CC BY
66
fertility compared with infertility associated with peritoneal endometriosis // Human Reproduction. - 1998. - Vol. 13. - P. 2602-2605.
15. Sikka S.C. Role of oxidative stress and antioxidants in andrology and assisted reproductive technology // Journal of Andrology. - 2004. -Vol. 25. - P. 5-18.
16. Van Langendonckt A., Casanas-Roux F., Donnez J. Oxidative stress and peritoneal endometriosis // Fertility and Sterility. - 2002. -Vol. 77. - P. 861-870.
17. Wu M.Y., Chao K.H., Yang J.H. et al. Nitric oxide synthesis is increased in the endometrial tissue of women with endometriosis // Human Reproduction. - 2003. - Vol. 18. - P. 2668-2671.
УДК 615.276:547.587.11.062
ФОТОМЕТРИЧЕСКАЯ МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ у-АМИНО-р-ФЕНИЛМАСЛЯНОЙ
КИСЛОТЫ В СУБСТАНЦИИ САЛИФЕНА
© Беликов В.Г., Ларский М.В.
Кафедра фармацевтической химии Пятигорской государственной фармацевтической академии, Пятигорск,
Ставропольский край
E-mail: mynya@rambler.ru
Целью данной работы являлась разработка и валидация фотометрической методики количественного определения у-амино-Р-фенилмасляной кислоты в субстанции салифена по реакции с нингидрином. С помощью симплексного планирования эксперимента найдены оптимальные условия для проведения фотометрической реакции. Установлено, что среднее содержание у-амино-Р-фенилмасляной кислоты в субстанции салифена составляет 72,12±0,73% при относительной погрешности определения ±1,02%. Валидацион-ная оценка предлагаемой методики показала, что она характеризуется удовлетворительной линейностью, правильностью, сходимостью результатов.
Ключевые слова: салифен, у-амино-Р-фенилмасляная кислота, симплексное планирование, фотометрическое определение, валидационная оценка.
PHOTOMETRIC METHOD FOR DETERMINATION OF y-AMINO-P-PHENYLBUTYRIC ACID
IN SALIPHEN SUBSTANCE Belikov V. G., Larsky M.V.
Pharmaceutical Chemistry Department of the Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy, Pyatigorsk,
Stavropol Region
The aim of this research was an investigation and validation of photometric method for quantification of y-amino-P-phenylbutyric acid in saliphen substance by ninhydrin reaction. By simplex method the optimal conditions for this reaction were developed. It was obtained that the average concentration of y-amino-P-phenylbutyric acid in saliphen substance is 72.12±0.73% (relative error of determination was ±1.02%). This method has also shown good linearity, repeatability and accuracy.
Key words: saliphen, y-amino-P-phenylbutyric acid, simpex planning, photometric determination, validation.
В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания являются одними из ведущих причин смертности населения. В связи с этим актуальной задачей современной медицины является поиск новых лекарственных препаратов для их профилактики и лечения. В медицинской практике для коррекции нарушений, связанных с сосудистой патологией, в качестве вспомогательного лекарственного средства применяется фенибут (у-амино-Р-фенилмасляной кислоты гидрохлорид). Он улучшает энергетические процессы и кровоснабжение мозга, обладает антигипоксиче-ским действием, оказывает положительное влияние на сердце при различных патологических состояниях [1]. В фармакологических исследованиях также оказалось перспективным применение фенибута в виде соединений
с органическими кислотами. Одним из таких биологически активных соединений является салифен, представляющий собой аддукт у-амино-Р-фенилмасляной кислоты (АФМК) и кислоты салициловой (КС) в молярном соотношении 2:1. Важным этапом на пути его внедрения в медицинскую практику является разработка норм качества на субстанцию.
Целью данной работы явилась разработка и валидация фотометрической методики количественного определения АФМК в субстанции салифена по реакции с нингидрином.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объекта исследования использовали образцы субстанции салифена, полу-
ченные на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.И. Герцена (г. Санкт-Петербург).
