспрессия TGF-^в эндотелиоцитах. Сильная и средняя экспрессия TGF-p1 в фибробластах, макрофагах, лимфоцитах

- N

V t

i

^ ^ ^гж л

„ > - ¿Йг t-Ж,

/ -^гЖш—

Ш* * ~ 0х

Ш Ш ' . £ Ji лФ

ЧТУ

Рис.6. Миокард левого желудочка через 2 часа после однократного введения прозерина. ИГХ реакция, ув. х400, TGF-p1 окрашен маркером (DAB) в коричневый цвет. Сильная (1) экспрессия P1-TGF в эндотелиоцитах. Сильная и средняя экспрессия TGF-^в макрофагах, фибробластах, лимфоцитах

ИЭ клеток с сильной экспрессией TGF-P1 через 2 часа при ХС был выше, чем при АС в ЛЖ в 9 раз (X2 = 3,669, р = 0,055), а в ПЖ — в 3,7 раза (р > 0,05). Индекс средней экспрессии TGF-P1 в 5,3 раза в ЛЖ (р < 0,05) и в 7,2 раза в ПЖ (р < 0,05) больше при ХС по сравнению с АС. В контрольной точке 6 часов индекс сильной экспрессии TGF-P1 в 16,7 раза в ЛЖ и в 8,3 раза в ПЖ при ХС больше, нежели при АС (р < 0,05). Индекс средней экспрессии TGF-P1 в точке 6 часов в 10,1 раза был больше при ХС по сравнению с АС в ЛЖ (р < 0,05) и в 4,7 раза — в ПЖ (р < 0,05). В контрольной точке 24 часа ИЭ значительно снижался при обоих вариантах стресса как в ЛЖ, так и в ПЖ. Через месяц после моделирования острого АС в обоих желудочках ИЭ был практически равен 0, а при ХС через месяц после однократного введения прозерина отмечалось некоторое увеличение ИЭ клеток с сильной экспрессией TGF-P1 в ЛЖ (рис.2), и ИЭ клеток со средней экспрессией TGF-p1 в ПЖ (рис.4).

Сопоставление экспрессии TGF-P1 с данными морфометрии в контрольных точках 2 и 6 часов при двух вариантах стресса показывает, что, несмотря на значительное преобладание экспрессии TGF-P1 при холинергическом стрессе, плотность коллагена (в об.%) была значительно выше в миокарде обоих желудочков при АС (см. табл.). Так, после введения адреналина плотность коллагена в ЛЖ составила 20,5±1,50 об.% через 2 часа и 24,3±1,66 об.% через 6 часов, тогда как при ХС 17,4±0,99 об.% и 13,6±1,23 об.% соответственно (в обеих контрольных точках различия достоверны, р < 0,05). В ПЖ плотность коллагена при АС через 2 часа после введения адреналина была 25,8±1,39 об.%, а при ХС — 16,9±0,97 об.% (р < 0,05).

Плотность коллагена (в об.%) в левом и правом желудочках при адренергическом и холинергическом вариантах стресса в контрольных точках

Адренергический вариант стресса

2 часа 6 часов 24 часа 1 месяц

ЛЖ 20,5±1,50 24,3±1,66 18,48±1,27 15,62±1,48

ПЖ 25,81±1,39 21,9±1,51 30,48±1,98 14,94±1,14

Холинергический вариант стресса

2 часа 6 часов 24 часа 1 месяц

ЛЖ 17,4±0,99* 13,6±1,23* 18,4±0,80 10,8±1,34*

ПЖ 16,9±0,97** 15,2±1,18** 12,5±1,1** 13,6±1,05

Примечание: * — достоверность различий при различных вариантах стресса в ЛЖ (р < 0,05); ** — достоверность различий при различных вариантах стресса в ПЖ (р < 0,05).

Таким образом, несмотря на большую экспрессию TGF-P1 при холинергическом стрессе, содержание коллагена при этом варианте стресса в миокарде меньше.

Анализ показал, что во всех контрольных точках как при АС (рис.7,9), так и при ХС (рис.8,10) число экспрессирующих FGF-2 клеток в левом и правом желудочках одинаково.

