CC BY
125
Идентификация сырья и продуктов животного и растительного происхождения
методом SDS-электрофореза
ТИХОМИРОВА Т. А., канд. биол. наук, ГОРОЖАНИНА Е. С.
Главный экспертно-аналитический центр «СОЭКС» автономной некоммерческой организации «Союзэкспертиза» Торгово-промышленной палаты РФ
ЕФРЕМОВА А. С.
Московский государственный университет прикладной биотехнологии АВЫЛОВ Ч. К., докт. вет. наук.
ОАО «Черкизовский мясоперерабатывающий завод»
Ветеринарно-санитарная экспертиза является одним из основных факторов исключения из торговли недоброкачественной и фальсифицированной мясной продукции. Важное место в контроле качества продуктов животного происхождения занимает определение видовой принадлежности мяса [2].
Используемые в большинстве случаев органолеп-тические и химические (анализ жирно-кислотного состава) методы для определения видовой принадлежности имеют существенные ограничения и не всегда дают однозначный ответ. ДНК-диагностика и иммуноферментный анализ довольно дороги. Также значительные трудности представляет идентификация белковых добавок растительного (соевые белки) и животного (субпродукты, кровь, казеинаты и др.) происхождения. Эти проблемы могут быть успешно решены с использованием современных электрофоретических методов, которые давно используются в научно-исследовательских лабораториях [3]. Однако для применения их с целью экспертизы пищевых продуктов и внедрения в практику экспертных лабораторий необходима разработка и стандартизация оптимальных условий экстракции белков и электрофоретического разделения.
Проблемы скорости и воспроизводимости анализа были решены благодаря созданию автоматизированных приборов, обеспечивающих быстрое разделение белков и окраску гелей в стандартных условиях. К таким приборам относится система PhastSystem (Pharmacia, Швеция) [4].
С целью идентификации сырья и нетермообработан-ных мясных продуктов на основе SDS-электрофореза проведены исследования по разработке оптимальных способов экстракции белков из пищевых продуктов для последующего анализа их электрофоретическим методом; разработке метода видовой идентификации по выявлению видоспецифических маркерных белковых зон на электрофоретических спектрах и количественной оценке соевого компонента в составе мясных продуктов.
В качестве объекта исследования использовали на-тивные образцы мяса (свинина, говядина), модельные смеси различных образцов мяса с добавлением гидрати-
рованной соевой муки, нетермообработанные рубленые полуфабрикаты и фаршевые изделия.
При исследовании применяли метод SDS-электрофо-реза с помощью автоматизированной системы PhastSystem (Pharmacia, Швеция). Для возможности сравнения электрофореграмм, полученных в разное время, необходимо соблюдение одинаковых условий электрофореза и предфорезной обработки образцов.
SDS (додецилсульфат натрия) - анионный детергент, в комплексе с белком имеет одинаковый отрицательный заряд, поэтому процесс разделения происходит только по одному параметру - размеру молекул. Для четкого и воспроизводимого разделения белковых зон важен подбор оптимальных условий экстракции. Образцы обрабатывали солюбилизирующим буфером (pH 8,0), содержащим 0,01М Трис-HCl, 0,001М ЭДТА, 1 % SDS и 5 % ß-меркаптоэтанола. Наилучшее разделение белковых зон происходило при соотношении образца и солюби-лизирующего буфера 1: 2.
Предфорезная обработка гомогенатов заключалась в прогревании при температуре 96°С в присутствии со-любилизирующего буфера и последующем их центрифугировании. Автоматизированная система PhastSystem снабжена блоком управления, позволяющим проводить электрофорез и окраску полиакриламидных гелей в стандартных условиях. В данном случае использовали полиакриламидные гели PhastGel с градиентом 10-15. В качестве красителя используется реагент Phast Gel Blue R (это краситель Coomassi R-350).
Для определения доли каждого компонента в многокомпонентном фарше проводили денситометрию электрофореграмм с применением лазерного сканирующего денситометра «Epson» (Epson Perfection 3200). По соотношению пиков маркерных видоспе-цифических белков в образцах мяса и в образце смешанного фарша вычисляли долю каждого компонента по формуле:
С=В/Ах 100%
где: А - величина маркерного пика в индивидуальном образце;
В - величина того же маркерного пика в смешанном фарше;
С - процентное содержание анализируемого компонента в смешанном фарше.