Принципиальная возможность использования реакции с нингидрином для фотометрического определения АФМК в субстанции салифена основана на наличии у АФМК первичной алифатической аминогруппы, которая взаимодействует с нингидрином с образованием окрашенного продукта реакции. На первом этапе исследований нами был проведен поиск оптимальных условий для проведения количественного определения АФМК в субстанции салифена и установлены спектральные характеристики продукта реакции АФМК с нингидрином. В литературе [2] имеются сведения о том, что оптическая плотность продукта реакции фенибута и нин-гидрина зависит от объемной концентрации и рН буферного раствора, соотношения амино-кислота-нингидрин, объема нагреваемой смеси и времени нагревания, объемной концентрации этанола. Отмечено, что добавление 0,05% водного раствора кислоты аскорбиновой повышает чувствительность реакции. Для изучения совместного влияния некоторых из этих факторов на оптическую плотность продукта реакции нингидрина с АФМК в присутствии кислоты салициловой был использован метод симплексного планирования [3]. Основные уровни и интервалы варьирования факторов, взятые с учетом имеющихся сведений о процессе, представлены в табл. 1.
На основании этих данных был составлен и реализован симплексный план. Параметром оптимизации являлась величина оптической плотности при 568 нм (А). Концентрация раствора салифена составляла 0,001%.
Далее, в выбранных условиях анализа проводили количественное определение
АФМК в субстанции салифена. Методика исследования состояла в следующем: около 0,1 г салифена (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли 60-80 мл воды, нагретой до кипения, и перемешивали в течение 3-5 минут до полного растворения. После охлаждения объем раствора доводили до метки. Переносили 1 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли 2 мл 1% спиртового раствора нингидрина, 5 мл фосфатного буферного раствора с рН 6,5 и 2 мл 0,05% водного раствора кислоты аскорбиновой и нагревали на водяной бане в течение 20 минут.
Затем раствор охлаждали, объем доводили до метки водой очищенной. На спектрофотометре СФ-56 в кварцевых кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм при 568 нм измеряли оптические плотности полученного раствора салифена и стандартного раствора АФМК. Стандартный раствор АФМК получали следующим образом: в мерную колбу вместимостью 100 мл помещали 3 мл 0,02% раствора АФМК, добавляли 2 мл 1% спиртового раствора нингидрина, 5 мл фосфатного буферного раствора с рН 6,5 и 2 мл 0,05% водного раствора кислоты аскорбиновой. Полученную реакционную смесь нагревали на водяной бане в течение 20 минут, после охлаждения объем доводили водой до метки. Раствор сравнения, относительного которого проводили измерения, готовили следующим образом. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещали 3 мл воды, добавляли 2 мл 1% спиртового раствора нингидрина, 5 мл фосфатного буферного раствора с рН 6,5 и 2 мл 0,05% водного раствора кислоты аскорбиновой. Полученный раствор нагревали на водяной бане в течение 20 минут, после охлаждения объем доводили водой до метки.
Таблица 1
Факторы, влияющие на величину оптической плотности продукта взаимодействия АФМК
с нингидрином
Фактор Основной уровень Интервалы варьирования
Значение рН фосфатного буферного раствора (Х1) 6,5 1,0
Объем фосфатного буферного раствора, мл (Х2) 5 3,0
Время нагревания, мин. (Х3) 20 15
Объем 1% спиртового раствора нингидрина, мл (Х4) 2,0 2,0
Объем 0,05% водного раствора кислоты аскорбиновой, мл (Х5) 2,0 2,0
Содержание АФМК рассчитывали по формуле:
т,п/ Аг-0,02-3-100-100-100 А -в
X. /о — ■ х - х
Аст -аЛЛОО -100
Аст'а
где Ах - оптическая плотность исследуемого раствора, Аст - оптическая плотность стандартного раствора, а - масса навески салифена, г.
