CC BY
68
ii.Porsolt, R. D. Behavioral despair in mice: a primary screening test for antidepressants /R. D Porsolt, A. Bertin, М. Jalfre //Arch. Int. Pharmacodyn. Ther.-i977.-vol. 229.-№°2.-R 327-336. i2.Strekalova Т. Stress-induced anhedonia in mice is associated with deficits in forced swimming and exploration /X Strekalova, R. Spanagel, D. Bartsch, F. A Henn, P. Gass// Neuropsychopharmacology-
2004.-vol.29.-№ 11.-P. 2007-2017.
УДК 616.314:616.716+615.9
© А.Т. Зулькарнаева, С.В. Чуйкин, С.В. Аверьянов, Т.Р. Зулькарнаев, Л.А. Мусина, 2010
А.Т. Зулькарнаева, С.В. Чуйкин, С.В. Аверьянов, Т.Р. Зулькарнаев ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЛИЯНИЯ ЭКОТОКСИКАНТОВ НА ЗУБОЧЕЛЮСТНУЮ СИСТЕМУ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа
В статье представлены данные экспериментальных исследований, которые подтверждают влияние экотоксикантов лабораторных животных в пренатальный период, вызывая значительные нарушения гистогенеза костной ткани и зачатков зубов, что лежит в основе патогенеза зубочелюстных аномалий.
Ключевые слова: эксперимент, экотоксиканты, зубочелюстная система, лабораторные животные
A.T. Zulkamaeva, S.V. Chuikin, S.V.Averyanov, T.R. Zulkamaev
IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDIES OF THE EFFECT OF ECOTOXICANTS ON THE DENTITION SYSTEM OF THE LABORATORY ANIMALS
The paper presents data of experimental studies that confirm the effect of ecotoxicants during prenatal development of the laboratory animals. Ecotoxicants were found to cause considerable impairment in histogenesis of the osseous tissue and tooth germs that underlie pathogenesis of dentition abnormalities.
Key words: experiment, ecotoxicants, dentition system, laboratory animals
Изучению влияния различных химических веществ на организм человека и лабораторных животных посвящено большое количество работ отечественных и зарубежных авторов. Данные исследования помогают понять механизмы патогенеза патологических состояний и обосновать мероприятия для их профилактики.
А.Д.Абдазимов (1992), изучая механизм комплексного воздействия вредных факторов производственной среды на зубочелюстную систему в эксперименте на животных, которые находились на кариесогенном рационе, установил, что эти факторы приводят к увеличению частоты поражения зубов кариесом и существенно сказываются на тяжести течения кариозного процесса.
Э.М.Мельниченко с соавт. (1997) проводили облучение крыс, а затем и приплода с мощностью экспозиционной дозы 110 мР/ч. Малые дозы ионизирующей радиации оказывали влияние на структуру и развитие зачатков зубов.
Н.Н.Чешко, Г.А.Берлов (2002) провели опыты на 27 белых беспородных крысах. Облучение крыс проводили дозой 110 мР/ч. Малые дозы ионизирующей радиации значительно угнетали пролиферативную актив-
ность клеток зубных зачатков. Под действием облучения максимально изменилась площадь эмалевого органа. Авторами описаны деструктивные изменения базальной мембраны, зубной пластинки, частичное сохранение мембраны между внутренним эмалевым эпителием и пульпой эмалевого органа, снижение клеточной дифференцировки, что привело к уменьшению размеров, площади, количества слоев, вакуолизации, дискомплексации клеток, формированию кист, изменению формы и структуры зубных зачатков в целом.
Е.Ю.Апраксина с соавт. (2008) изучали морфологию зубных зачатков при воздействии вибрации. Измерение слоя дентина показало увеличение его толщины по сравнению с контролем на 45%. Площадь мезенхимы околозубных структур была увеличена на 76,5% в сравнении с контролем.
Все морфологические изменения, выявленные в зачатках зубов плодов, взятых от крыс, подвергавшихся вибрационному воздействию, свидетельствовали об ухудшении трофики клеточных элементов зубного зачатка.
