CC BY
828
ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ В ДИАГНОСТИКЕ АНАЭРОБОВ
А.Ю. Миронов
Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова
В статье описываются возможности применения газовой хроматографии и масс-спектрометрии при работе с облигатными анаэробами. Приводятся данные по индикации анаэробов в аналите на основе определения молекулярных маркёров, хемотаксономии и классификации анаэробов, видовой идентификации анаэробов, изучения патогенетических механизмов взаимодействия микроба и организма на молекулярном уровне и ускоренного определения чувствительности анаэробов к химиотерапевтическим препаратам.
Ключевые слова: анаэробы, газовая хроматография, масс-спектрометрия.
GAS CHROMATOGRAPHY AND MASS-SPECTROMETRY IN DIAGNOSIS OF ANAEROBES
A.Yu. Mironov
I.M. Sechenov the first Moscow state Medical university
The article presents opportunities of gas chromatography and mass spectrometry application in studying obligatory anaerobes. The data concern anaerobe indication in pathological material based on determination of molecular markers, chemotaxonomy and anaerobe classification, specific anaerobe identification, studying the molecular level of pathogenetic mechanisms of interrelations between microbe and the organism, and rapid determination of anaerobe sensitivity to chemotherapeutic drugs.
Key words: anaerobes, gas chromatography, mass-spectrometry.
Бактериологическое исследование на анаэробы длительно, трудоёмко и дорого [1, 2, 3]. Время, затрачиваемое с момента доставки аналита в микробиологическую лабораторию до получения полного развернутого ответа, составляет от 7 до 10 суток, что абсолютно не удовлетворяет требования клиницистов. Особенно остро эта проблема стоит в тех клиниках, где средняя продолжительность пребывания в стационаре больных с острыми гнойно-воспалительными заболеваниями (ГВЗ) составляет от 7 до 14 суток. Эффективное лечение ГВЗ требует быстрой индикации патогена и его идентификации как аэроба или анаэроба; эти данные необходимы для выбора адекватной антибактериальной терапии и решения вопроса о способе и объёме хирургического вмешательства. Ответ из бактериологической лаборатории обычно приходит к моменту выписки больного или же после его выписки, когда потребность в нём уже отпадает. Для клинициста гораздо важнее иметь ориентировочный ответ о наличии или отсутствии анаэробов в аналите в день поступления больного в стационар, чем полный развернутый ответ на 7-10-е сутки.
К числу экспресс-методов микробиологической диагностики неклостридиальной анаэробной инфекции следует отнести физико-химические методы анализа химического состава микробной клетки и продуктов её метаболизма. Таким методом является метод газовой хроматографии (ГХ) и масс-спектрометрия (МС). Использование ГХ с целью экспресс-диагностики анаэробной инфекции основано на индикации в аналите от больных ГВЗ специфических продуктов метаболизма анаэробных бактерий - летучих жирных кислот (ЛЖК), которые служат молекулярными маркёрами наличия анаэробов в аналите.
Бактериологические лаборатории, занимающиеся изучением анаэробов, используют ГХ и МС [7, 8, 12] в следующих направлениях.
1. Индикация анаэробов в аналите на основе определения молекулярных маркёров.
2. Хемотаксономия и классификация анаэробов.
3. Видовая идентификация анаэробов.
4. Изучение молекулярных патогенеических механизмов взаимодействия микроба и организма.
5. Ускоренное определение чувствительности анаэробов к химиотерапевтическим препаратам.
Наибольшее распространение ГХ получила при экспресс-диагностике анаэробной инфекции. Высокоспецифичными конечными продуктами метаболизма углеводов у анаэробов являются жирные кислоты -короткоцепочечные или ЛЖК С2-С7 и длинноцепочеч-ные - нелетучие кислоты. Индикация в аналите (гной, кровь, ликвор, моча и т. д.) наличия жирных кислот с помощью ГХ является убедительным доказательством анаэробной этиологии ГВЗ. Методом ГХ технически более просто определять ЛЖК. Молекулярными маркёрами анаэробов являются изомасляная и масляная, изовалериановая и валериановая, изокапроновая и капроновая, гексановая и каприловая кислоты [11, 12, 13, 15].
