CC BY
48
УДК 616.132.2-008.6-002:615.224:577.112
характер Фрагментации Фибронектина у больных с острыми
коронарными синдромами в ранние сроки заболевания
О.А. Мараренко, Е.А. Коваль2, А.И. Шевцова 2 1- Коммунальное учреждение «Клиническое объединение скорой медицинской помощи» при Днепропетровском областном совете, Днепропетровск, Украина 2- ГУ «Днепропетровская медицинская академия», Днепропетровск, Украина
Целью работы было исследование степени деградации фибронектина при различных формах острых коронарных синдромов. Методом иммуноблоттинга с использованием специфических антител к фибронектину плазмы крови человека исследовали спектр фрагментов фибронектина у больных с острым коронарным синдромом: без элевации сегмента ST (n=40 ), с элевацией ST в ранние сроки с тромболизисом (n=64 ), с элевацией ST в поздние сроки без тромболизиса(п=31). Установлено, что во всех исследуемых группах появляются новые фрагменты фибронектина 125-140кДа, достоверно увеличивается частота выявления фрагментов 20-38, 100110 и 165-175кДа, снижается частота фрагментов 60-72, 75-80, 90-95кДа. Сделан вывод об активации процессов деградации фибронектина при всех формах острого коронарного синдрома, обоснована его роль в патогенезе заболевания как звена, связывающего механизмы тромбоза и воспаления.
Ключевые слова: острый коронарный синдром, протеолиз, фрагментация фибронектина.
Введение. Высокая частота острых коронарных синдромов и их осложнений определяет актуальность поиска новых прогностических маркеров этих состояний. К числу возможных кандидатов на эту роль можно отнести продукты деградации фибронектина [1].
Фибронектин - полифункциональный гликопротеин плазмы крови, межклеточного матрикса, цереброспинальной, амниотической и синовиальной жидкости [2]. Молекула фибронектина состоит из двух субъединиц молекулярной массой 220 кДа, связанных двумя дисуль-фидными связями в С-терминальном конце [7, 9]. В организме фибронектин может находиться в разных состояниях: нативный - в форме димеров, аггрегированный - в форме комплексов и мультимеров [12], деградированный - в виде фрагментов (ФФН). На сегодняшний день выявлено большое количество ФФН, формирование которых зависит от специфичности и активности разных протеаз [2]. Установлено, что отдельные фрагменты имеют свою биологическую активность, отличающуюся от нативного фибро-нектина, причем некоторые из них могут проявлять аутокаталитическую активность и усиливать деградацию исходного белка [5]. В наших предыдущих исследованиях показано, что атеросклероз и его осложнения сопровождаются изменением спектра фрагментов фибронектина [1, 2], однако характер фрагментации этого белка при разных формах острого коронарного синдрома (ОКС) не исследовался. Между тем, изучение этих показателей может дать ценную информацию для прогноза дальнейшего течения заболевания.
Целью настоящего исследования был сравнительный анализ продуктов деградации фибронектина, циркулирующих в крови на момент госпитализации у пациентов с разными формами ОКС, с учетом особенностей формирования и биологической активности отдельных его фрагментов.
Материалы и методы. Обследовано 135 больных с разными формами острого коронарного синдрома: 1-я группа -больные без элевации сегмента ST с формированием ос-
трого инфаркта миокарда без зубца Q (не^-1М, №ТЕМГ);
2- я группа - больные с элевацией сегмента ST с последующим формированием острого инфаркта миокарда с зубцом Q без реперфузии (тромболизиса) ^ТЕМГ без ТЛТ); 3-я группа - больные с элевацией сегмента ST с последующим формированием острого инфаркта миокарда с зубцом Q ^-ИМ), которым была проведена ре-перфузионная терапия - тромболизис ^ТЕМГ с ТЛТ). В исследуемые группы не были включены пациенты с хроническими заболеваниями, проявлениями почечно-пе-ченочной недостаточности, онкологическими заболеваниями (табл. 1). Средний возраст обследованных пациентов составил 59,8±1,3 лет, из них 69,3% - лица мужского пола. В качестве контрольной обследована группа здоровых доноров (п=14) подобного возраста, поскольку именно возраст является решающим фактором для адекватной оценки процессов протеолиза [6].
