CC BY
34
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2015 БИОЛОГИЯ Вып* 3
ГЕНЕТИКА
УДК 613.954:502.3+616.097
О. В. Долгих*^, К. Г. Старкова*, А, В. Кривиов\ О. А, Бубноваа,ь, Н. А. Вдовнна\ Е. А. Пирогова3
а ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения, Пермь, Россия b Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия
ИММУННЫЕ МАРКЕРЫ И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ У ДЕТЕЙ В УСЛОВИЯХ экспозиции ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ
Исследованы особенности иммунной регуляции и полиморфизма генов у детей, потребляющих питьевою воду с превышением гигиенических нормативов содержания в ней тяжелых металлов. Установлены: изменения показателей фагоцитарной активности, снижение концентрации сывороточного IgA, повышение уровня специфических антител IgG к стронцию и IgE к марганцу, а также снижение интенсивности апогггоза клетки, ассоциированного с рецепторами FAS и TNFR, а также транскрипционным фактором р53. Генетическая вариабельность генотипов детского населения, экспонированного стронциемк обусловлена мутантным гомозиготным вариантом генов FAS-рецептора и ММРУ, а также повышением частотности минорной гомозиготы ТР53 в обследуемой группе.
Ключевые слова: иммунная регуляция; полиморфизм генов; тяжелые металлы,
О. V. Dolgikh'1 ь, К. G. Starkova\ А. V. Krivtsov3, О. A. Bubnova*ь, N. A. Vdovina", Е. A. Pirogova1
а FSC for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies, Perm. Russian Federation b Perm State University. Регпг Russian Federation
IMMUNE MARKERS AND GENE POLYMORPHISM IN CHILDREN EXPOSED TO HEAVY METALS
The features of immune regulation and genetic markers in children living with a high content of heavy metals in drinking water were investigated. We revealed an increase in phagocytic activity, decreased serum IgA, elevated level of specific IgG antibodies to strontium and IgE to manganese, as well as reducing intensity of apoptosis via the Fas-receptor and TNFR and regulatory marker p53. Genetic variability of the child population was determined by the appearance of the mutant homozygous genotype variants in genes of FAS-receptor and MMP9, and increased frequency of minor homozygotes TP5л in the target group.
Key words: immune regulation; gene polymorphism; heavy metals.
Введение
Исследование особенностей иммунной регуляции, играющей ключевую роль в обеспечении го-меостаза и устойчивого функционирования в измененных условиях среды обитания, а также индивидуальной генетической вариабельности по приоритетным генам, которые определяют адаптацион-
ный потенциал организма, имеют важное значение для решения задач сохранения здоровья населения и минимизации последствий негативного внешне-средового воздействия [Зайцева, Устинова. Ами-нова, 2011; Долгих и др., 2012, 2014а, 20146; Зайцева и др.. 2014].
Цель работы - анализ особенностей иммунной регуляции и генетических маркеров у детского на-
С, Долгих О. В.. Старкова К Г., Кривцов А. В., Бубнова О. А.; Вдовина Н. А., Пирогова Е. А., 2015
240
селения в условиях повышенной средовой химической нагрузки тяжелыми металлами.
Материалы и методы
Проводили углубленное обследование детского населения в возрасте от 3 до 7 лет (71 ребенок), постоянно потребляющего воду с превышением гигиенических нормативов содержания в ней тяжелых металлов. Группу контроля составили 53 ребенка, проживающие на условно чистой территории с допустимым содержанием металлов в питьевой воде,
Содержание металлов в воде и биосредах детей определяли с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой. Показатели иммунной регуляции: IgE общий, интерлейкин-17, фактор некроза опухоли (ТОТальфа) исследовали методом иммуноферментного анализа. Маркеры гиперчувствительности (специфические IgG и IgE) изучали методом аллергосорбентного тестирования. Оценку фагоцитарной активности проводили с использованном формалинизированных эритроцитов барана, уровни сывороточных иммуноглобулинов классов А. ЬЛ. G - методом радиальной имму-нодиффузии по Манчини. Фенотипирование лимфоцитов по CD-маркерам и экспрессию маркеров апоптоза рецептора к Т^альфа (TNFR1+X белков р53 и Вах изучали с помощью проточной цитомет-рии методом мембранной иммунофлюоресценции с использованием меченых моноклональных антител. суммарно регистрируя не менее 10 000 событий. Интенсивность апоптоза оценивали по экспрессии фосфатидилсерина с помощью меченого аннсксина V (Annexin V-FITC) и фрагментации ДНК красителем 7-amino-actinomycin D (7-AAD). Статистический анализ полученных данных проводили с расчетом средней арифметической и её стандартной ошибки и t-критерия Стьюдента. Зависимости между признаками оценивали методом корреляционно-регрессионного анализа. Достоверными считались различия между группами при р<0.05
Забор материала для генетического анализа проводили методом взятия мазков со слизистой оболочки ротоглотки. Для определения генотипов использовали полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени и метод аллсльной дискриминации. Обработку данных по генотипи-рованию проводили в программе «Ген Эксперт» на основе диагностики однонуклеотидных полиморфизмов. Проведено изучение полиморфизма гена матриксной металлопротеиначы 9 (ММР9). рецептора запуска апоптоза (FAS), транскрипционного фактора р53 (ТР53).