. 35 £ г

* 30

3 £

2 часа

6 часов 24 часа 1 месяц

■Индекс сильной экспрессии ■

■Индекс средней экспрессии |

Рис.7. Индекс экспрессии FGF-2 в левом желудочке при адренергическом варианте стресса

35 30 25 20

32,95

18,6

2 часа 6 часов 24 часа 1 месяц

Индекс сильной экспрессии —^Индекс средней экспрессии |

Рис.9. Индекс экспрессии FGF-2 в правом желудочке при адренергическом варианте стресса . 35 £

2 часа 6 часов 24 часа 1 месяц

| ♦ Индекс сильной экспрессии и Индекс средней экспрессии]

Рис.10. Индекс экспрессии FGF-2 в правом желудочке при холинергическом варианте стресса

При АС отмечалось постепенное снижение индекса сильной экспрессии FGF-2 в течение суток после введения препарата в обоих желудочках сердца (рис.7,9). Индекс сильной экспрессии FGF-2 при ХС достигал минимума через 6 часов с дальнейшим подъемом через 24 часа (рис.7,10).

35

г

I 30

то X

а

г 25

X

I 20 £

с

о

16,4

13,9

2 часа 6 часов 24 часа 1 месяц

-Индекс сильной экспрессии ■

-Индекс средней экспрессии |

Рис.8. Индекс экспрессии FGF-2 в левом желудочке при холинергическом варианте стресса

2/

X/

Рис.11. Миокард правого желудочка через 6 часов после однократного введения адреналина. ИГХ реакция, ув. х400, TGF-p1 окрашен маркером (DAB) в коричневый цвет. Сильная (1) и средняя (2) экспрессия FGF-2 в эндотелиоцитах. Средняя и слабая экспрессия FGF-2 в макрофагах, фибробластах

Индекс средней экспрессии FGF-2 при АС был максимальным в контрольной точке 6 часов как в ЛЖ, так и в ПЖ. Индекс средней экспрессии FGF-2 при ХС, в отличие от индекса средней экспрессии при АС, особо не менялся в контрольных точках 2-424 часа как в ЛЖ, так и в ПЖ. При этом индекс средней экспрессии FGF-2 через 6 часов при ХС был ниже по сравнению с АС в 2,1 раза в ЛЖ и в 2,8 раза в ПЖ.

> 4 /1Г •'< 4

2—

- /■ ■

• V

1 ^

Рис.12. Миокард правого желудочка через 2 часа после однократного введения адреналина. ИГХ реакция, ув. х400, TGF-p1 окрашен маркером (DAB) в коричневый цвет. Средняя экспрессия FGF-2 в эндотелиоцитах (1). Сильная и средняя (2) экспрессия FGF-2 в других непаренхиматозных клетках миокарда

То есть при ХС экспрессия FGF-2 протекала волнообразно: максимум через 2 часа и 24 часа, в отличие от АС, где максимум сильной экспрессии FGF-2 отмечался в контрольной точке 6 часов.

Индекс сильной экспрессии TGF-P1 при обоих вариантах острого стресса был максимальным через 2 часа после введения препаратов, при этом ИЭ TGF-P1 эндотелиоцитами при ХС как в ЛЖ, так и в ПЖ был значительно выше, чем при АС: в 7,8 раза (p < 0,05) в ЛЖ и в 3,7 раза в ПЖ (p > 0,05). Наиболее высокие значения ИЭ TGF-P1 отмечались при холинергиче-ском стрессе, особенно в ПЖ.

1. Weber V.R., Gubskaya P.M., Bondarenko V.S. Structural changes of heart in experimental animals in modeling of different versions of acute stress and opportunities for medical correction // Vestnik of Novgorod State University. Issue: Medical Sciences. 2011. №62. Р.39-43.

2. Вебер В.Р., Рубанова М.П., Губская П.М. и др. Холи-нергический и адренергический острый стресс и ремо-делирование миокарда в эксперименте // Клиническая медицина. Межвузовский сборник стран СНГ. Т.19. В.Новгород — Алматы, 2011. С.87-92.

