CC BY
44
Раздел - молекулярная медицина Генетические особенности рака молочной железы в группах прогрессирования после радикальных мастэктомий и органосохраняющего лечения
Троценко И.Д., Пасько М.А., Захаренко М.В., Кудинова Е.А, Чхиквадзе В.Д., Боженко В.К.
ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, г. Москва
Контактная информация:
Рабочий адрес: 117997, Москва, ГСП-7, ул.Профсоюзная, д.86, ФГБУ «РНЦРР» МЗ РФ
• Троценко Иван Дмитриевич - к.м.н., н.с. лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточной терапии в онкологии ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России trotsenkoivan@mail.ru
• Пасько Максим Андреевич- очный аспирант ФБГУ "РНЦРР", 8(925)366-39-08, phantom1908@mail.ru •Захаренко М.В.-м.н.с. лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточной терапии в онкологии ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России
•Кудинова Елена Александровна- к.м.н., зав. к.д.л. ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России 8(499)120-11-14 eakudinova@rambler. ru
-Чхиквадзе Владимир Давидович-д.м.н.,проф.руководитель хирургической клиники ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России. vdc@mail.ru
• Боженко Владимир Константинович - д.м.н., проф., руководитель отдела молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей ФГБУ РНЦРР Минздрава России. Vbojenko@mail.ru
Цель: Ретроспективно оценить морфологические и генетические особенности рака молочной железы в группах с прогрессированием при различных видах хирургического лечения.
Материалы и методы: Исследовано 458 образцов опухолевой ткани, из них 144 образца пациенток с локорегиональными и отдаленными рецидивами. Проведен анализ экспрессии 21 гена методом ПЦР в реальном времени.
Результаты: Обнаружены достоверные отличия молекулярных профилей экспрессии генов при сравнении групп рецидивирования при мастэктомии и радикальной резекции молочной железы. Для радикальных мастэктомий прогностически значимыми является экспрессия генов: Ki67, MYC,P16INK4a,PTEN, а для групп радикальных резекций - P16INK4a и BCL2.
Заключение: Исследование генетического профиля опухолей позволяет выявить новые, эффективные маркеры неблагоприятного прогноза.
Ключевые слова: рак молочной железы, органосохраняющее лечение, радикальная мастэктомия, факторы прогноза, профиль экспрессии генов.
Genetic features of breast cancer in groups progression disease after radical mastectomy and breast-
conserving therapy.
Trotsenko I.D., Pas'ko M.A., Zakharenko M.V., Kudinova E.A., Bojenko V.K.
Contact information:
Address: 117997, Moscow, Profsoyuznaya str., 86, "RNCRR"
Bojenko V.K. - prof. Federal State Budget Establishment "Russian Scientific Center of Roentgen Radiology" (RNCRR) Russian Ministry of Health.
Trotsenko I.D. - PhD. Federal State Budget Establishment "Russian Scientific Center of Roentgen Radiology" (RNCRR) Russian Ministry of Health.
Pas'ko M.A. - postgraduate student Federal State Budget Establishment "Russian Scientific Center of Roentgen Radiology" (RNCRR) Russian Ministry of Health.
Zakharenko M.V. - Jr. researcher of Federal State Budget Establishment "Russian Scientific Center of Roentgen Radiology" (RNCRR) Russian Ministry of Health.
Kudinova E.A. - PhD. Federal State Budget Establishment "Russian Scientific Center of Roentgen Radiology" (RNCRR) Russian Ministry of Health.
Purpose: To value morphologic and genetic features of breast cancer in recurrence group after different surgical treatment.
Materials and methods: We investigated 458 tumor tissue specimens, 144 of them with locoregional and distant recurrences. 21 genes were analyzed with RT-PCR.
Results: We have received differences in expression profile in relapse gropes with mastectomy and economy resection. There was revealed significant gene expression P16INK4A, MYC, Ki-67 and PTENfor masctectomy grope and P16INK4a and BCL2 for breast-conserving therapy.
Conclusion: research of gene expression for different tumor specimen allows to select markers adverse prognosis.