Результаты и их обсуждение
Натурные исследования территории наблюдения по изучению качества воды хозяйственно-
питьевого водоснабжения показали его несоответствие установленным гигиеническим нормативам по содержанию стронция (превышение в 1.2 раза от предельно допу стимой концентрации, ПДК - 7,0 мг/л), а также достоверное превышение над соответствующими показателями качества среды на территории сравнения по марганцу в 11,5 раз, стронцию в 9.3 раза, свинцу в 7.5 раз, мышьяку в 1.3 раза.
При сравнении результатов содержания металлов в биосредах детей установлено превышение над показателями группы контроля по стронцию в 4.3 раза и по марганцу в 1,2 раза (р<0,05),
Результаты клинико-лабораторного исследования выявили функциональные изменения иммунной системы детей, Выявлено повышение фагоцитарной активности у 53.5-62% обследованных по критерию «процент фагоцитоза», «фагоцитарное число», «фагоцитарный индекс», достоверное относительно группы контроля (р<0.05). Математическое моделирование по критериям оценки шансов изменения показателей иммунитета при увеличении содержания металлов в биосредах детей показало достоверное возрастание фагоцитарной активности при повышении концентрации марганца, хрома, мышьяка никеля, стронция в крови (1*2=0.21-0.65 при р<0,05).
Содержание сывороточных иммуноглобулинов не отличалось от показателей физиологической нормы, при этом по сравнению со значениями группы контроля отмечено снижение уровня ^А в 1.2 раза (р<0,05). Анализ отношения шансов изменения показателей гуморального иммунитета при возрастании содержания контаминантов в биосредах детей установил снижение концентрации и при увеличении концентрации свинца, никеля, мышьяка в крови (К2=0.44-0.75 при р<0.05).
У 29.6% обследованных наблюдалось возрастание общей сенсибилизации по содержанию общего (120.714±57.499 МЕ/мл при норме <50.0, р<0.05). При увеличении концентрации хрома и мышьяка в крови достоверно увеличиваются шансы повышения ^Е общего (К2=0.53-0.81 при р<0.05).
Отмечен повышенный относительно референтного диапазона уровень специфической сенсибилизации к стронцию по критерию различия достоверны по критерию кратности превышения нормы (0 121±0 05 у,е. при норме <0.1 у.е.. р<0.05). В то же время при сравнении с аналогичными показателями группы контроля выявлено увеличенное содержание ^Е к марганцу в 2,3 раза (р<0.05).
Показатели межклеточной цитокиновой регуляции находились в пределах физиологической нормы, однако статистически установлено возрастание шансов повышения ТЫРальфа при росте концентрации никеля и мышьяка в крови (Я2=о.61-0,73 при р<0.05Х а также интерлейкина-17 при возрастании уровня свинш. никеля, мышьяка, стронция, хрома в крови (112=0.44-0.69 при
242 О. В. Долгих, К Г. Старкова, А. В. Кривцов, О А. Бубнова, Я А. Вдовина, Е. А. Пщюгова
р<0.05).
Исследование маркеров регуляции апоптоза (табл. 1) показало негативные изменения, связанные с процессом его запуска как через ТЫРШ. так и через С095 (Баз-рсцсптор), экспрессия которых была снижена относительно референтного интервала у 96.6% и 73,3% детей соответственно (р<0,05). Также у большинства обследованных выявлено значительное уменьшение клеток, экспрес-сирующих проапоптотический маркер р53. в среднем в 2,4 раза (р<0.05). при этом по фактору Вах достоверных отличий не наблюдалось. В то же время в 44.8% случаев отмечено снижение числа апоптозиых А11пехтУ-ПТС+7АА1>-клеток. По результатам математического моделирования процесса дальнейшее уменьшение данного показателя достоверно связано с увеличением содержания марганца, мышьяка, хрома, свинца и стронция в крови (112=0,34-0,77 при р<0.05).