Методика подготовки пробы к ГХ-анализу и её последующий анализ просты, хорошо воспроизводимы и занимают 30-50 минут от момента доставки аналита до получения ответа. При подготовке пробы к ГХ-анализу широкое распространение в лабораториях получила методика жидкостной или газовой (паро-фазный анализ) экстракции ЛЖК из аналита [13]. Га -зовая и жидкостная экстракция ЛЖК различаются на хроматограмме лишь соотношением высот пиков. Набор кислот в продуктах метаболизма у одной культуры анаэробов остается практически идентичным. Методы жидкостной и газовой экстракции одинаково приемлемы в лабораторной практике, но парофазный анализ (ПФА) используется исключительно для экспресс-диагностики.
Исследование проводят на газовых хроматографах с использованием хроматографических стеклянных набивных колонок длиной 2 м, диаметром 3 мм, заполненных 15% раствором полидиэтиленсукцината (СИетаро!), нанесённого на хромосорб WAW-G-MDS (Бире1со). Определение проводится в изотермическом режиме при температуре 190 °С. Детектор - пламенно-ионизационный, газ-носитель - азот. Чувствительность метода - 10-6 г/л. Время проведения анализа - 40-50 минут. Идентификацию ЛЖК осуществляют по относительному времени удерживания, для сравнения используют аналитические стандарты жирных кислот (А!КесИ АТ-1000). Для получения более подробной информации о метаболической активности присутствующих в исследуемом материале микробов определяют длинноцепочечные жирные кислоты, которые переводят в летучие производные, например, метиловые эфиры, многоатомные спирты, ароматические соединения, углеводные соединения, аминосахара, аминокислоты, пурины и т. п. Наличие в исследуемом материале длинноцепочечных жирных кислот также является убедительным доказательством анаэробной этиологии ГВЗ. Анализ метиловых эфиров жирных кислот необходим, если в пробе отсутствуют ЛЖК или определяется только уксусная кислота. Индикация в аналите только уксусной или пропионовой кислот не мо-
жет являться достоверным доказательством наличия анаэробов в данной пробе, так как эти кислоты могут продуцироваться некоторыми факультативными анаэробами: Staphylococcus aureus, Esherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella. Обнаружение в аналите только молочной или яблочной жирных кислот также не может служить веским доказательством наличия анаэробов, так как эти кислоты являются нормальными метаболитами тканей человека.
Важное значение при индикации анаэробов в аналите приобретают ложноположительные и лож-ноотрицательные результаты ГХ-анализа. Под ложно-положительными понимают такие результаты, когда на хроматограмме присутствуют пики жирных кислот, а бактериологически анаэробы не выделяются. Возможные причины ложноположительных результатов объясняются, во-первых, несовершенством бактериологических методик(забора, транспортировки, культивирования и т. п.) при исследовании на анаэробы (молекулярные маркёры присутствуют в аналите дольше, чем сами бактерии); во-вторых, массивной предшествующей антибиотикотерапией, не позволяющей выделять анаэробы из аналита; в-третьих, наличием в некоторых пробах очень большого количества монокультуры Staphylococcus aureus. Культивирование на бульоне in vitro S. aureus освобождает уксусную и в очень низкой концентрации изо-валериановую кислоту. Возможно, что аналогичный процесс может наблюдаться и in vivo. Staphylococcus spp. не продуцирует изовалериановой кислоты при ферментации. Предполагают, что изовалериановая кислота высвобождается стафилококками при переваривании мясного бульона и, возможно, аналогичный процесс в небольшом числе случаев имеется in vivo. Пропионовая кислота высвобождается in vivo и in vitro Е. coli, хотя этот микроб не продуцирует её при ферментации углеводов, аминокислот, пуринов. Механизм её образования в бульоне неизвестен и может быть обусловлен высвобождением из компонентов среды при приготовлении. Имеются клинические наблюдения, подтверждённые опытами in vitro, о способности S. aureus при культивировании