3. Rubanova M.P., Weber V.R., Gubskaya P.M., et al. Asymmetric remodeling of Wistar's rats heart ventricles one month after acute stress // Abstracts of ESH Satellite symposium «Resistant hypertension». St. Petersburg, 2012. Р.30.

4. Anna Biernacka and Nikolaos G. Frangogiannis. Aging and Cardiac Fibrosis // Aging and Disease. 2011. Vol.2. Р.158-173.

5. Philipp Kalk, Yuliya Sharkovska, Elena Kashina, et al. Endo-thelin-Converting Enzyme/Neutral Endopeptidase Inhibitor SLV338 Prevents Hypertensive Cardiac Remodeling in a Blood Pressure-Independent Manner // Hypertension. 2011. №57. Р.755-763.

6. Michael Huntgeburth, Klaus Tiemann, Robert Shahverdyan, et al. Transforming Growth Factor b1 Oppositely Regulates the Hypertrophic and Contractile Response to b-Adrenergic Stimulation in the Heart // PLoS ONE 6(2011): e26628. doi:10.1371/journal.pone.0026628.

7. Asish K. Ghosh, William S. Bradham, Linda A. Gleaves, et al. Involvement of Constitutive Transforming Growth Factor — Signaling and Endothelial-to-Mesenchymal Transition // Circulation. 2010. №122. Р.1200-1209.

8. Norimichi Koitabashi, Thomas Danner, Ari L. Zaiman, et al. Pivotal role of cardiomyocyte TGF-ß signaling in the murine pathological response to sustained pressure overload // J. Clin. Invest. 2011. №121. Р.2301-2312.

9. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия: Руководство. М.: Медицина, 1990. С.204-205.

Bibliography (Translitеrated)

1. Weber V.R., Gubskaya P.M., Bondarenko V.S. Structural changes of heart in experimental animals in modeling of different versions of acute stress and opportunities for medical correction // Vestnik of Novgorod State University. Issue: Medical Sciences. 2011. №62. Р.39-43.

2. Veber V.R., Rubanova M.P., Gubskaja P.M. i dr. Kholinergicheskijj i adrenergicheskijj ostryjj stress i remodelirovanie miokarda v ehksperimente // Klinicheskaja medicina. Mezhvuzovskijj sbornik stran SNG. T.19. V.Novgorod — Almaty, 2011. S.87-92.

3. Rubanova M.P., Weber V.R., Gubskaya P.M., et al. Asymmetric remodeling of Wistar's rats heart ventricles one month after acute stress // Abstracts of ESH Satellite symposium «Resistant hypertension». St. Petersburg, 2012. Р.30.

4. Anna Biernacka and Nikolaos G. Frangogiannis. Aging and Cardiac Fibrosis // Aging and Disease. 2011. Vol.2. Р.158-173.

5. Philipp Kalk, Yuliya Sharkovska, Elena Kashina, et al. Endothelin-Converting Enzyme/Neutral Endopeptidase Inhibitor SLV338 Prevents Hypertensive Cardiac Remodeling in a Blood Pressure-Independent Manner // Hypertension. 2011. №57. Р.755-763.

6. Michael Huntgeburth, Klaus Tiemann, Robert Shahverdyan, et al. Transforming Growth Factor b1 Oppositely Regulates the Hypertrophic and Contractile Response to b-Adrenergic Stimulation in the Heart // PLoS ONE 6(2011): e26628. doi:10.1371/j ournal. pone .0026628.

7. Asish K. Ghosh, William S. Bradham, Linda A. Gleaves, et al. Involvement of Constitutive Transforming Growth Factor — Signaling and Endothelial-to-Mesenchymal Transition // Circulation. 2010. №122. Р.1200-1209.

8. Norimichi Koitabashi, Thomas Danner, Ari L. Zaiman, et al. Pivotal role of cardiomyocyte TGF-ß signaling in the murine pathological response to sustained pressure overload // J. Clin. Invest. 2011. №121. Р.2301-2312.

9. Avtandilov G.G. Medicinskaja morfometrija: Rukovodstvo. M.: Medicina, 1990. S.204-205.