CC BY
90
■ И I II II
■тп
Новости клеточных технологий
10. Van Kempen Van Ginneken A., De Grijs I. et al. Expression
of the eleotrophysiologioal system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cellular Physiology and Biochemistry 2003; 13: 263—70.
11. Cho T., Bae J.H., Choi H.B. et al. Human neural stem cells: Electrophysiological properties of voltage-gated ion channels. NeuroReport 2002; 13: 1447-52.
12. Konig S., Hinard V., Arnaudeau S. et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. Journal of Biological Chemistry 2004; 279: 28187-96.
13. Sun W., Buzanska L., Domanska-Janik K. et al. Voltage-sensitive and ligand-gated channels in differentiating neural stem-like cells derived from the nonhematopoietic fraction of human umbilical cord blood. Stem Cells 2005; 23: 931-45.
14. Fischer-Lougheed J., Liu J.H., Espinos E. et al. Human myoblast fusion requires expression of functional inward rectifier Kir2.1 channels. Journal of Cell Biology 2001; 153: 677—85.
15. Liu J.H., Bijlenga P., Fischer-Lougheed J. et al. Role of an inward rectifier K+ current and of hyperpolarization in human myoblast fusion. Journal of Physiology 1998; 510: 467—76.
16. Altizer A.M., Moriarty L.J., Bell S.M. et al. Endogenous electric
current is associated with normal development of the vertebrate limb. Developmental Dynamics 2001; 221: 391—401.
17. Avram M.M., Avram A.S., James W.D. Subcutaneous fat in normal and diseased states. 3. Adipogenesis: From stem cell to fat cell. Journal of the American Academy of Dermatology 2007; 56: 472—92.
18. Spiegelman B.M. PPAR-c: Adipogenic regulator and thiazolidinedione receptor. Diabetes 1998; 47: 507—14.
19. Zur Nieden N.I., Kempka G., Ahr H.J. In vitro differentiation of embryonic stem cells into mineralized osteoblasts. Differentiation 2003; 71: 18-27.
20. Hoenicke E.M., Damiano Jr R.J. Superior 12-hour heart preservation with pinacidil hyperpolarizing solution compared to University of Wisconsin solution. Journal of Heart and Lung Transplantation 2001; 20: 1106—14.
21. Lawson K. Potassium channel openers as potential therapeutic weapons in ion channel disease. Kidney International 2000; 57: 838—45.
22. Nielsen-Kudsk J.E. Potassium channel modulation: A new drug principle for regulation of smooth muscle contractility. Studies on isolated airways and arteries. Danish Medical Bulletin 1996; 43: 429—47.
23. Xiong Y., Harmon C.S. Evidence that diazoxide promotes calcium influx in mouse keratinocyte cultures by membrane hyperpolarization. Skin Pharmacology 1995; 8: 309—18.
Подготовила А.С. Григорян
По MarepnanaMiSundelacruz S., Levin М., Kaplan D.L. Membrane potential controls adipogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells, Plos One 2008; 3
Идентификация истинно стволовых клеток скелетной мышечной ткани в популяции миосателлитоцитов
В результате эмбрионального миогистогенеза из стволовых клеток миотома сегментированной мезодермы путем дивергентной дифференцировки развиваются два взаимодействующих между собой дифферона: камбиальный и симпластический, которые формируются параллельно и определяют в постнатальном периоде репаративные свойства [1, 2]. Первый дифферон представлен миосателлитоцитами, впервые описанными А. Маиго (1961), развивающимися из промиоцитов, локализуется между базальной пластинкой и сарколеммой мышечных волокон и является морфофункциональной основой камбиального резерва тканевой системы скелетной мышцы. В постнатальном периоде активная пролиферация миосателлитоцитов определяется уже к третьему дню после повреждения ткани. После серии митозов в посттравматическом рабдомиогенезе из них формируется популяция миобластов, которые, сливаясь, образуют новые мышечные симпласты [1—3]. Симпластический дифферон также участвует в репаративной регенерации: вблизи линии разрыва волокна делятся, ядра, симпласты колбообразно утолщаются с формированием «мышечных почек», растущих по направлению друг к другу с тенденцией к слиянию [4]. Однако вопрос о механизмах репаративной регенерации мышечных симпластов до настоящего времени остается дискуссионным. Это связано с появлением данных о возможности реализации репаративного процесса за счет клеток, образующихся посредством отделения ядросодержащей части симпластов. Значительную сложность представляет собой доказательство этого механизма, так как с момента отделения «ядерно-саркоплазмати-ческой территории» (если этот процесс реален), она становится неотличима по ультраструктуре от мио-сателлитоцита [2].