Таблица 1 - Общая характеристика групп больных с разными формами острого коронарного синдрома
Признак Группа 1 n = 40 Группа 2 n =31 Группа 3 n = 64
Мужчины,% 47,5 80,6 79,7
Возраст, годы,(М+т) 63,5±1Д 58,2±1,8 57,8±1,3
Время от начала симптомов, часы. 12,3±1,07 7,02±0,63 2,99±0,13
Передний инфаркт миокарда, % 87,5 51,6 54,7
Инфаркт миокарда в анамнезе, % 35,0 9,7 3,1
Артериальная гипертензия в анамнезе, % 87,5 67,7 65,6
Сахарный диабет в анамнезе, % 5,0 6,5 10,9
Killip, класс ОСН при поступлении, % I 87,1 95,0 92,2
II 12,9 5,0 7,8
Стенокардия в анамнезе, % 72,5 16,1 31,3
САД, мм Hg(M±m) 164,7±5,5 153,1±4,6 135,0±2,6
ДАД, мм Hg, (M±m) 95,4±2Д 92,4±2,5 85,7±1,6
ЧСС, уд/мин., (M±m) 82,6±1,6 80,3±3,3 81,7± 1,6
Исследования были проведены в соответствии с этическими нормами, с письменного согласия пациентов.
Все пациенты получали стандартную антитромбоци-тарную терапию (аспирин, клопидогрель), базовую терапию (бета-адреноблокаторы, иАПФ, статины). В зависимости от группы назначали в различных вариациях эноксапарин, фондапаринукс на протяжении 8-ми дней, внутривенно нефракционированный гепарин на протяжении 48-ми часов под контролем АЧТВ; при раннем поступлении, наличии показаний и при отсутствии противопоказаний - тромболизисную терапию. Комплексная клиническая оценка больных проводилась на основании изучения жалоб, анамнеза и физикального обследования.
В контрольной группе и у всех больных в момент поступления в стационар были получены образцы плазмы, в которых исследовался спектр фрагментов фибро-нектина методом иммуноблоттинга с использованием кроличьих антител к этому белку (DACO, Дания). В качестве негативного и позитивного контроля использовали соответствующие стандарты из тест-набора ИФА-ФН фирмы HBO Иммунотех (Россия, Москва).
Статистическая обработка данных выполнена с помощью пакета программ «Videodensitometr Sorbfil Version 1.8.», «Статистика 6.0», «Prophet 5.0». Вероятность расхождений средних величин оценивали с помощью непарного Т-теста, а частот - с помощью критерия ч1 Пирсона, с использованием таблиц частот 2х2.
Результаты и их обсуждение. Установлено, что характер деградации фибронектина достоверно качественно меняется у всех больных с острым коронарным синдромом. Основные закономерности изменения частоты определенных фрагментов фибронектина представлены на рисунках 1-3.
Так, во всех исследуемых группах найдено достоверное повышение фрагментов с молекулярной массой 2028, 100-110 и 165-175 кДа (рис.1). Следует отметить практически одинаковое повышение частоты фрагментов 2038 кДа у больных с разными формами ОКС. Согласно литературным данным, эти фрагменты проявляют хемо-таксическую активность, активируют экспрессию генов матриксных металлопротеиназ ММП-9 и ММП-13, взаимодействуют с фактором Ч111а и замедляют АДФ-инду-цированную агрегацию тромбоцитов [5, 8]. Совокупность этих свойств приводит к активации процессов протеоли-за в соединительной ткани и изменению скорости гемо-коагуляции.
И 1-я группа
Фрагменты фибронектина 100-110 кДа стимулируют продукцию макрофагами важных цитокинов: фактора некроза опухолей-а (ЮТ-а), фактора роста фиброблас-тов-1 (FGF-1), инсулиноподобного фактора роста (ЮР-1), которые способствуют выживанию ишемизированных кардиомиоцитов, предохраняя еще жизнеспособные кар-диомиоциты от действия сигналов, индуцирующих процессы апоптоза [1,13].
В общей популяции при норме 60% частота фрагментов 165-175 кДа в 1-й и 2-й группах составляет 100% (р 0,05), а в 3-й наблюдается некоторое снижение данных фрагментов в острый период с последующим повышением его содержания (р>0,05). Это связано со способностью этих фрагментов связывать гепарин и обеспечивать адгезию типа клетка-субстрат [5].
Иная картина наблюдается при исследовании частоты среднемолекулярных фрагментов фибронектина (рис.2).
□ 1-я группа □ 2-я группа □ 3-я группа Общее количество
60-72кДа
75-80кДа
90-95кДа
20-38кДа
100-110кДа
165-175кДа
Рисунок 1 - Частота(%) фрагментов фибронектина с Мм 20-38 кДа, 100-110 кДа, 165-175 кДа при разных формах острого коронарного синдрома в первые сутки заболевания
Рисунок 2 - Частота (%) фрагментов фибронектина с Мм 60-72 кДа, 75-80 кДа, 90-95 кДа при разных формах острого коронарного синдрома в первые сутки заболевания
Согласно полученным нами данным, во всех группах больных с ОКС зафиксировано достоверное (р < 0,005) снижение частоты выявления фрагментов 60-72, 75-80 и 90-95кДа. По имеющимся в литературе сведениям, фиб-ронектиновые фрагменты 60-72 образуются под действием металлопротеиназ, содержат в своем составе домены с аутокаталитическими свойствами и проявляют хемо-таксическую активность в отношении нейтрофилов и моноцитов [5, 10, 14]. Исходя из этих свойств, трудно объяснить механизм достоверного снижения частоты этих фрагментов на ранних сроках ОКС по сравнению с нормой. В то же время относительное их увеличение на фоне тромболизисной терапии (3-я группа), отражает повышенный уровень протеоли-за и большую степень повреждения миокарда у этих пациентов.