Г.С.Чучмай и Н.И.Смоляр (1972), изучая зачатки зубов, утверждают, что при патологическом течении беременности минерали-
зация эмали зубов плода замедляется, а иногда приостанавливается на стадии начального обызвествления. А в постнатальном периоде минерализация улучшалась, но не достигала уровня обызвествления остальной эмали временных зубов.
А.А.Заюков (2007) провел эксперимент на 36 крысах по влиянию курения на зубочелюстную систему. Были выявлены наиболее многочисленные изменения некариозного происхождения, пигментированные зубы, патологическая стираемость, смещение зубов в зубном ряду и зубы атипичной формы у потомства "курящих" животных по сравнению с контрольной группой.
Предполагается, что повреждение клеточных и субклеточных мембранных структур тканей плода может выявляться как в результате непосредственного действия на формирующиеся ткани экотоксикантов, преодолевающих плацентарный барьер, так и действия свободных радикалов, образующихся при отравлении матери, циркулирующих затем в ее крови и активирующих процессы перекисного окисления липидов (Сениченкова И.Н., 1991; Хмызова Т.Г., 1991; Конторщикова К.Н., 2000). В то же время известно, что регуляция любых межклеточных взаимодействий как в норме (включая и эмбриогенез, и онтогенез), так и при патологии осуществляется системой цитокинов, определяющих тип и длительность иммунного ответа, контролирующих пролиферацию клеток, их дифференциацию, гемопоэз, воспаление и другие процессы (Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1995;
Пальцев М.А., Иванов А.А., 1995; Ярилин А.А., 1997; Мусина Л.А., 2006; Bettinger D.A. et.al., 1994; Sobiczwska E., Szmigielski S., 1997; Cucoranu I. et.al., 2005). Поэтому при влиянии отравляющих веществ последующие изменения тканей плода могут быть обусловлены и прямым токсическим действием свободных радикалов на ткани, и непрямым - через активацию провоспалительных и противовоспалительных генов, индукцию апоптоза и др. (Конторщикова К.Н., 2000). Нарушения механизма межклеточных взаимодействий вследствие избытка того или иного цитокина могут приводить к "повреждению" привычных клеточных коопераций, необходимых для нормального гистогенеза тканей и функционирования органов и тканей (Богомазов С.Ю. с соавт., 1997; Лебедева А.И. с соавт., 2004). Одним из показателей активации цитокинов может быть избыточная экспрессия в тканях трансформирующего фактора роста beta (TGF-beta1), который является многофунк-
циональным цитокином. Известно, что TGF-betai вовлекается в патогенез многих заболеваний, включая фиброз тканей и канцерогенез (Border W.A., Noble N.A., i993, i994; Moulin V., i995; Abraham D. J. et.al., 2000).
Материал и методы
Экспериментальные исследования по изучению токсического влияния экотоксикантов на костную ткань челюстей и зачатки зубов лабораторных животных проводили на кафедре общей гигиены и экологии БГМУ (зав. каф. - проф. Зулькарнаев Т.Р.).
Экспериментальные исследования по изучению влияния экотоксикантов на костную ткань челюстей и зубные зачатки проведены в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других целях (Страсбург, i986) и утверждены решением этического комитета ГОУ ВПО БГМУ Росздрава.
Эксперимент проводили на белых беспородных крысах массой i80-250. Всего в эксперименте было задействовано 60 животных. Все животные были разделены на 4 группы: контрольную и 3 опытных. Животные всех групп находились на обычном вива-рийном корме. Самкам, находящимся в стадии проэструса и эструса (предтечки и течки), на ночь подсаживали самцов в соотношении 4:i. Обнаружение спермиев во влагалищном мазке самки на следующее утро после подсадки указывало на оплодотворение - первый день беременности. В течение всей беременности самки находились в затравочных камерах. Для этого использовали 200-литровые стандартные затравочные камеры конструкций ЭТП РАМН.
В ходе эксперимента животных i-й опытной группы подвергали ингаляционному воздействию паров бензина, 2-й опытной группы - формальдегида и 3-й опытной группы комбинированному воздействию бензина и формальдегида. Животные контрольной группы находились в затравочных камерах и им подавали обычный воздух круглосуточно. Затравку экспериментальной группы осуществляли круглосуточно, в течение всей беременности животных.