в жидкой питательной среде (PYG-бульон) с добавлением женского молока или непосредственно в женском молоке образовывать пропионовую и масляную кислоты в низких концентрациях. При массовых анализах аналит с высоким содержанием ЛЖК чередуется с образцами, в которых ЛЖК практически отсутствуют. В таких пробах концентрация ЛЖК может колебаться на три-четыре порядка, что нередко приводит к проявлению «памяти» пневматического дозатора, соединительных трубок, хроматографических колонок и возможности получения ложноположительного результата. Во избежание этого явления после анализа пробы с высоким содержанием ЛЖК необходимо
очистить дозатор и газоподводящие трубки от сорбированных на стенках остаточных количеств летучих примесей. Достаточная степень очистки обеспечивается продувкой в течение 10-30 минут пневматического дозатора газом-носителем. Для промывки хроматографической колонки в неё вводят эфир или другой органический растворитель. Наряду с ложно-положительными результатами ГХ-анализа бывают и ложноотрицательные, под которыми понимают такие результаты, когда на хроматограмме отсутствуют пики жирных кислот, хотя анаэробы присутствуют в аналите и могут быть выделены бактериологически. Возможные причины ложноотрицательных результатов объясняются, во-первых, низкой чувствительностью катарометра (при работе на хроматографе, оснащенном детектором по теплопроводности); во-вторых, редко встречающимися в клинике случаями анаэробной инфекции, вызванной анаэробами, не продуцирующими ЛЖК (Bacteroides corrodens, Peptoccocus magnus, Peptostreptococcus intermedius); в-третьих, - очень сильным разведением аналита (перитонеальный диализат, промывные воды и т. п.); в-четвертых, - очень низким уровнем продукции ЛЖК при моноинфекциях, вызванных Bacteroides fragilis и некоторыми другими видами анаэробов; в-пятых, при смешанной аэробно-анаэробной инфекции, когда некоторые виды аэробов входящих в состав ассоциаций (например, Pseudomonas aeruginosa), могут метаболизировать ЛЖК, продуцируемые анаэробами [11, 12].
Хемотаксономия - учение о химических живых организмах и об использовании химических критериев в их классификации и идентификации. Оно основано на химических свойствах микробов - распределении аминокислот, сахаров, липидов, белков и других веществ в целой бактериальной клетке, в части клетки или на продуктах ферментации и ферментах бактериальной клетки. Хемотаксономия позволяет автоматизировать методы идентификации микробов, даёт лучшую классификацию бактерий, определяя степень корреляции между ними. Хемо-таксономия использует физико-химические методы анализа живых организмов, хроматографию, масс-спектрометрию, электрофорез, а также классические методики таксономии - ферментацию, серологию, фаготипирование. Наиболее часто используется анализ жирных кислот с помощью ГХ и исследование белков клеточной стенки с помощью электрофореза. Хроматографические профили конечных продуктов метаболизма анаэробов включены в Bergey's manual. Деление семейств на роды в ряде случаев основываются, прежде всего, на конечных продуктах метаболизма. Внутри семейства Bacteroidaceae бактерии, продуцирующие масляную кислоту без изомасляной или изовалериановой кислот, классифицируют как
члены рода Fusobacterium, а не продуцирующие масляную кислоту вообще или продуцирующие её вместе с изомасляной и изовалериановой кислотами помещаются в род Bacteroides. ГХ-исследования конечных продуктов метаболизма используют для разделения группы В. oralis от группы В. fragilis, так как только бактероиды группы В. fragilis продуцируют пропионовую кислоту. В 1980 г. А.Ь Coykendall на основании способности оральных штаммов В. asaccharolyticus продуцировать фенилуксусную кислоту, которую в отличие от неоральных изолятов можно определить с помощью ГХ, предложил выделить оральные штаммы В. asaccharolyticus в новый вид Prevotella gingivalis, поскольку различия метаболизма между оральными и неоральными штаммами коррелировали и с их генетическими различиями.