Что касается фрагментов 75-80 кДа, то они полностью отсутствуют в группах 1 и 2, а в группе 3 их частота в 2 раза ниже нормы (р 0,05). Указанные фрагменты фибронектина могут быть продуктами действия катепсина D, эластазы, трипсина, химот-рипсина и термолизина [3,5].
В общей популяции на момент госпитализации наблюдалось резкое , достоверно значимое (р 0,05), снижение частоты фибронектиновых фрагментов 90-95 кДа во всех трех группах. Учитывая, что эти фрагменты имеют прострептокиназную активность [11], можно говорить об истощении нативных меха-
низмов фибринолиза и, вследствие этого, дальнейшего образования тромбов с развитием разных форм острого коронарного синдрома.
Особого внимания заслуживают полученные нами
120 100
80
60
40
20
0
данные о появлении новых фрагментов фибронектина 125-140 кДа во всех исследуемых группах (р>0,05), причем, частота их достигает 100% в 1-й и 2-й группах. Считают, что эти фрагменты образуются под действием мат-риксных металлопротеиназ ММП-1, ММП-2, ММП-3 и ММП-9 [5]. Очевидно, их выявление в крови пациентов с ОКС на ранних стадиях заболевания свидетельствует об общей активации протеолиза в соединительной ткани. Учитывая, что указанные фрагменты фибронектина отсутствуют в крови здоровых доноров, можно предположить, что их появление в крови имеет прогностическое значение при острых коронарных синдромах.
Выводы
1. Развитие всех форм острых коронарных синдомов связано со значительной активацией процессов деградации нативного фибронектина с образованием большого количества его фрагментов, которые имеют дополнительные патогенетично значимые свойства.
2. Во всех группах при госпитализации в сравнении с нормой достоверно растет частота выявления фрагментов фибронектина с молекулярной массой 20-38, 100-110 и 165-175 кДа, основными свойствами которых являются геномная активация продукции матриксных металлопро-теиназ ММП-9 и ММП-13, апоптоза кардиомиоцитов, усиление клеточной адгезии.
3. Во всех группах при госпитализации в сравнении с нормой достоверно снижается частота выявления фрагментов фибронектина 60-72, 75-80 и 90-95кДа, основными свойствами которых являются хемотаксическая активность в отношении моноцитов и гранулоцитов, скрытая металлопротеиназная и стрептокиназная активность.
4. Во всех группах при госпитализации в сравнении с нормой появляются новые фрагменты фибронектина с молекулярной массой 125-140 кДа, основными свойствами которых являются участие в активировании матрикс-ных металлопротеиназ ММП-1, 2, 3, 9.
Заключение
При всех формах ОКС наблюдается высокая степень деградации нативного фибронектина с образованием большого количества фрагментов с разными функциями, отображающих активность тромботическо-го и воспалительного процессов. Фрагментация фибронектина у больных с разными формами острого коронарного синдрома в первый день заболевания может иметь дополнительное прогностическое значение.
Литература
1. Дзяк, Г.В. Тип деградации фибронектина как новый дополнительный фактор риска тромботических и геморрагических осложнений острого инфаркта миокарда с зубцом Q/ Г.В. Дзяк, Е.А. Коваль, А.П. Иванов, А.И. Шевцова // Серце i судини. - Кшв: ТОВ "В1Т-А-ПОЛ", 2007 - №1(17). - 13 с.
2. Кушшч, А.О. Деградащя плазмового фiбронекти-на шд дieю сери нових та цинкових протеаз / А.О. Кушшч, А.1. Шевцова, А.С. Маслак, А.С. Скоромная, О.Е. Грун-тковська // Експериментальна та кл^чна фiзiологiя i бiохiмiя. - Львiв: "Свгт", 2009. - № 4. - 6 с.
3. Курята, О.В. Взаемозалежнють мiж кшшчним пе-реб^ом системно!' склеродерми та станом фiбронекти-ну, ступенем його фрагментаци / О.В. Курята, Т.К. Ли-сунець, А.1. Шевцова, Г.Б. Пелешенко // Украшський ревматолопчний журнал. - Кшв: ТОВ "МОР1ОН", 2006.