Keywords: breast cancer, breast-conserving therapy, radical mastectomy, prediction factors, gene expression profiles.
Введение
Рак молочной железы (РМЖ) стойко удерживает первенство в структуре онкологических заболеваний среди женщин. По данным международного агентства по изучению рака GLOBOCAN за 2012 г. в мире было выявлено 1,67 млн. новых случаев заболевания, что составило 25,1% от всей вновь выявленной онкопатологии среди женщин, при этом смертность достигла 522 тыс. человек. (Torre et al., 2015) Широкое распространение и высокая смертность, несмотря на постоянное совершенствование методов скрининга, диагностики и лечения оставляют актуальными дальнейшее изучение этиологии, патогенеза, новых способов терапии и прогноза рецидивирования РМЖ. Одним из перспективных направлений для разработки новых факторов прогноза является изучение генетического профиля опухоли. Уже разработаны и внедрены в клиническую практику ряд методов прогноза рецидива, основанные на исследовании профилей экспрессии генов в ткани опухоли, такие как Oncotype Dx и Mammaprint. В научных целях используется более десяти аналогов (Theros H/I, Theros MGI, MapQuant Dx, Rotterdam Signature, IHC4 Assay и др.) (Sotiriou, Pusztai, 2009; Colombo et al., 2011; Gyorffy et al., 2015). Эти модели применимы для различных групп пациентов, отличающихся как стадией, так и другими морфо-функциональными характеристиками, а также видом применяемого лечения. Предложенные методы прогноза не учитывают объем хирургическго лечения, поэтому в своем исследовании мы попытались связать не только основные морфологические характеристики опухоли - размер и поражение регионарных лимфоузлов с ее генетическим профилем, на основе исследования экспрессии 21 гена, но и исследовать возможные отличия факторов прогноза, связанные с объемом хирургического лечения.
Материалы и методы
В исследовании были изучены данные историй болезни и образцы опухолевой
ткани у 458 пациенток, перенесших комплексное лечение по поводу рака молочной железы в ФБГУ "РНЦРР" Минздрава России за период с 2001 по 2010 гг. Среди них 319 образцов было получено после мастэктомий в различных модификациях и 139 образцов -после радикальных резекций молочной железы. При 5-летнем наблюдении отмечено прогрессирование в виде локальных и отдаленных рецидивов у 144 пациенток.
Выполнена оценка 21-генного профиля образцов опухолей. Изучена экспрессия следующих генов - Ki-67, STK-15, CCNB1, CCND1, MYC, MYBL2, P16INK4A, PTEN, BIRC5, BCL2, BAG1, TERT, NDRG1, ESR1, PGR, HER2, GRB7, MGB1, MMP11, CTSL2, CD68. Выделение РНК из материала опухолевой ткани производилось согласно инструкции с помощью наборов реагентов для выделения РНК RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, USA). Реакция обратной транскрипции проводилась с использованием набора НПО «ДНК Технология» согласно инструкции. Статическая обработка произведена при помощи программы StatSoft Statistica 6.0. Отличие средних оценивалось на основании критерия Стьюдента и дисперсионного анализа.
Результаты
Данные исследуемых пациентов были распределены на группы в зависимости от размеров первичной опухоли и количества пораженных лимфатических узлов. Как видно из представленных ниже таблиц, преобладали опухоли с размерами до 2 см (Т1) и от 2 до 5 см (Т2). В процентном соотношении они составили абсолютное большинство - 48,9% и 48,0% соответственно от общего количества исследуемых пациентов. Поражение регионарных лимфатических узлов наблюдалось в 37 % случаев. При Т1 метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов наблюдалось в 14,4%, при Т2 - в 17,6% случаев. Была проведена оценка количества пораженных лимфатических узлов внутри групп пациентов с Т1 и Т2 в зависимости от их количества (N). При Т1 метастазы в 1-3 л/у встречались в 9,1%; в 4-9 л/у в 5,2%; более 10 л/у в 0,4%. При Т2 имело место похожее распределение - N1 в 11,5%; N2 в 6%; при N3 в 0,2%.