Идентификация анаэробов в аналите методом ГХ в настоящее время невозможна. С применением ГХ можно до вида идентифицировать анаэробы, выделенные в чистой культуре. Для этого наиболее приемлемо сочетание ГХ-МС и компьютерного анализа, позволяющее проводить многокомпонентный анализ всех продуктов метаболизма бактериальной клетки и её фрагментов. ГХ не позволяет абсолютно идентифицировать разделяемые соединения в исследуемых образцах. Если требуется абсолютно точная идентификация соединений, разделенных методами ГХ, применяют спектрометрические методы, включающие МС. Для этого используется непрерывная система -газовый хроматограф и масс-спектрометр, - которая позволяет просканировать и записать одновременно с хроматограммами и масс-спектры разделенных соединений. Дополнение времён удерживания соединений их масс-спектрами (т. е. молекулярными весами) позволяет безошибочно идентифицировать все соединения, входящие в состав сложных биоорганических смесей и определять весь набор конечных продуктов метаболизма анаэробов: ЛЖК, жирные длинноцепо-чечные кислоты, токсические метаболиты, углеводные компоненты и т. д.
ГХ-МС-исследования проводятся на системах с масс-селективным детектором и специальной химической станцией для идентификации выявленных соединений. Идентификацию соединений и обработку данных проводят на ЭВМ ГХ-МС системы типа НР-1000. Для идентификации соединений используют спектральные библиотеки Nist и Wiley.
Липиды, углеводы и аминокислоты химически модифицируют с помощью BSTFA (бисилилтрифтора-цетат) в триметилсилильные соединения. Углеводы переводят в триметилсилильные (ТМС) производные сахаров. Преимущество использования ТМС-эфиров в качестве летучих производных для ГХ углеводов перед другими методами заключается в возможности превращения в эти производные сахаров всех классов,
включая аминодезокси- и ацетамидодезоксисахара, уреновые кислоты, альдонолактоны, альдеровые кислоты и сложные метиловые эфиры метилгликозидов и 1М-ацильные производные нейраминовой кислоты.
Метод, включающий метанолиз и последующее ТМС-лирование, представляет интерес для анализа гликопротеидов, гликозаминогликанов и полисахаридов клеточных стенок бактерий, так как все моно-сахаридные компоненты этих полимеров могут быть определены одновременно в форме триметилсили-рованных производных метилгликозидов. Для таких разделений необходимо программирование температуры в диапазоне 80-250 °С.
Высшие лактоны выделяются из аналита с помощью различных процедур экстракции - без гидролиза, с энзиматическим и кислотным (соляная кислота) гидролизом. Данные многокомпонентного анализа конечных продуктов метаболизма анаэробов вводятся в ЭВМ для сравнения с «библиотекой» типовых профилей конечных продуктов метаболизма и таким образом определяется вид выделенной культуры. Для проведения многокомпонентного анализа рекомендуется использовать капиллярные колонки и программируемый режим температуры. В настоящее время ввиду высокой стоимости систем для ГХ-МС-идентификации анаэробов на основе многокомпонентного анализа продуктов метаболизма экономически нецелесообразна. Перспективно сочетание ГХ для проведения ориентировочной идентификации с традиционными методами, что значительно экономит время и позволяет обойтись небольшим дополнительным набором биохимических тестов и (или) люминесцентных сывороток для проведения видовой идентификации.
Высокая чувствительность и хорошая воспроизводимость позволяет контролировать изменение содержания жирных кислот в аналите в процессе антибактериальной терапии. ГХ даёт возможность определить качественный и количественный состав продуктов метаболизма, свидетельствуя не только о наличии анаэробов, но и об их активности, степени реального участия в развитии патологического процесса, а также позволяет судить об эффективности проводимого лечения [5, 6].