Концентрация химических веществ поддерживалась на уровне предельно допустимой концентрации (ПДК) для атмосферного воздуха населенных мест: бензин - i00 мг/м3, формальдегид - 0,035 мг/м3. Крысят выводили из эксперимента ингаляционной передозировкой паров эфира на 14-й день жизни.
Иммуногистохимические исследования проводили в отделе морфологии ФГУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии Росздрава» (зав. отделом морфологии д-р мед. наук, профессор С.А.Муслимов).
На серийных парафиновых срезах толщиной 5 мкм с минимальной площадью 1см2 проводили иммуногистохимические исследования. Использовали непрямой стрептавидин-биотиновый метод с применением моноклональных антител к TGF-b1 - трансформирующему фактору роста-b (фирмы Santa Cruz Biotechnology). Уровень экспрессии TGF-P1 определяли путем измерения относительной площади специфического окрашивания на гистологических срезах костной ткани челюстей и зубных зачатков с помощью аппаратно-программного комплекса анализа изображений AXIO IMAGER-Z1 фирмы «CARL ZEISS» (Германия).
Результаты и обсуждение
Результаты иммуногистохимических исследований показали, что TGF-P1 - трансформирующий фактор роста (показатель развития фиброза ткани после воспалительных процессов) в тканях крыс контрольной группы, т.е. в норме не выявляется как в тканях зубных зачатков, так и в окружающих тканях (рис. 1, 2).
Рис.1. Отрицательная реакция на экспрессию трансформирующего фактора роста ТОР-р1 в тканях зубного зачатка крысы контрольной группы. Непрямой иммуногистохимический метод. Докраска гематоксилином
Рис. 2. Отрицательная реакция на экспрессию трансформирующего фактора роста ТОР-р1 в окружающих зубной зачаток тканях крысы контрольной группы. Непрямой иммуногистохимический метод. Докраска гематоксилином
При морфологическом исследовании зачатков зубов крыс (через 14 дней после рождения), рожденных от самок, подвергшихся ингаляционному воздействию экотоксикантов (формалин, бензин, сочетанное влияние формалина и бензина) во время беременности, нами были выявлены выраженные признаки нарушения гистогенеза зубов и патологические изменения околозубных тканей.
Рис.3. Положительная экспрессия (коричневое окрашивание) трансформирующего фактора роста ТОР-р1 в тканях периодонта вокруг зубного зачатка крысы после отравления формалином. Непрямой иммуногистохимический метод. Докраска гематоксилином
Рис.4. Экспрессия трансформирующего фактора роста ТОР-р1 (коричневый цвет): 1 - пульпа зубного зачатка крыс после отравления формалином. 2 - одонтобласты; 3 - дентин. Непрямой
иммуногистохимический метод. Докраска гематоксилином
Рис.5. Экспрессия трансформирующего фактора роста ТОР-р1 (коричневый цвет) в костной ткани альвеолярных отростков крыс после воздействия бензином
Рис.6. Экспрессия трансформирующего фактора роста TGF-pl (коричневый цвет) клетками наружнего эмалевого эпителия (i) зубных зачатков крыс после сочетанного отравления бензином и формалином. Непрямой иммуногистохимический метод. Докраска гематоксилином
■ Nj □
#' Р: В
пфиаяот ином Ср»яв
группы
Рис.7. Относительная площадь специфического окрашивания трансформирующего фактора роста ТОР-Ье1а1 на срезе тканей крыс при отравлении экотоксикантами. 1 группа - формалин, 2 группа - бензин, 3 группа - сочетанное отравление бензином и формалином. Фактор изменения в группах в разных тканях (взаимодействие двух факторов). КВФ (коэффициент влияния фактора) = 86%; ККК (коэффициент канонической корреляции) = 0,93; Б (коэффициент Фишера) = 415,6; достоверность р<0,05
Ткани периодонта в данной группе крыс давали иммуногистохимически положительную реакцию на присутствие цитокина (трансформирующий фактор роста - Р1), индуцирующего фибропластические процессы после воспаления (рис.3).
Иммуногистохимические исследования тканей зубных зачатков и окружающей костной ткани челюстей лабораторных животных всех опытных групп показали, что в рыхлой соединительной ткани пульпы, образующей зубные сосочки, а также в костной ткани, окружающей зубные зачатки выявляется выраженная экспрессия противовоспалительного цитокина трансформирующего фактора роста-бетта1 - ТОБ-Р! (показателя развития фиброза
ткани после воспалительных процессов) (рис.4,5).