Несмотря на наличие ряда механизмов репаративной регенерации скелетной мышечной ткани, гистоти-пическое восстановление целостности мышц после значительных повреждений ограничено — место дефекта заполняется соединительной тканью [4]. В этой связи достаточно перспективным является изучение механизмов стимуляции репаративной регенерации скелетной мышечной ткани [2], особенно в части, касающейся миосателлитоцитов.
Большинство исследователей отмечают, что популяция миосателлитоцитов гетерогенна, однако нет общепринятого унифицированного разделения на субпопуляции: каждая исследовательская группа предлагает свой вариант в соответствии с поставленными целями и примененными методами. В частности, замечено, что мио-сателлитоциты различаются по экспрессии CD34 и Myf5 с присутствием немногочисленной фракции, представители которой не экспрессируют ни один из них [5]. Ряд авторов предполагают, что именно эта группа составляет популяцию стволовых клеток, в то время как оставшаяся большая часть — коммитированные в миогенном направлении клетки [6, 7]. По другим данным, экспрессия Myf5 отражает лишь степень активности, а не детерминацию дифференцировки, за которую ответственен MyoD [8].
Одной из важнейших характеристик стволовых клеток является способность к самообновлению in vivo — долгосрочной пролиферации без сопутствующей дифференцировки [9]. Поэтому для обоснованного определения одной из субпопуляций миосателлитоцитов как миогенных стволовых клеток большинство исследователей пытаются установить способность их к многократному делению, используя, главным образом, метод серийных трансплантаций [10, 11], который, однако, не обладает достаточной чувствительностью и не позволяет в полной
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009
I I I I I I
Новости клеточных технологий
мере оценить экспансию непосредственно в организме лабораторного животного, а также произвести прижизненное изучение динамики пролиферации клеток в ответ на стимуляцию. В этой связи, особый интерес представляет работа A. Sacco с соавт. (2008), демонстрирующая способность части сателлитоцитов к долгосрочной пролиферации in vivo с использованием высокочувствительного биолюминесцентного метода.
Исследователи использовали трансгенных мышей в качестве доноров CD34+/integrin-—7+/Pax7+/Myf5+ са-теллитных клеток, в которых Myf5 был сцеплен с геном светлячковой люциферазы (firefly luciferase, FLuc) — индуктором биолюминесцентного сигнала. Около четверти полученных сателлитоцитов не экспрессировали MyoD, что свидетельствовало о гетерогенности клеточной популяции. Линейность, чувствительность и воспроизводимость биолюминесцентного сигнала для определения численности клеток были подтверждены in vitro, где минимальное количество клеток, выявляющихся с помощью определения метки, было равно десяти.
При трансплантации 5000 меченых миосателлито-цитов в область передней большеберцовой мышцы, предположительно лишенной нативных прогениторов местным облучением в дозе 18 Гр, через 4 нед. наблюдалось шестидесятикратное усиление биолюминисценции,
соответствующей сигналу от 3x10s клеток. Гистологически определялись образованные за счет введенных миосателлитоцитов мышечные симпласты. В контроле, при трансплантации даже большего количества (20000) постнатальных миобластов к тому же сроку наблюдалось значительное ослабление свечения, что свидетельствует о снижении численности введенных клеток, признаки рабдомиогенеза не выявлялись.
Исследователи также установили, что даже при введении всего 10 миосателлитоцитов в 16% случаев наблюдается значительная экспансия in vivo. По мнению авторов, такая доля положительных случаев обусловлена гетерогенностью, выживаемостью клеток после изоляции и трансплантации, а также порогом обнаружения биолюминесценции. Стечением времени численность популяции подвергалась стабилизации, скорость наступления которой определялась исходным количеством трансплантированных миосателлитоцитов: чем меньшее количество было введено, тем позже наблюдалась «фаза плато». Выход из периода пролиферативного покоя наблюдался при двукратной травматизации мышцы в виде восьмидесяти- и стократного увеличение численности популяции соответственно. Важно, что окончанием каждой «волны пролиферации» являлось некоторое снижение численности клеток за счет апоптоза
Схематическое представление динамики изменения численности трансплантированных миосателлитоцитов [красная линия) в сравнении с коммитированными миобластами [синия линия): три волны пролиферации
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
29
(установлено иммуногистохимическим методом), что может быть связано с устранением физиологической избыточности функционального ответа на повреждение. При отсутствии повреждений количество клеток достигало максимума к концу второй недели без последующего падения. В контроле численность введенных миобластов снижалась с первых дней после трансплантации.
Пролиферация миосателлитоцитов как основа усиления биолюминесцентного сигнала подтверждалась высоким уровнем экспрессии Ki-67, установленным на 7, 13 и 19-е сут. эксперимента.