Ряд метаболитов анаэробов (фенилуксусная, про-пионовая, масляная, янтарная кислоты, валериановая ЛЖК) ингибирует хемотаксис гранулоцитов человека в анаэробных условиях, причём больший эффект достигался при более высоких концентрациях кислот; исключение составляла лишь фенилуксусная кислота, которая действует как ингибитор только в низких концентрациях, а в высоких стимулирует хемотаксис. Это свидетельствует о том, что короткоцепочечные ЛЖК играют важную роль в патогенности анаэробов, действуя как потенциальные лейкотоксины. Аналогичным действием обладают и некоторые длинноцепочечные
жирные кислоты. Янтарная кислота - побочный продукт метаболизма бактероидов - подавляет респираторный взрыв нейтрофилов путём снижения внутриклеточного рН, которого достаточно для объяснения необратимого повреждения респираторного взрыва нейтрофилов. Жирные кислоты проявляют свое инги-бирующее действие (по крайней мере, отчасти) путём уменьшения внутриклеточного рН. ЛЖК анаэробов оказывают воздействие и на тромбоциты, что ведёт к нарушению их агрегации и может явиться причиной расстройств микроциркуляции. Пропионовые бактерии продуцируют один из факторов своей вирулентности - липолизин, который приводит к освобождению жирных кислот, вызывающих типичный воспалительный процесс «Common acne».
ГХ-МС позволяет непосредственно определять токсические соединения в биологических средах организма. Методами ГХ-МС в биоптатах гнойных ран, пунктатах абсцессов лёгких и печени, выпоте брюшной полости при перитонитах обнаруживаются летучие метаболиты анаэробов. У больных с анаэробной инфекцией мягких тканей это фенилуксусная и фе-нилпропионовая кислоты, метилиндол; у больных с абсцессами лёгких, кроме этих кислот, - также фенол и метилдиизобутилфенол, индол и метилиндол, ди-метилпиррол и бензотиазол; у больных с абсцессами печени - фенилуксусная кислота, фенол и 2-метил-фенол, индол и метилиндол; у больных с гнойными перитонитами - фенилуксусная и фенилпропионовая кислоты, метилдиизобутилфенол, индол и метилиндол, бензотиазол, этил-этил-кетон и этил-бутил-кетон.
ГХ-МС-определение ЛЖК и токсических метаболитов анаэробов в крови показывает, что снижение концентрации ЛЖК и токсических метаболитов в крови больных с анаэробной инфекцией соответствует улучшению их состояния, в то время как резкое увеличение спектра и количества метаболитов анаэробов свидетельствует о тяжести процесса и является прогностически неблагоприятным [10]. Концентрация ЛЖК и токсических метаболитов в крови больных от 0,0002 до 0,0010 мк/мл определена как слабая степень интоксикации, от 0,0015 до 0,1 мкМ/мл - как среднетяжёлая, от 0,15 до 1,0 мкМ/мл - как тяжёлая, и более 1,0 мкМ/мл - как крайне тяжёлая.
Удельный вес показателей ГХ выше традиционных клинико-лабораторных показателей. Отмечается сильная положительная корреляционная связь между клиническим течением заболевания и метаболической активностью анаэробов, между клиническим течением и накоплением в воспалительном очаге ЛЖК. Метаболическая активность анаэробов в очаге воспаления отражает степень их реального участия в развитии патологического процесса, что может быть использовано для оценки степени тяжести течения ГВЗ и эффективности проводимого лечения.
В настоящее время простых, надежных и удобных способов определения чувствительности анаэробов к химиотерапевтическим препаратам не разработано. Диско-диффузионный метод (ДДМ) и метод серийных разведений (МСР), которые широко используются для определения чувствительности аэробных бактерий, мало приемлемы для анаэробов. МСР, хотя и позволяет определять минимальную подавляющую концентрацию химиопрепаратов, действующих на анаэробы, однако является длительным и трудоёмким. Он может быть использован только в исключительных случаях, при индивидуальном подборе антимикробной химиотерапии тяжёлым больным, но не пригоден для массовых рутинных исследований. Применение ДДМ для определения чувствительности анаэробов имеет ряд недостатков, ограничивающих его возможности. Во-первых, этот метод является качественным, что не позволяет получить количественной или полуколичественной оценки чувствительности изучаемых штаммов анаэробов к химиопрепаратам. Во-вторых, до сих пор ещё не разработаны критерии для оценки чувствительности анаэробов к антибиотикам с помощью ДДМ, как это сделано для аэробов, для этой цели бактериологи вынуждены ориентировочно пользоваться критериями, разработанными для аэробов. В-третьих, при определении чувствительности в анаэробных условиях диаметры зон задержки роста у ряда антибиотиков могут изменяться за счёт наличия углекислоты и других факторов в бескислородной атмосфере. Кроме того, для определения чувствительности анаэробов с помощью ДДМ затрачивается обычно двое-трое суток, что ещё больше продлевает срок бактериологического исследования и абсолютно не удовлетворяет потребностям клиники.