Таблица 1. Распределение пациентов в зависимости от морфологических характеристик опухоли и вида хирургического лечения
Кол-во пациентов Вид лечения T 1 T 2 T 3 T 4 N0 N1 N2 N3
Радикальная Мастэктомия 132 174 6 7 188 81 43 7
Радикальная резекция 92 46 1 0 100 25 14 0
Общее Количество пациентов 224 220 7 7 288 106 57 7
Таблица 2. Распределение пациентов (опухоль менее 5 см) в зависимости от поражения
регионарных л/у
N0 N1 N2 N3
T1 резекция 65 16 11 0
T2 резекция 34 9 3 0
T1 мастэктомия 91 26 13 2
T2 мастэктомия 104 44 25 1
Мы проследили отдаленные результаты за 5 лет и получили следующие данные. Количество пациентов с прогрессированием составило 144, что соответствует 31% от общей выборки. При Т1 после выполнения радикальных резекций, группа пациентов с прогрессированием составила 3%. При Т2 для аналогичного вида лечения эта цифра возросла до 6%. Для Т1 и Т2 после радикальной мастэктомии процент пациентов с прогрессированием составил 6% и 14%. Полученные цифры отражают количественное соотношение пациентов в нашей выборке. Однако, в то же время, полученные данные соотносятся с данными общемировой литературы об увеличении количества рецидивов при увеличении размеров первичной опухоли (Narod, 2012).
При сравнении генетического профиля в группах пациентов после радикальных мастэктомий с наступившим рецидивом и без рецидива за исследованный период были
получены следующие статистически значимые отличия: более высокий уровень экспрессии генов Ш-67 (Р= 0,008) и P16INK4A (Р= 0,014) и более низкий уровень для PTEN (Р= 0,001) и MYC (Р= 0,017).
Таблица 3. Статистически значимые изменения экспрессии генов для группы радикальных
мастэктомий
Гены Среднее значение экспрессии при прогрессировании Среднее значение экспрессии без прогрессирования Р
Ю-67 339,5 249,6 0,00874
MYC 19,1 28,5 0,01794
P16INK4A 97,2 63,7 0,01453
PTEN 35,4 49,1 0,00146
В то же время при изучении группы пациентов после радикальных резекций получены данные, свидетельствующие об увеличении активности гена P16INK4A (Р=0,0467) и об уменьшении уровня экспрессии гена BCL2 (Р=0.0177).
Таблица 4. Статистически значимые изменения экспрессии генов для группы радикальных
резекций
Среднее значение экспрессии при прогрессировании Среднее значение экспрессии без прогрессирования Р
P16INK4A 68,2 20,5 0,0467
BCL2 14,8 48,2 0,0177
При изучении уровня экспрессии генов в зависимости от размеров первичной опухоли, не выявлено статистически значимых различий для опухолей до 2 см как для пациентов после радикальных мастэктомий, так и радикальных резекций.
Однако при больших размерах опухоли появляются разнонаправленные изменения в уровне экспрессии. Так, в группе радикальных мастэктомий при прогрессировании уменьшается экспрессия генов MYC и PTEN (Р= 0,035 и 0,018), а в группе радикальных резекций происходит увеличение уровня экспрессии генов Ш-67 (Р=0,024), P16INK4A (Р=0,016), NDRG1 (Р=0,047) и MMP11 (Р=0,035).
Интересным представляется сравнение изменения экспрессии исследуемых генов в группах с различным поражением регионарных лимфатических узлов. В группе
радикальных резекций в случаях прогрессирования заболевания при отсутствии пораженных лимфатических узлов, отмечается тенденция к увеличению экспрессии генов MYBL2 (Р=0,029) и P16INK4A (Р=0,049). Однако при выявлении регионарных метастазов, статистически значимой оказывается тенденция к уменьшению экспрессии гена BCL2 (Р=0,043). Противоположная картина наблюдается при рассмотрении группы радикальных мастэктомий. В отсутствие поражения регионарных лимфатических узлов при прогрессировании наблюдается статистически значимое повышение экспрессии Ш-67 (Р=0,014) и тенденция к увеличению экспрессии P16INK4A (Р=0,046), также отмечается снижение экспрессии гена MYC (Р=0,03). При выявлении метастазов в регионарные лимфоузлы регистрируется увеличение экспрессии генов STK-15 (Р=0,021), ^Ш^О^) и NDRG1 (Р=0,041).