Таблица 1
Особенности изменения маркеров апоптоза у детей, экспонированных тяжелыми металлами
Показатель Референтный интервал Груш Iii наблюдения
AnnexinV-riTC+ 1.5-2.5 1.743±0.27S
7AAD~ клетки. %
CD95*-лимфоциты, % 15-25 13.43±1,47*
TNFRI\ % 1-1.5 0,34±0,154*
p53, % 1.2-1.8 Ü.5ܱOT13*
Ba\, % 5-9 8,98±3.143
Примечание. * - разница достоверна относительно референтного интервала (р<0.05).
Выявленные изменения иммунных показателей у обследованных детей развиваются на фоне негативной генетической вариабельности, связанной с приоритетными генами иммунной регуляциик апоптоза и онкопролиферацин (табл. 2).
Таблица 2
Особенности генетического полиморфизма у детей, экспонированных тяжелыми металлами (встречаемость генотипов, %)
Ген Генотип Группа на- Группа кон-
блюдения троля
CC 63% 5Х%
FAS er 31% 42%
TT 6% 0%
CC 48% 44%
TP53 CG 38% 52%
GG 14% 4%
AA 37,5% 72%
MMP9 AG 50% 28%
GG 12.5% 0%
Проведенный анализ выявил появление му-тантного гомозиготного генотипа в группе наблюдения по генам FAS и ММР9 у 6% и 12.5% обследованных соответственно, при его отсутствии в группе контроля. Одновременно повышение встре-
чаемости минорного аллеля по гену ММР9 связано как с распространенностью гомозиготного, так и гетерозиготного варианта генотипа.
Анализ полиморфизма гена ТР53 позволил установить увеличение встречаемости мутантной гомозиготы в 3.5 раза относительно группы контроля.
Таким образом, в результате обследования детского населения, потребляющего питьевую воду с превышением гигиенических нормативов содержания в ней тяжелых металлов, выявлены функциональные изменения показателей иммунной регуляции. характеризующиеся повышением фагоцитарной активности, увеличением общей и специфической чувствительности к компонентам факторной нагрузки, а также уменьшением интенсивности процесса апоптоза клетки, опосредованные факторами его запуска и регуляции. Нарушения иммунной реактивности ассоциированы с особенностями генетического полиморфизма: мутантным гомозиготным вариантом генов FAS-рецептора и ММР9, а также повышением частотности минорной гомозиготы ТР53, ответственных за иммунную регуляцию и апоптоз.
Библиографический список
Долгих О. В. и др. Иммунная система и ее генетические ассоциации у детей при комбинированном внешнесредовом
воздействии // Вестник КазНМУ, 2014а. № 3(1). С 60-63. Долгих О. В и др. Особенности иммунной и генетической дезадаптации у детей в условиях избыточной гаптенной нагрузки // Российский иммунологический журнал. 2014. № Н(17), С 299-302,
Долгих О. В. и др, Иммунные и ДНК-маркеры воздействия техногенной нагрузки // Вестник Уральской медицинской академической науки 2012, №4, С, 240-241, Зайцева ИВ. и др, Особенности иммунной регуляции у детей В условиях комбинированного внешнесредового воздействия металлов и органических соединений // Академический журнал Западной Сибири, 2014 Т, 10. №2. С. 107-108. Зайцева И.В., Устинова О.Ю., А.миноаа A.M. Гигиенические аспекты нарушения здоровья детей при воздействии химических факторов среды обитания. Пермь: Кн. формат. 2011. 489 с,
References
Dolgikh O.V. et al. [Immune system and genetic associations in children with combined environmental effects]. VestmkKazNKfU. N 3(1) (2014a): pp. 60-63. (In Russ).
Dolgikh O.V. et al. [Features of immune and genetic maladjustment in children in conditions of excessive load liapenney]. Rossijskij immmoIogiCeskij èurnai N 8(17) (2014b): pp. 299-302. (In Russ.).
Dolgikh O.V. et al. [Immune and DNA markers of exposure to anthropogenic load]. Vestnik Ural skoj medicinskoj akademiäeskoj nauki. N 4 (2012): pp. 240-241, (In Russ ).