Разработанная методика ГХ-определения изменений метаболизма анаэробов под действием химио-терапевтических препаратов позволяет использовать ГХ-анализ для оценки степени чувствительности исследуемого анаэроба к тестируемым антимикробным препаратам1. Исследуемую пробу разделяют на опытную и контрольную части. Число опытных проб соответствует числу тестируемых антимикробных хи-миотерапевтических препаратов. Регистрируют исходный ГХ-профиль, после чего в каждую пробирку с опытной пробой помещают стандартные диски с химиотерапевтическими препаратами, причём количество дисков подбирается таким образом, чтобы в пробе создавалась концентрация химиотерапевти-ческого препарата, равная его концентрации в сыворотке крови при введении обычных терапевтических доз (см. таблицу).
1 Способ определения чувствительности анаэробных микроорганизмов к антимикробным химиотерапевтическим препаратам. Патент РФ № 2074258.
Концентрации антибактериальных препаратов, используемые для определения чувствительности методом элюции из диска
Конечные
Содержание Количество концентра-
Препарат препарата дисков ции анти-
в диске, мкг на 5 мл среды биотиков,
мкг/мл
Пенициллин С 6 (10 ЕД) 1 1,2 (2 ЕД)
Ампициллин 10 2 4
Карбенициллин 100 3 60
Цефалексин 30 2 12
Левомицетин 30 2 12
Тетрациклин 30 1 6
Эритромицин 15 1 3
Клиндамицин* 2 4 1,6
Метронидазол* 80 1 16
*Диски изготавливаются в лаборатории или используются импортные диски.
Пробы инкубируют в термостате в анаэробных условиях в течение 12 часов, после чего повторно определяют ГХ-профиль и сравнивают между собой полученные ГХ-профили. Схема ГХ-определения чувствительности анаэробов к химиотерапевтическим препаратам показана на рис. 1.
Рис. 1. Схема ГХ-определения чувствительности анаэробов к химиотерапевтическим препаратам
Изменение ГХ-профиля конечных продуктов метаболизма анаэробов под действием химиотера-певтического препарата по сравнению с контролем -культурой, не подвергшейся воздействию антибиотиков, является отражением чувствительности микробов к тестируемому препарату и позволяет объективно судить о степени чувствительности микроба по сравнению с таким известным критерием, как диаметр зоны задержки роста. Характерными изменениями ГХ-профилей анаэробов под воздействием химиотера-певтических препаратов являются, во-первых, выпадение большинства пиков метаболитов, продуцируемых
бактериальной клеткой; во-вторых, выпадение ряда пиков метаболитов, отсутствующих в норме в контроле; в-третьих, снижение высоты и площади пиков. На хроматограмме изменения не являются равноценными. Наиболее часто отмечается снижение высоты и площади пиков, что свидетельствует о неглубоких обратимых изменениях метаболизма бактерий под действием химиотерапевтического препарата, который замедляет метаболические процессы в бактериальной клетке. Накопление метаболитов в среде культивирования идёт более медленно, чем у контрольной культуры, не подвергшейся его воздействию. Чем больше уменьшается площадь хроматографических пиков, тем выше чувствительность микроба к тестируемому химиотерапевтическому препарату (рис. 2).