Данный цитокин интенсивно экспрессировался даже клетками наружнего эмалевого эпителия зубных зачатков (рис.6).
Измерение оптической плотности окрашенных участков на срезах при выявлении в тканях крыс трансформирующего фактора роста-бетта1 - ТОБ-р1 показало, что наи-большое количество цитокина экспрессируется в тканях при сочетанном отравлении крыс формалином и бензином (рис.7).
Установленные рядом ученых (Чешко
Н.Н. с соавт., 2002; Заюков А. А., 2007; Апраксина Е.Ю., 2008) изменения структуры зубных зачатков лабораторных животных при влиянии различных факторов согласуются с полученными нами данными.
Аналогичные данные получены М.А.Даниловой с соавт. (2008) при изучении зачатков зубов под влиянием негативных пренатальных факторов. Авторами было установлено поражение всех клеточных элементов зубного зачатка (амелобластов, одонтобла-стов) и нарушение кровообращения.
Обладая непосредственным влиянием на дифференциацию мезенхимальных и эпителиальных клеток, на качество продуцируемых клетками компонентов внеклеточного матрикса, индуцируя фибропластические процессы в тканях, ТОБ-р1 в числе других про- и противовоспалительных цитокинов также вносит свою долю участия в искажение правильного хода морфогенеза тканей зубных зачатков и костной ткани челюстей лабораторных животных, что согласуется с данными других исследователей (Мусина Л.А., 2006; Sobiczwska E.,Szmigielski 8., 1997; УеггеееЫа Б., Ма^е1 А., 2002).
Таким образом, полученные нами результаты иммуногистохимического исследования свидетельствуют о том, что влияние экотоксикантов (формалина, бензина или их сочетаний) в антенатальный период вызывает значительные нарушения гистогенеза костной ткани и зачатков зубов у потомства лабораторных животных.
Сведения об авторах статьи
Зулькарнаева Айгуль Талгатовна - аспирант кафедры общей гигиены с экологией ГОУ ВПО БГМУ, 450000, г. Уфа, Ленина,3 Чуйкин Сергей Васильевич - Академик РАЕН, д.м.н., профессор, зав. кафедрой стоматологии детского возраста ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет». Адрес: 450000, г.Уфа, ул. Ленина,3 тел. (347) 272-97-86 Аверьянов Сергей Витальевич - к.м.н., доцент кафедры стоматологии детского возраста БГМУ, 450000, г.Уфа, ул. Ленина,3 Зулькарнаев Талгат Рахимьянович - д.м.н., профессор, зав. кафедрой общей гигиены с экологией ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет». Адрес: 450000, г.Уфа, ул. Ленина,3 тел. (347) 272-97-86
ЛИТЕРАТУРА
І. Абдазимов, А. Д. Экспериментальное изучение действия промышленных аэрозолей и токсических газов на состояние зубов [Текст] / А.Д. Абдазимов // Стоматология. - І992. - № 2. -С.6-8.
2. Апраксина, Е.Ю. Особенности развития зубных зачатков и изменения минерального обмена при вибрационном воздействии: результаты экспериментального исследования [Текст] / Е.Ю. Апраксина, С.В. Залавина А.П. Железная // Проблемы стоматологии. - 2008. - № 4. - С. 41-43.
3. Данилова, М. А. Влияние негативных пренатальных факторов на формирование органов полости рта [Текст] / М.А. Данилова, И.А. Захаров, А.П. Сидорова // Здоровье и образование в XXI веке: научные труды IX международного конгресса (27 - 30 ноября 2008 г., Москва). - М., 2008. - С. 189.
4. Заюков, А.А. Влияние курения родителей на стоматологический статус потомства [Текст] : автореф. дис.... канд. мед. наук. - М., 2007. - 29 с.
5. Кетлинский, С.А. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета [Текст] / С.А. Кетлинский, Н.М. Калинина // Иммунология. - 1995. - № 3. - С.30-44.
6. Конторщикова, К.Н. Перекисное окисление липидов в норме и патологии [Текст]: учебное пособие / К.Н. Конторщикова. - Н. Новгород, 2000. - 23 с.