Обсуждение
В исследовании выявлена различная активность генов в зависимости от стадии заболевания и вида хирургического вмешательства при сравнении групп без прогрессирования и с прогрессированием.
Во всех случаях для группы с прогрессированием в нашем исследовании отмечено статистически достоверное повышение уровня экспрессии гена P16INK4A. Данный ген контролирует деление клетки за счет блокирования сигнала к переходу из 01 в Б фазу клеточного цикла. Р16 - ген супрессор, подавляющий активность комплексов СБК4, СБК6, циклина Б, ответственных за фосфорилирование белка ретинобластомы. Фосфорилированние белка рЯЬ приводит к активации транскрипционного фактора Б2Б, активирующего большой комплекс генов, ответственных за репликацию ДНК и активацию Б-фазы деления. Нарушения регуляции р16ШК4а, такие как мутации и метилирование промотора, встречаются при раке легкого, мочевого пузыря, толстой кишки, молочной железы и др. Отсутствие или снижение уровня экспрессии приводит к
стойкому фосфорилированию белка ретинобластомы и неконтролируемому делению, что характерно для большинства опухолевых клеток. Сверхэкспрессия гена, в свою очередь, может быть объяснена мутацией, метилированием и утратой нативной структуры и функции (О^аш е! а1., 2004; Ба2агоу е! а1., 2011; СЬае й а1., 2011; Ы е! а1., 2011).
Статистически значимой величиной при прогрессировании заболевания после радикальных резекций оказалось снижение экспрессии анти-апоптатического гена В^-2. В исследовании (Nadler е! а1., 2007) высокая экспрессия данного гена расценивается как положительный фактор прогноза при увеличении безрецидивной выживаемости больных РМЖ. Описаны корреляции высокой экспрессии В^-2 с наличием в опухоли рецепторов эстрогена и прогестерона, являющимися факторами благоприятного прогноза. В нашем исследовании наблюдается заметное снижение уровня экспрессии данного гена при возникновении рецидива. Это соотносится с данными отечественной и мировой литературы. (Троценко, 2012; Уи е! а1., 2010; ЯаЬа е! а1., 2015).
Низкий уровень экспрессии гена PTEN и высокая активность К1-67 в группе прогрессирования у пациенток после радикальной мастэктомии указывает на то, что для этой группы характерен повышенный уровень пролиферации. Снижение активности PTEN приводит к уменьшению пула клеток, переходящих в состояние апоптоза, а активация К1-67 отражает высокую митатическую активность опухоли. Доказано, что при увеличении уровня К1-67 увеличиваются не только размеры опухоли, но и степень ее злокачественности, увеличивается частота поражения регионарных лимфоузлов, возрастает уровень лимфоваскулярной инвазии, при этом в процентном соотношении уменьшается количество гормонозависимых опухолей (Должиков и др., 2009; Апанович и др., 2011; Ьирош е! а1., 2012; 1™аЫ е! а1., 2013).
Тенденции в изменении экспрессии генов, выявленные при поражении регионарных лимфатических узлов, 8ТК-15, MYC, СС^1 и NDRG1 нуждаются в дополнительном изучении.
Заключение
Обнаруженные нами отличия в экспрессионных профилях в группах прогрессирования при использовании различных объемов хирургического лечения в рамках комплексной терапии РМЖ позволяют высказаться о наличии различных прогностических факторов для этих групп пациентов. Обнаруженные отличия могут быть использованы для построения уточненных моделей прогноза, т.к. полученные результаты однозначно указывают на зависимость этих моделей от объема хирургического лечения.
Список литературы
1. Апанович Н.В., Шубин В.П., Коротаева А.А. и др. Современные молекулярно-генетические маркеры рака молочной железы. Опухоли женской репродуктивной системы. 2011. № 1. С. 19-28.