Экстракты различных видов пищевых продуктов после электрофоретического разделения имеют различные белковые спектры. На этих спектрах присутствуют белковые зоны общие для различных видов, а также белковые зоны, характерные только для определенных видов животных - так называемые видоспецифические белки. По этим белковым зонам можно идентифицировать виды мяса. Поэтому этим зонам условно дано название маркерные зоны. Растительные белки также имеют характерные белковые спектры. Наличие в анализируемом фарше того или иного вида мяса или какой-либо пищевой добавки устанавливали по выявлению на электро-фореграмме исследуемого образца соответствующих видоспецифических маркерных зон. Различные образцы можно сопоставлять только при одновременном электрофорезе тестируемого образца и предполагаемых его компонентов.
Сравнивая электрофореграммы свинины и говядины (рис. 1) было замечено, что наряду с белками, общими для свинины и говядины, имеются белковые зоны, преобладающие в определенном виде мяса. Из данных рис. 1 следует, что зона А преобладает в говядине, а зона Б в свинине. Их принимали за видоспецифические маркерные зоны.
Для оценки соотношения свинины и говядины приготовляли несколько образцов сырого фарша с различным содержанием компонентов.
Отношение площадей маркерных пиков А/Б составляет 1,45 и 0,45 при изготовлении фарша соответственно из говядины и свинины, а в смешанном фарше - 1,25, 0,72 и 0,43 при их соотношении соответственно 80: 20, 50: 50 и 20: 80. При увеличении содержания говядины в смешанном фарше соотношение площадей маркерных пиков А и Б увеличивается (рис. 2). При необходимости идентификации состава рубленых полуфабрикатов и фаршевых изделий, состоящих из свинины и говядины, можно определять наличие компонентов (с ошибкой не более 20 %) и оценивать их соотношение.
Для замены животного белка в рубленых полуфабрикатах и фаршевых изделиях часто используется соевый белок [1], наличие которого также можно обнаружить электрофоретическим методом. Рекомендуемое количество гидратированной соевой муки в рецептурах рубленых полуфабрикатов и фарша 20...50 % (1...5 % соевого белка от состава продукта). Различные виды соевых добавок, используемых в мясоперерабатывающей промышленности (изолированный соевый белок, концентрат соевого белка, соевая мука, текстурированный соевый белок), схожи по электрофоретическим спектрам. Доминантные белковые зоны различных образцов сои отсутствуют в экстрактах мясных изделий и поэтому могут быть использованы в качестве маркерных зон при выявлении их в смешанных продуктах (рис. 3).
Для оценки количества растительных добавок использовали несколько образцов сырого фарша с добавлением различного количества соевой муки. Из электро-
0
100
200
300 400 500 600 Расстояние от анода, усл. ед.
Рис. 1. Видоспецифические маркерные зоны говядины и свинины на геле и денситограмме
700 800
^1,6 <
0 1,4 о
£ 1,2 С
' 5 1,0
д
Ц0,8
о
ЕЁ 0,6
е
| 0,4 е
1 0,2 с§0,0
0 20 40 60 80 100 Содержание говядины в смешанном фарше, %
Рис. 2. Отношение площадей маркерных пиков говядины и свинины
»
— щ Г? гт
'—>, ,—ч
Л "Г"» «"Н
г^ог
Табл. 2. Зависимость площадей маркерных пиков сои от ее концентрации в образцах
Показатель Полоса
А Б В Г
Концентрация сои,
мг/ мл:
0,1 226,5 325,1 136,4 422,4
0,2 497,8 600,3 265,7 943,1
0,3 681,4 824,3 416,4 1124,9
0,4 849,7 1015,0 432,3 1402,9
Состав образца Отношение зон
А / Б А / В
Компонент, %:
Говядина - 100 5,86 5,37
Соя - 100 0,06 0,07
Говядина и соя:
80...20 3,96 1,64
70...30 2,42 1,00
60.40 1,08 0,47
50.50 0,70 0,35
В
Табл. 1. Отношение площадей маркерных пиков говядины к сое при различном соотношении компонентов
30
ВСЕ О МЯСЕ, 2-2007
100
200 300 400 500 Расстояние от анода, усл. ед.