7. Лебедева, А.И. Динамика экспрессии цитокинов TGFP1 и TNF-a после введения алло- и ксеногенного биоматериалов [Текст] / А.И. Лебедева, С.А. Муслимов, Л.А. Мусина // Морфология. - 2004. - Т. 126, № 4. - C. 70.
8. Морфометрия изменений одонтогенеза у крыс, вызванных малыми дозами ионизирующей радиации [Текст] / Э.М. Мельниченко, Н.Н. Чешко, Г.А. Берлов [и др.] // Здравоохранение. -1997. - № 10. - С. 19-21.
9. Мусина, Л.А. Дифференциация стволовых мезенхимальных клеток при подкожной имплантации различных биоматериалов [Текст] / Л.А. Мусина // Морфологические ведомости. - 2006.
- № 1-2. - С. 113-116.
10. Пальцев, М.А. Межклеточные взаимодействия [Текст] / М.А. Пальцев, А.А. Иванов. - М.: Медицина, 1995. - С. 26.
11. Сениченкова, И.Н. Об эмбриотоксическом действии загрязнителей производственной среды
- формальдегида и бензина [Текст]/И.Н. Сениченкова//Гигиена и санитария.-1991.-№ 9.-С.35-38.
12. Хмызова, Т.Г. Состояние временных зубов детей в зависимости от некоторых социальных и профессиональных условий матери в период беременности [Текст] : автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Казань, 1991. - 21 с.
13. Цитокины и внеклеточный матрикс при экспериментальных гломерулопатиях [Текст] / С.Ю. Богомазов, О.П. Гладских, А.А. Иванов [и др.]. Арх. патологии. - 1997. - Т. 59, № 6. - С. 45-50.
14. Чешко Н.Н. Изменения зачатков зубов в ранненм постнатальном периоде у крыс под влиянием доз ионизирующей радиации [Текст]/ Н.Н.Чешко, Г.А. Берлов // Современная стоматоло-гия.-2002.-С.34—36.
15. Чучмай, Г. С. Минерализация коронок молочных зубов в антенатальном периоде развития человека [Текст] / Г.С. Чучмай, Т.А. Смоляр // Терапевтическая стоматология. - Киев, 1972. -Вып. 7. - С. 51-53.
16. Ярилин, А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии [Текст] / А.А. Ярилин // Иммунология. - 1997. - №5. - С. 7-14.
17. Border, W.A. Cytokines in kidney disease: the role of transforming growth factor-beta [Text] / W.A. Border, N.A. Noble // Am. J. Kidney Dis. - 1993. - Vol. 22, N 1. - P. 105-13.
18. Moulin, V. Growth factors in skin wound healing [Text] / V. Moulin // Eur. J. Cell Biol. - 1995. -Vol. 68, N 1. - P. 1-7.
19. NAD(P)H oxidase 4 mediates transforming growth factor-beta1-induced differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts [Text] / I. Cucoranu, R. Clempus, A. Dikalova [et al.] // Circ. Res. -
2005. - Vol. 97, N 9. - P. 900-907.
20. Sobiczwska, E. The role of selected growth factors in the wound healing process [Text] / E. So-biczwska, S. Szmigielski // Przegl. Lek. - 1997. - Vol. 54, N 9. - Р. 634-638.
21. The role of inflammatory cytokines in wound healing: accelerated healing in endotoxin-resistant mice [Text]/D.A. Bettinger, J.V. Pellicane, W.C. Tarry [et al.]//J.Trauma.-1994.-Vol.36,N6.-P.810-3.
22. Tumor Necrosis Factor a Suppresses the Induction of Connective Tissue Growth Factor by Transforming Growth Factor-P in Normal and Scleroderma Fibroblasts [Text] / D.J. Abraham, X. Shiwen, C M. Black [et al.] // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275, N 20. - P. 15220-15225.
23. Verrecchia, F. Transforming growth factor-beta signaling through the Smad pathway: role in extracellular matrix gene expression and regulation [Text] / F. Verrecchia, A. Mauviel // J. Invest. Dermatol. - 2002. - Vol. 118, N 2. - Р. 211-215.