2. Должиков А.А., Иванов А.В., Должикова И.Н. Взаимосвязи биологических маркеров рака молочной железы. II Российский симпозиум «Молекулярно-генетическая диагностика опухолей человека». М. 2009. С. 12 - 13.
3. Ижанов М.Т., Сарсембаев А.А., Игликов М.К., Имаганбетова Н.Б. Современные
подходы в лечении ранних, местнораспространенных и диссеминированных форм рака молочной железы. Тюменский медицинский журнал 2010. № 2, . С.76.
4. Пак Д.Д., Ермаков А.В. Лечение больных с ранними формами рака молочной железы. Материалы региональной научно-практической конференции НИИ онкологии ТНЦСО РАМН. 2002 г. С. 74.
5. Троценко И.Д. Анализ экспрессии генов при пролиферативных заболеваниях молочной железы. Автореф. дис. канд. мед. наук 14.01.12 / Москва. 2012. 22 с.
6. Bazarov A.V., Sluis M., Hines C., et al. P16INK4a mediated suppression of telomerase in normal and malignant breast cancer cells. Aging Cell. 2010. V. 9. No. 5. P. 736-746.
7. Chae S.W., Sohn J.H., Kim D.H., et al. Overexpressions of cyclin B1, cdc2, p16 and p53 in human breast cancer: the clinicopathologic correlations and prognostic implications. Yonsei Medical Iournal. 2011. V. 52. No. 3. P. 445-453.
8. Colombo P.E., Milanezi1 F., Weigelt B., et al. Microarrays in the 2010s: the contribution of microarray-based gene expression profiling to breast cancer classification, prognostication and prediction. Breast Cancer Research. 2011. V. 13. No. 3. P. 212.
9. Gyorffy B., Hatzis C., Sanft N., et al. Multigene prognostic tests in breast cancer: past, present, future. Breast Cancer Res. 2015. V.17. P. 11.
10. Inwald E. C., Klinkhammer-Schalke M., Hofstadter F. Ki-67 is a prognostic parameter in
breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry. Breast Cancer Research and Treatment. 2013. V.139. P.539-552.
11. Li J., Poi M.J., Tsai M.D. The regulatory mechanisms of tumor suppressor P16INK4A and relevance to cancer. Biochemistry. 2011. V. 50. No. 25. P. 5566-5582.
12. Luporsi E., Andre F., Spyratos F., et al. Ki-67: level of evidence and methodological considerations for its role in the clinical management of breast cancer: analytical and critical review. Breast Cancer Research and Treatment. 2012. V. 132. P.895-915.
13. Nadler Y., Camp R.L., Giltnane J.M., et al. Expression patterns and prognostic value of Bag-1 and Bcl-2 in breast cancer. Breast Cancer Research. 2008. V. 10 No. 2. R. 35.
14. Narod S.A. Tumour size predicts long-term survival among women with lymph node-positive breast cancer. Current Oncology. 2012. V. 19. No. 5. P. 249-253.
15. Ohtani N., Yamakoshi K., Takahashi A., Hara E. The regulatory mechanisms of tumor suppressor P16INK4A and relevance to cancer. The Journal of Medical Investigations. 2004. V. 51. No. 3-4. P. 146-153.
16. Raha P., Thomas S., Thurn K. T., et al. Combined histone deacetylase inhibition and tamoxifen induces apoptosis in tamoxifen-resistant breast cancer models, by reversing Bcl-2 overexpression. Breast Cancer Research. 2015. V. 17. P. 26.
17. Sotiriou C., Pusztai L. Gene-Expression Signatures in Breast Cancer. The New England Journal of Medicine. 2009. V 360. P. 790-800.
18. Torre L. A., Bray F., Siegel R. L., et al. Global Cancer Statistics, 2012. CA: Cancer Journal for Clinicians. 2015. V.65 P. 87-108.
19. Yu B., Sun X., Shen H.Y., et al. Expression of the apoptosis-related genes BCL-2 and BAD in human breast carcinoma and their associated relationship with chemosensitivity. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 2010. V. 29. P. 107.