Валидационную оценку методики осуществляли в соответствии с рекомендациями ICH [4] по показателям: линейность, сходимость, правильность. Линейность устанавливали при 8 уровнях концентраций в диапазоне от 0,0002 до 0,0016%. Для каждой точки определение проводили в трехкратной повторности. Полученные данные анализировали с помощью линейного регрессионного метода наименьших квадратов.
Сходимость результатов анализа по предложенной методике определяли по значению коэффициента вариации. Исходными данными служили значения, полученные при установлении линейности.
Правильность методики устанавливали по степени открываемости внесенных количеств АФМК к раствору салифена (метод добавок). Для этого в мерные колбы вместимостью 100 мл вносили по 1 мл 0,1% раствора салифена, добавляли соответственно 1; 2; 3 мл стандартного 0,001% раствора АФМК и вели определение по указанной выше методике.
После каждой добавки определение проводили в шестикратной повторности.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Спектр поглощения продукта реакции АФМК с нингидрином характеризуется наличием двух максимумов светопоглощения при 402±2 нм и 568±2 нм. Результаты определения при использовании в качестве аналитической длины волны 568 нм характеризуются более низким значением относительной погрешности. Кроме того, оптическая плотность продукта реакции при данной длине волны практически не изменяется в течение 3 часов, поэтому в дальнейших исследованиях использовали оптическую плотность при 568 нм.
Результаты поиска оптимальных условий для проведения фотометрической реакции нингидрина с АФМК в субстанции салифена симплексным методом представлены в табл. 2.
Как следует из данных таблицы, оптимальные условия были достигнуты в вершине 6 исходного симплекса So, так как попытка двигаться в новом направлении (симплексы S^ S2) не привела к увеличению значений оптической плотности.
Статистически обработанные результаты шести определений АФМК в 0,1 г субстанции салифена приведены в табл. 3.
Таблица 2
Симплексный план поиска оптимальных условий для количественного определения АФМК в субстанции салифена фотометрическим методом по реакции с нингидрином
Симплекс Вершины симплекса Xi Х2 Х3 Х4 Х5 А
So 1 6,0 3,6 17 1,7 1,75 0,671
2 7,0 3,6 17 1,7 1,75 0,728
3 6,5 7,9 17 1,7 1,75 0,708
4 6,5 5 29 1,7 1,75 0,764
5 6,5 5 20 3,3 1,75 0,746
6 6,5 5 20 2,0 3,3 0,791
Si 7 7,2 7 24 2,5 2,4 0,645
S2 8 6,5 1 24 2,5 2,4 0,564
Результаты определения АФМК в субстанции салифена
Таблица 3
Найдено АФМК, % Метрологические характеристики
72,82 хср = 72,12 Sx = 0,2849 Дхед = 1,79 Дхср = 0,73 вед = ±2,49% 8ср = ±1,02%
72,63
71,69
72,71
71,73
71,12
А 1,41,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 -0 -
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014 0,0016 0,0018
С салифена, %
т--------------------1--------------------1-------------------1-------------------1--------------------1-------------------1--------------------г
Рис. 1. График линейной зависимости концентрации салифена от величины оптической плотности.
Таким образом, содержание АФМК в субстанции салифена составляет 72,12±0,73% (относительная погрешность определения ±1,02%).
Результаты, полученные при фотометрическом определении салифена по реакции с нингидрином, позволили построить график линейной зависимости между концентрацией салифена и величиной оптической плотности (рис. 1).
Основные параметры линейного регрессионного анализа полученных данных методом наименьших квадратов представлены в табл. 4.
Как следует из полученных результатов, линейная зависимость между оптической плотностью и концентрацией для салифена соблюдается в интервале 0,0002 - 0,0018% (коэффициент корреляции 0,9959). Рассчитанный коэффициент вариации (CV) оказался равным 0,82, что меньше значения, лимитированного ICH (1%). На основании этого можно сделать вывод, что предлагаемая методика характеризуется удовлетворительными линейностью и сходимостью.
Результаты установления правильности методики, выраженные в степени открывае-мости внесенных количеств АФМК к раствору салифена, представлены в табл. 5.