Рис. 2. ГХ-профиль конечных продуктов метаболизма анаэробов, подвергшихся воздействию антимикробных химиотерапевтических препаратов (эритромицин, левомицетин, азлоциллин)
Наиболее значительные изменения ГХ-профилей анаэробов отмечаются при действии на культуры высокоэффективных антианаэробных препаратов: метронидазола, клиндамицина. Метронидазол вызывает выпадение большей части ГХ-пиков метаболитов, что свидетельствует о грубых, необратимых повреждениях метаболизма бактерий. Хроматограммы штаммов, высокочувствительных к метронидазолу, напоминают изоэлектрическую линию. Подобных изменений ГХ-профиля культур анаэробов под действием клиндамицина не наблюдается. Для повреждающего действия клиндамицина характерны изменения метаболизма клетки в виде «инверсии» хроматограммы, то есть наряду с уменьшением высоты и площади и полным выпадением ряда нормальных пиков на хроматограмме регистрировались атипичные пики (рис. 3).
Рис. 3. ГХ-профиль конечных продуктов метаболизма анаэробов, подвергшихся воздействию антимикробных химиотерапевтических препаратов (клиндамицин, метронидазол, пенициллин)
Причина появления таких атипичных пиков неизвестна, однако есть предположение, что они являются отражением распада внутренних структур бактериальной клетки под действием антибиотика. Подтверждением этому может служить тот факт, что на хроматограмме штаммов анаэробов, подвергшихся воздействию клиндамицина, на 4-й минуте 38 секундах регистрируется пик урацила, азотистого основания, входящего в состав РНК. Появление пика урацила, очевидно, обусловлено его освобождением при распаде рибосомальной РНК под действием клиндамицина.
Различия в изменениях ГХ-профилей культур анаэробов, подвергшихся воздействию метронидазола и клиндамицина, связывают с различным механизмом антибактериального действия этих препаратов. Метронидазол, восстанавливаясь в короткоживущий промежуточный продукт, ингибирует репликацию бактериальной ДНК у анаэробов. Точкой приложения антимикробного действия клиндамицина в бактериальной клетке являются рибосомы, он необратимо ингибирует 50S субъединицу рибосом. Повреждение химиотерапевтическим препаратом различных ультратонких структур бактериальной клетки ведёт к неодинаковым изменениям метаболической активности, что и регистрируется на хроматограмме.
Для оценки степени чувствительности анаэробов к антимикробным химиотерапевтическим препаратам используют отношение суммарных площадей хроматографических пиков опытного и контрольного образцов (в %), обозначаемое TPA„ и определяемое по формуле:
где, Sn - площади хроматографических пиков опытного образца;
Sn, - площади хроматографических пиков контрольного образца.
Изменение ГХ-профиля метаболитов анаэробов под действием антимикробных химиотерапевтиче-ских препаратов позволяет судить о степени чувствительности микробов к данному препарату. Высокая чувствительность (I степень) определялась при показателе TPAr < 20%; средняя (II степень) определялась при показателе TPAR от 21 до 40%; низкая (III степень) - при показателе TPAR от 41 до 70%; устойчивость (IV степень) определялась при показателе TPAR > 71%. Корреляция данных ГХ-способа определения чувствительности к антимикробным химиотерапев-тическим препаратам и метода серийных разведений составляет 74,6-97,9%.
При воздействии химиотерапевтических препаратов изменение ГХ-профиля метаболитов анаэробов позволяет судить о степени чувствительности микробов к антибактериальным химиопрепаратам. Выпадение или изменение ГХ-спектра более чем на 70% указывает на высокую чувствительность, от 30 до 69% - на среднюю, менее 30% - на низкую чувствительность анаэробов к химиотерапевтическим препаратам.