Zaitseva N.V, et al, [Features of immune regulation in children in the combined environmental impact of metals and organic compounds]. Akademiöeskij
Zitmal Zapadnoj Sibiri. V. 10. N 2 (2014); pp. 107-108. (In Russ ). Zaitseva N.V.. Ustinova O. Yu., Aminova A.I. Gigienideskie aspekty naruSenija zdorov ja detej pri vozdejsnii chimiteskich faktorov sredy obi-tanija [Hygienic aspects of violations of children's health when exposed to chemical factors of the habitat]. Perm. Kniznyj format PubL 2011. 489 p.
Поступила в редакцию 07.09,2015
Об авторах
Долгих Олег Владимирович, доктор медицинских наук, заведующий отделом иммунобиологических методов диагностики
ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» 614045, Пермь, ул. Монастырская. 82; olcgiafcrisk.ru, (342)2363930 профессор кафедры экологии человека и безопасности жизнедеятельности
ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990. Пермь, ул. Букирева, 15
Старкова Ксения Геннальевна, кандидат биологичесгага на>зс заведующая лабораторией иммунологии и аллергологии ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» 614045, Пермь, ул. Монастырская. 82, skg@fcrisk.ru, (342)2363930
Кривцов Александр Владимирович, кандидат медицинских наук заведующий лабораторией иммуногенетики
ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» 614045. Пермь, ул. Монастырская, 82; krivtsov@fcrisk.ru; (342)2363930
Бубнова Ольга Алексеевна, младший научный сотрудник лаборатории иммуногенетики ФБУН «Федеральный на>гчный центр медико-профилактичсских технологий управления рисками здоровью населения» 614045, Пермь, ул. Монастырская. 82, olegiafcrisk.ru; (342)2363930 аспирант биологического факультета ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990. Пермь, ул. Букирева, 15
About the authors
Dolgikh Oleg Vladimirovich, doctor of Medicine. Head of the Department of Immunobiological Diagnostics
FBSI "FSC for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies". 82. Monastyrskaya Str., Penn, Russia, 614045; oleg@fcrisk.ru; (342)2363930 professor of the Department of human ecology and life safety
Perm State University. 15. Bukirev sir., Perm, Russia. 614990
Starkova Ksenia Gennalievna. candidate of biology, Head of Allergy and Immunology Laboratory
FBSI "FSC for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies". 82, Monaslyrskaya Str., Perm, Russia, 614045; skg@fcrisk.ru; (342)2363930
Krivtsov Aleksandr Vladimirovich, candidate of Medicine, Head of Immunogenetics Laboratory FBSI "FSC for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies", 82. Monastyrskaya Str.? Perm, Russia, 614045: kmtsov@fciisk.ru; (342)2363930
Bubnova Olga Alekseevna, Junior Researcher, Immunogenetics Laboratory FBSI "FSC lor Medical and Preventive Health Risk Management Technologies". 82, Monastyrskaya Str., Perm, Russia, 614045: oleg@fcrisk ru; (342)2363930 Graduate Student of Biological Faculty Perm State University. 15. Bukirev str.. Perm, Russia. 614990
244 О: В. Долгих, К Г. Старкова, А. В. Кривцов, О А. Бубнова, Я А. Вдовина, Е. А. Пщюгова
Вдовина Надежда Алексеевна, лаборант-исследователь лаборатории клеточных методов диагностики
ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» 614045. Пермь, ул. Монастырская, 82; о\с%(аfcrisk.ru; (342)2363930
Пирогова Елена Алсксссвна, младший научный сотрудник лаборатории иммуногенетики ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» 614045. Пермь, ул. Монастырская, 82; olcg@fcrisk.ru; (342)2363930 аспирант биологического факультета ФПБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990. Пермь, ул. Букирева, 15
Vdovina Nadezhda Alekseevna. clinical research assistant of cellular methods of diagnostics laboratory
FBSI 'TSC for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies"* 82. Monastyrskava Str., Perm, Russia, 614045: oleg@fcri sk.ru; (342)2363930
Pirogova Elena Alcksccvna. Junior Rcscarchcr. Immunogenetics Laboratory FBSI 'TSC for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies". 82, Monastyrskaya Str., Perm, Russia, 614045; olegi3jfcrisk.ru; (342)2363930 Graduate Student of Biological Faculty' Perm State University. 15. Bukirev str., Penn, Russia. 614990