600
700
Рис. 3. Видоспецифические маркерные зоны говядины и сои на геле и денситограмме
100
80 60 40
Содержание говядины в фарше, %
20
Рис. 4. Коэффициент отношения площадей маркерных зон говядины и сои
1600
.1400 д
i 1200 с1000 -800 600 400 200 0
К Полоса А О Полоса Б
0 0,1 0,2 0,3 0,4 Концентрация сои, мг/мл
Рис. 5. Зависимость площадей маркерных пиков от концентрации сои
фореграммы следует, что специфическая доминантная белковая зона говядины А с повышением количества соевого белка постепенно исчезает, а маркерные зоны сои Б и В увеличиваются. Для более точной оценки количества добавленного соевого белка можно вычислить соотношение площадей зон А к Б и А к В (табл. 1, рис.4). Ошибка определения не более 15 %.
Количественное содержание сои в фаршевых изделиях также можно оценить по калибровочной кривой (табл. 2, рис. 5). С этой целью были приготовлены образцы
с концентрацией соевого белка 0,1...0,4 мг/мл (это соответствует 10...40 % замене мясного белка соевым).
При одновременном нанесении на гель исследуемого фарша и соевого белка или полуфабриката и соевого белка в нескольких известных концентрациях можно оценить соотношение составных компонентов продукта (ошибка не более 15 %).
Разработанный метод позволяет идентифицировать видовую принадлежность белка в смешанных фаршах, а также оценить количество содержания немясных компонентов в исследуемом образце.
Анализ полученных результатов показывает, что если содержание сои в составе продукта оценивать по методу определения коэффициента отношения площадей пиков А/Б, то нанесение на гель калибровочных смесей одновременно с определяемыми образцами не требуется. В случае определения содержания сои по калибровочной кривой необходимо одновременное нанесение на гель не менее трех точек калибровочной смеси и исследуемых экстрактов.
Из 51 проанализированного образца смешанных фаршей и полуфабрикатов (котлет, пельменей и др.) в составе 20 идентифицировано только мясное сырье, в 7 - добавка соевого белка до 1 % от общего состава продукта (до 10 % замены белка), в 24 содержание соевого белка - 1.5 % (это составляет 10.50 % замены мясного белка). В 17 образцах из 31 информация о наличии соевого белка не вынесена на этикетку.
Таким образом, подобран оптимальный способ экстракции белков из пищевых продуктов (оптимальный состав буфера pH 8,0: 0,01 М Трис-HCl, 0,001 ЭДТА, 1 % додецилсульфата и 5 % 6-меркаптоэтанола), определены видоспецифические маркерные белковые зоны, по которым может быть проведена идентификация видовой принадлежности белка.
На основе метода SDS-электрофореза в сочетании с денситометрией разработан способ качественной и количественной оценки различных составляющих многокомпонентного фарша.
Приведенные данные показывают возможность использования метода SDS-электрофореза в системе PhastSystem для определения видовой принадлежности мяса и выявления растительных белковых добавок в составе рубленых полуфабрикатов и фаршевых изделий. Для количественного определения сои электрофорети-ческие методы являются уникальными. Решение проблемы идентификации видового состава дает возможность наиболее качественного анализа продуктов питания и имеет большое практическое значение.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гутник Б.Е., Сметанина Л.Б., Икач М., Стаменович Я., Маликова В.И. Соевая мука стабильного качества для мясных продуктов // Мясная индустрия. 2005. №2. С. 63-65.
2. Николаева М.А., Лычников Д.С., Неверов А.Н. Идентификация и фальсификация пищевых продуктов // М.: Экономика, 1996. С. 84-95.
3. Fleming I., Lumbley J. Validation of new techniquies for the analysis of foods.-Food Sciens and technology today// 1995. V.9, №2. P. 84-85.
4. Seymour C. Electrophoresis technology: food and reverage analysis.-Food Tech. Europe// 1993. Sept/Nov. P. 127-131.
0
0