ГХ находит широкое применение в анаэробной бактериологии. Метод ГХ прост по своей технике, высокочувствителен, занимает мало времени, обладает хорошей воспроизводимостью результатов. В настоящее время все большее применение он находит в научно-исследовательских, клинических, бактериологических, ветеринарных и санитарно-бактериологиче-ских лабораториях. Использование ГХ при исследовании на анаэробы сокращает время анализа, повышает его точность и надежность. В то же время метод ГХ нельзя противопоставлять традиционным микробиологическим методам. Он может стать ценным вспомогательным средством, которое будет использоваться главным образом тогда, когда традиционные методы оказываются несостоятельными или занимают слишком много времени. Развитие в будущем многоканальных хроматографических систем, связанных с хромато-масс-спектрометром и компьютером, а также создание обширной «библиотеки» метаболических профилей микробов позволит проводить прямую идентификацию анаэробных бактерий непосредственно в аналите без выделения чистой культуры. Если окажется возможным сделать эту методику рутинной, это будет означать действительный переворот в клинической микробиологической лаборатории.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробьёв А.А., Миронов А.Ю., Пашков Е.П. Современные методы лабораторной диагностики инфекций, вы-
2.
3.
4.
5.
6.
7.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
зываемых неспорообразующими анаэробными бактериями // Клин. лаб. диагностика. 1996. №1. С.14-16. Воробьёв А.А., Миронов А.Ю., Пашков Е.П. и др. Состояние проблемы инфекций, вызываемых неспорообразующими анаэробными бактериями // Вестн. РАМН. 1996. №2. С.3-8.
Воробьёв А.А., Пашков Е.П., Миронов А.Ю. и др. Современное состояние лабораторной диагностики инфекций, вызываемых неспорообразующими анаэробами, и пути её совершенствования // Вестн. РАМН. 1994. №8. С.26-29.
Истратов В.Г., Миронов А.Ю. Современные методы хроматографического и масс-спектрометрического исследования анаэробной инфекции // Клин. лаб. диагностика. 2001. №11. С.36.
Истратов В.Г., Миронов А.Ю., Руднева В.Г. и др. Изучение патогенетических механизмов интоксикации у больных с анаэробной неклостридиальной инфекцией // Вестн. РАМН. 1996. №2. С.41-43. Истратов В.Г., Светухин А.М., Французов В.Н., Миронов А.Ю. Возможности методов газовой хроматографии и масс-спектрометрии в хирургической клинике // Клин. лаб. диагностика. 2001. №11. С.36. Кочеровец В.И., Михайлова В.С., Миронов А.Ю. и др. Методы микробиологического анализа неспорообразу-ющих анаэробных бактерий. М.: Лабинформ, 1996. 58 с. МироновА.Ю. Неспорообразующие анаэробы // Клиническая лабораторная аналитика. Том IV. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории: Руководство под ред. В.В. Меньшикова. М.: Агат-Мед, 2003. С.477-519. Миронов А.Ю., Истратов В.Г. Новые подходы к определению чувствительности к антимикробным химио-терапевтическим препаратам облигатных анаэробных бактерий // Клин. лаб. диагностика. 1998. №9. С.12-18. Миронов А.Ю., Истратов В.Г., Осман К.А. Новые методические подходы к диагностике септических состояний с помощью метода газовой хроматографии и хромато-масс-спектрометрии // Клин. лаб. диагностика. №9. 2004. С.65.
Миронов А.Ю., Пашков Е.П. Неспорообразующие анаэробы и их роль в патологии человека: Лекция под ред. А.А. Воробьёва. М., 1990. 66 с.
Миронов А.Ю., Пашков Е.П., Зурабашвили З.А. Применение метода газо-жидкостной хроматографии в анаэробной бактериологии: Методические рекомендации / Республиканский хроматографический центр МЗ ГССР. Тбилиси, 1988.
Миронов А.Ю., Пашков Е.П., Истратов В.Г., Быков А.С. Бактериологическая и газохроматографическая диагностика неклостридиальной анаэробной инфекции при гнойно-воспалительных заболеваниях челюстно-лицевой области и ЛОР-органов // ЖМЭИ. 1988. №8. С.31-35.
Митрука Б.М. Применение газовой хроматографии в микробиологии и медицине. М.: Медицина, 1978. 600 с. Mironov A.Yu., Istratov V.G., Pashkov E.P., Mironov A.A. Microbiological diagnosis of suppurative-inflammatory processes of E. N. T. organs and the maxillo-mandibulo-facial region under suspicion of anaerobic non-clostridial infection // J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol. 1990. V.34, No.1. Р.191-198.