- №4(26). - 5 с.
4. Пелешенко, Г.Б. Фiбронектин та його фрагменти при дея-ких патолопчних станах / Г.Б. Пелешенко, Н.В. Лутай, В.В. Пел-шас // Матерiали Всеукрашсько!' науково-практично!' конференци "Бiохiмiя" - Дншропетровськ: Наука i освгта. - 2003. - С. 42.
5. Пелешенко, А. Б. Фрагменты фибронектина в патогенезе, диагностике и лечении заболеваний / А.И. Шевцова, А.З. Браза-лук, Н.В. Лутай // Лабораторная диагностика. - Кшв, 2004. - №2.
- 8 с.
6. Пелешенко, Г.Б. Вiковi особливос^ стану фiбронектину людини при запальних процесах у сполучнш тканиш / Г.Б. Пелешенко, А.1. Шевцова, Н.1. Стекленьова // Буковинський Медичний Вкник. - Чершвщ: Мшктерство охорони здоров'я Украши, Буковинський державний медичний ушверситет, 2005. - Том 9, №2. -3 с.
7. Magnusson, M. Fibronectin: structure, assembly and cardiovascular implications / M. Magnusson, D.F. Mosher // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 1998. - Vol.18. - 8 р.
8. Mosher, D.F. Cross-linking of cold-insoluble globulin by fibrin-stabilizing factor / D.F. Mosher// Biol Chem. - 1975. - 8 р.
9. Pankov, R. Fibronectin at a glance / R. Pankov, K.M. Yamada // J.Cell Science. - 2002. - Vol.15, № 115. - 3 р.
10.Schnepel, J. Recombinant cryptic human fibronectinase cleaves actin and myosin: substrate specificity and possible role in muscular dystrophy / J. Schnepel, J. Unger, H. Tschesche // Biological Chemistry.
- 2001. - Vol.382. - 8 р.
11. Sharma, A. Crystal structure of a heparin- and integrin-binding segment of human fibronectin / A. Sharma, J.A. Askari, M.J. Humphries, E.Y. Jones, D.I. Stuart // EMBO. - 1999. - Vol.18. - 12 р.
1 2 . Sottile, J. Fibronectin polymerization regulates the composition and stability of extracellular matrix fibrils and cell-matrix adhesions / J. Sottile, D.C. Hocking // Molecular Biology of the Cell.
- 2002. - Vol.13. - 14 р.
1 3 . Trial, J. Inflammation and ischemia: macrophages activated by fibronectin fragments enchance the survival of injured cardial myocytes / J. Trial// Exp.Biol.Med. - 2004. - 22. - 8 р.
□ 1-я группа □ 2-я группа □ 3-я группа ПОбщее количество
Рисунок 3 - Частота появления фрагментов фибронектина с Мм 125-140 кДа при разных формах острого коронарного синдрома в первые сутки заболевания
14. Vidmar, S.L. Collagen-binding domain of human plasma Lottshpreich, I. Emod, J.M. Imhoff, V. Keil-Dlouha // European fibronectin contains a latent type IV collagenase / S.L. Vidmar, F. Journal of Biochemistry. - 1991. - Vol.201. - 6 p.
character of fibronectin fragmentation in acute coronary syndromes in early stages of the disease
O.A. Mararenko1, E.A. KovaP, A.I. Shevtsova2 1 - Municipal Institution "Dni propetrovsk Clinical Entity of Emergency Medicine of Dni propetrovsk Regional Council", Dni propetrovsk , Ukraine 2 - "Dni propetrovsk Medical Academy", Dni propetrovsk, Ukraine
The aim of the study was to investigate the degree of fibronectin degradation in various forms of acute coronary syndromes. The spectrum of fibronectin fragments was studied by immunoblotting technique, using specific antibodies to fibronectin of human blood plasma in patients with acute coronary syndrome: without ST elevation (n=40); with ST elevation and thrombolysis in the late stages of the disease (n=64); with ST elevation without thrombolysis (n=31). It has been estimated that the new fibronectin fragments 125-140 KDa appear in acute coronary syndromes.
The increase in frequency of fibronectin fragments 20-38, 100-110 and 165-175xDa in all groups under review has been established and the decrease in 60-72, 75-80 and 90-95xDa fibronectin fragments has been marked as well. The conclusion was made about the activation offibronectin degradation in all forms of acute coronary syndromes. The role offidronectin fragments in pathogenesis of the disease, as an important link between the mechanisms of thrombosis and inflammation, has been confirmed.
Key words: acute coronary syndrome, proteolysis, fibronectin fragmentation.
Адрес для корреспонденции: e-mail: mdv_70@mail.ru Поступила 22.01.2013