На последнем этапе исследователи в опытах in vitro и in vivo показали, что в 4% случаев даже одна клетка способна к долгосрочной пролиферации (около 14—17
делений). Выделенные через два месяца дочерние клетки трансплантированных миосателлитоцитов, согласно иммуногистохимическому и генетическому анализу, не отличались от введенных клеток.
Таким образом, авторы с использованием биолюминесцентного метода привели доказательства, позволяющие предположить, что гетерогенная популяция сателлитоци-тов включает истинно стволовые клетки, способные к долгосрочной пролиферации и дифференцировке в мио-генном направлении. Разработка высокоселективных методов их получения может послужить основой для дальнейшего применения в рамках клеточной терапии для лечения пациентов с повреждениями мышечной системы.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Данилов Р.К. Источники развития миобластов при регенерации скелетных мышц. Онтогенез, 1983; 14С5): 551—5.
2. Данилов Р.К. Очерки гистологии мышечных тканей. — Уфа: Башкортостан, 1994. — 50с.
3. Клишов А.А. Гистогенез, регенерация и опухолевый рост скелетной мышечной ткани. Л. : Медицина, 1971. — 175 с.
4. Повзун С.А. Общая патологическая анатомия. Учебное пособие для медицинских вузов. — СПб.: СОТИС, 2DD6. — 336 с.
5. Beauchamp J.R., Heslop L., Yu D.S. et al. Expression of CD34 and myf5 defines the majority of quies cent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 2000; 151: 1221-34.
6. Seale P., Asakura A., Rudnick M. A. The Potential of Muscle Stem Cells. Developmental Cell 2001; 1: 333-42.
7. Kuang S., Kuroda K., Le Grand F. et al. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell 2007; 129t5]: 999—1010.
8. Sacco A., Doyonnas R., Kraft P. et al. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature 2008; 456C7221): 502—6.
9. Deasy B.M., Gharaibeh B.M., Pollett J.B. et al. Long-Term Self-Renewal of Postnatal Muscle-derived Stem Cells. MBC 2005; 16 [71: 3323—33.
10. Collins C.A. Satellite cell self-renewal. Curr Opin Pharmacol 2006; 6t3]: 301-6.
11. Mauro A. Satellite cells of muscle skeletal fibers. J. Biophys. Biochem. Cytol. 1961; 9: 493—5.
Подготовил ИЯ. Бозо
По материалам: Sacco A., Doyonnas R„ Kraft P. et al. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature 2008; 456(7221): 502-6
КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ
Первая успешная трансплантация тканеинженерной трахеи в клинике
Выраженные стенозы дыхательных путей, причиной которых являются устойчивые к радио- и химиотерапии опухоли, инфекции или травмы, представляют собой серьезную медицинскую проблему, так как в ряде случаев для них не существует эффективных реконструктивных методов лечения. Для пациентов с этой патологией часто единственным решением является операция бронхэк-томии с последующим наложением анастомоза между свободными концами [1]. Однако длина изымаемого участка, как правило, ограничена несколькими сантиметрами и ее увеличение возможно только в случае замещения органа. С другой стороны, все попытки создания аутогенных и синтетических трансплантатов до настоящего времени были неудачными, а использование в клинической практике аллогенных трансплантатов имеет значительные ограничения [1—4].
В доклинических испытаниях с использованием тканеинженерных эквивалентов трахеи и бронхов предлагались слишком длительные и трудоемкие методики, чтобы применять их в рутинных клинических операциях [5], или же использовались искусственные матриксы
[4], которые невозможно представить в качестве альтернативы живой ткани. Группа исследователей P. Macchia-rini и соавт. в своей работе применяла очищенные от клеток донорские трансплантаты трахеи, заселенные аутогенными эпителиоцитами, полученными из биопсийного материала, а также хондроцитами, дифференцированными из мультипотентных мезенхимальных стро-мальных клеток (ММСК) реципиента. Доклинические испытания были проведены на мышах и свиньях [3]. In vitro удалось создать короткие жизнеспособные тканеинженерные участки трахеи [6], которые при трансплантации в организм животного не вызывали иммунного отторжения [7]. Вдохновленные этими результатами, ученые приступили к разработке биоинженерных трансплантатов трахеи и бронхов, и в ноябре 2008 г. в журнале The Lancet появилось сообщение о первой успешной трансплантации трахеи пациентке со стенозом главного левого бронха.
Тридцатилетия я женщина поступила в клинику с дис-фонией и сильным кашлем, вызванным туберкулезной инфильтрацией шейного отдела трахеи и главного левого
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009
