CC BY
68
2001
Известия Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра
Том 129
В.Г.Рыбин, Е.В.Зарембо*, Д.В.Куклев, П.Г.Горовой* (ТИНРО-центр; * Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН)
ИДЕНТИФИКАЦИЯ 20-ГИДРОКСИЭКДИЗОНА В ГЕМОЛИМФЕ PARALITHODES CAMTSCHATICA (LITHODIDAE) И СОЦВЕТИЯХ SERRATULA CORONATA VAR. MANSHURICA (ASTERACEAE)
Экдистероиды (полигидроксилированные стероиды) привлекают внимание исследователей благодаря своей высокой биологической активности. На организм человека они оказывают анаболическое, адапто-генное, кардиотропное и иммуномодулирующее действие (Краснов и др., 1976; Якунина, Краснов, 1987; Slama et al., 1996; Тодоров и др., 2000). В последнее время проводятся интенсивные поиски природных источников экдистероидов, к числу которых относится 20-гидроксиэкдизон (20Е) - основной компонент экдистероидсодержащей фракции.
Характерной особенностью экдистероидов, отличающей их от других природных стероидов, является широкое распространение этих соединений в объектах как животного (зооэкдистероиды), так и растительного (фитоэкдистероиды) происхождения. Зооэкдистероиды регулируют физиологические процессы, протекающие при росте, дифференциации и метаморфозе у членистоногих (Arthropoda). Под контролем экдистероидов находятся три стадии развития в жизненном цикле Arthropoda: эмбриональная, постэмбриональная и стадия репродукции (Lafont, Wilson, 1996). Так как действие экдистероидов проявляется в процессах линьки и метаморфоза у Arthropoda, за этими соединениями закрепилось название "экдизоны" (от греч. еxdysis - линька) или гормоны линьки.
Экдистероиды, вырабатываемые у Arthropoda в эндокринных органах в течение всего жизненного цикла, участвуют в регуляции диапау-зы, скорости и ритмов развития (Huberman, 2000). Установлено, что эк-дистероиды играют моделирующую роль в морфогенезе у ракообразных (Crustacea) (Mellon, Greer, 1987), в отсутствии экдистероидов нарушается метаморфоз у личинок креветок (Houlihan, Knowlton, 1994). Помимо линьки и метаморфоза, экдизоны осуществляют гормональную регуляцию других важных физиологических процессов у Arthropoda, участвуют в модулировании процессов роста экзоскелета и циклического роста тканей. Экдистерон непосредственно влияет на скорость биосинтеза белка в мышечной ткани у Crustacea (El Haj, Houlihan, 1987; El Haj, 1996; El Haj, Whiteley, 1997). Экзогенный экдистерон способен стимулировать биосинтез РНК и белка у краба Orconectes virilis (Krishnakumaran, Schneiderman, 1968).
лютное сходство с масс-спектром стандарта 20Е. При просмотре хрома-тографического сигнала по интенсивности ионного тока выбранного иона с m/z 481 мы наблюдали единственный пик (см. рис. 5, б), имеющий время удерживания 3,25 мин - такое же, как и пик стандарта 20Е.
Рис. 4. ВЭЖХ экстракта из соцветий S. coronata var. manshurica Fig. 4. HPLC of extract from inflorescences of S. coronata var. manshurica
Рис. 5. ВЭ Ж X -масс-спект-рометричес-кое исследование экстракта из гемолимфы P. camtschatica (колонка Shim-Pack F L C - ODS, 4,6 x 50 мм, 5 мкм; элю-
ент - ацетонитрил-вода (20: 80); скорость элюирования 0,5 мл/мин; температура колонки 55 °С): а - хроматографический сигнал в режиме регистрации полного ионного тока, б - хроматографический сигнал в режиме регистрации ионного тока выбранного иона (m/z 481), в - масс-спектр из точки 3,25 мин Fig. 5. HPLC-mass-spectrometric investigation of extract from hemolimph of P. camtschatica (Shim-Pack FLC-ODS column, 4,6 х 50 mm, 5 ^m; acetonitryl-water (20: 80); elution rate 0,5 ml/min; column temperature 55 оС); а - chromatographic signal in the registration conditions of total ion current, б - chro-matographic signal in the registration conditions of ion current of selected ion (m/z 481), в - mass-spectrum from point 3,25 min
18
20Е RT = 3,25 мин
Рис. 7. ВЭЖХ-масс-спект-рометрическое исследование экстракта из соцветий S. coronata var. manshurica. Регистрация сигнала по полному ионному току (Shim-Pack FLC-ODS, 4,6 х х 50 мм, 5 мкм; ацетонитрил-вода (20: 80); 0,5 мл/мин; 55 °С)
Fig. 7. HPLC-mass-spectrometric investigation of extract from inflorescences of S. coronata var. manshurica. Conditions: total ion current registration, Shim-Pack FLC-ODS column, 4,6 x 50 mm, 5 pm; acetonitryl-water (20: 80); elution rate 0,5 ml/min; column temp erature 55 0C (a), mass-spectrum from point 3,25 min (6)
Рис. 8. УФ-спектры 20-гидроксиэкдизона из стандартного раствора (1), из экстрактов гемолимфы P. camtschatica (2) и соцветий S. coronata var. manshurica (3)
Fig. 8. UV-spectra of 20-hydroxyecdysone from standard solution (1) and from extracts of P. camts-chatica hemolimph (2) and S. coronata var. manshurica inflorescences (3)
Расчет содержания 20E в исследуемых образцах может быть проведен по формуле, предложенной для количественного определения веществ методом ВЭЖХ с УФ-детекцией (Рыбин, Саяпина, 1999).
Таким образом, методами ВЭЖХ, ИК-спектрометрии, спектроскопии 1Н-ЯМР и хроматомасс-спектрометрии в режиме APCI было установлено наличие 20E в гемолимфе Paralithodes camtschatica. Показана идентичность структуры 20E, выделенного из гемолимфы P. camtschatica и из соцветий Serratula coronata var. manshurica. Установлено, что при использовании в процессе пробоподготовки метода твердофазной экстракции достигается высокая степень извлечения 20E из гемолимфы. Раз-
20
