CC BY
71
УДК 547.97: 535.34/37
Лантух Ю.Д., Пашкевич С.Н., Алиджанов Э.К.
Оренбургский государственный университет E-mail: lantukh@yandex.ru
ФОТОФИЗИКА ОПТИЧЕСКИХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ КОМПЛЕКСОВ БИОПОЛИМЕРОВ С ОРГАНИЧЕСКИМИ КРАСИТЕЛЯМИ
Исследование физико-химических свойств комплексов органических красителей с биополимерами различной природы является важной задачей в связи с большим потенциалом использования таких систем в медицине, нанотехнологиях, молекулярной электронике, фотонике.
В данной работе представлены результаты исследований оптических свойств пленочных су-прамолекулярных структур на основе органических красителей и биополимеров (ДНК, хитозан), а также возможностей применения таких материалов в оптоэлектронике.
Предложен способ получения оптически однородных пленочных структур на основе двуспи-ральной ДНК, сформированных по принципу «гость - хозяин», в которых молекулы красителя («гость») обладают высокой флуоресцентной способностью. Получена суперлюминесценция пиронина G в такой системе.
Разработана методика получения эффективных люминофоров на основе системы анионный краситель - хитозан. В пленочной системе сульфородамин B - хитозан также получен эффект суперлюминесценции красителя.
Экспериментально продемонстрирована возможность применения пленочного материала ДНК-краситель в качестве бесконтактного датчика (сенсорного элемента) относительной влажности воздуха.
В работе показано, что исследуемые оптические функциональные материалы на основе систем биополимер - краситель могут быть использованы в качестве высокоэффективных люминофоров, бесконтактных датчиков и других устройств в оптоэлектронике.
Ключевые слова: ДНК, хитозан, органические красители, пленочные материалы, наноразмер-ные комплексы, электронные спектры, люминесценция, лазеры, суперлюминесценция, сенсор влажности, оптоэлектроника.
Введение
Биологические молекулы в последнее время являются предметом многочисленных исследований, посвященных разработке новых нанострук-турных материалов и другим применениям в нанотехнологиях и оптоэлектронике.
Молекула ДНК, являющаяся носителем генетической информации, обладает специфическими физико-химическими свойствами и рассматривается в последнее время в качестве одного из основных конструктивных элементов при создании новых материалов в нанотехнологиях [1].
Такой подход основан на специфических физико-химических свойствах, присущих ДНК, например, способности к самосборке и формированию упорядоченных структур из встраиваемых наночастиц, наличии отрицательного заряда, достаточной жесткости в ближнем порядке и др.
В настоящее время проводятся интенсивные исследования по применению ДНК в молекулярной фотонике [2].
Нуклеиновые кислоты не обладают светочувствительностью в видимой области спектра (максимум поглощения оснований ДНК находится в районе 260 нм), поэтому создание материалов для оптоэлектронных приложений требует введения в
их состав спектральных сенсибилизаторов. В качестве таковых могут быть использованы органические красители.
Многие органические красители (акридиновые, тиазиновые и др.) являются биологически активными соединениями, демонстрирующими мутагенную активность и фотодинамическое действие. Такие эффекты возможны благодаря связыванию молекул красителей с ДНК. Обладая высоким квантовым выходом флуоресценции, некоторые красители широко используются в биологии в качестве молекулярных люминесцентных зондов.
Информация о механизмах связывания органических красителей с ДНК важна также для создания оптоэлектронных материалов и устройств на базе таких систем.
Взаимодействие органических красителей, в том числе акридиновых и ксантеновых, с нуклеиновыми кислотами в растворах интенсивно изучалось с использованием различных методов в течение последних десятилетий. Спектроскопические исследования позволили получить важную информацию о комплексах связывания таких красителей как акридиновый оранжевый и пиронин G с ДНК в водных буферных растворах [3]-[7].
Однако спектрально-люминесцентные свойства полимерных пленок ДНК с внедренными молекулами красителей практически не изучены.
Интерес к изучению хитозана возник благодаря комплексу уникальных физико-химических и биологических свойств этого биополимера, обусловливающих многообразие областей его применения (невирусные носители в генной терапии, биосенсоры, сорбенты и др.).
Целью работы являлось изучение комплексов катионных и анионных молекул органических красителей с ДНК (полианион) и хитозаном (поликатион) в пленочной форме и целенаправленное изменение свойств таких комплексов для создания прототипов оптоэлектронных устройств на базе указанных материалов.
Одной из возможных областей применения материалов краситель - биополимер является создание активных сред лазеров на красителях при обеспечении высокой степени упорядоченности активных центров (молекул красителей) в матрице биополимера. Реализация такой упорядоченности, т. е. расположение наночастиц в нужном месте и формирование между ними стабильных связей является одной из основных задач при создании наноматериалов. Для ее решения предложено использовать принцип самосборки по типу «снизу-вверх», реализуемый в системах краситель - биополимер.
Другим примером применения разрабатываемых материалов является оптический датчик относительной влажности воздуха (гигрометр), принцип действия которого основан на спектроскопическом мониторинге спектральных свойств органического красителя в сенсорном пленочном элементе, которые изменяются при изменении влажности окружающей среды.
Объекты и методика эксперимента
Исследования проводили с натриевой солью высокомолекулярной ДНК (MP Biomedicals), выделенной из молок лосося. Использовали хитозан фирмы МР Biomedicals. Глицерин (Эколаб) очищали двойной вакуумной перегонкой.
Красители пиронин G, сульфородамин В (SB) и акридиновый оранжевый (АО) (Sigma) использовали без дополнительной очистки.
Пленки ДНК с красителем на стеклянных подложках получали по методике, использованной в работе [8]. Соотношение содержания ДНК
и красителя в растворе, выражаемое как отношение концентрации нуклеотидов к концентрации лиганда P/D, составляло 40 - 100.
Пленки хитозана получали поливом из раствора полимера в слабой уксусной кислоте, к которому добавляли необходимое количество водного раствора красителя.
Спектры поглощения и люминесценции регистрировали на оптоволоконном спектрометре AvaSpec 2048 (Avantes). Для возбуждения флуоресценции использовали перестраиваемый аргоновый лазер Lexel-88 (LEXEL) и DPSS YAG-Nd cw лазер KLM-532/SLN (ФТИ-Оптроник). Схема возбуждения образца - фронтальная. В качестве импульсного источника возбуждения флуоресценции использовали YAG-Nd лазер LQ-129 (Со-лар ЛС).
Для исследования суперлюминесценции образцов использовалась схема с поперечной накачкой, подобная схеме из работы [9]. В этом случае пучок излучения лазера накачки (LQ-129, 532 нм) фокусировался цилиндрической линзой на поверхности образца. Область возбуждения имела форму полоски шириной менее миллиметра. Флуоресценция снималась с торца пленки.
Результаты и обсуждение
ДНК-краситель
В работе [8] нами с помощью спектроскопических методов было проведено исследование конформационного состояния ДНК в форме пленки, содержащей органический краситель акридиновый оранжевый. Было показано, что молекулы ДНК в сухих пленках при комнатной влажности воздуха (о.в. < 50%) денатурированы, краситель связывается с биополимером с образованием нескольких типов комплексов. Молекулы красителя, связанные с биополимером в виде комплексов различного типа, представляют собой разнородные оптические центры. Присутствие в системе таких центров приводит к различию частот электронных переходов, что обуславливает проявление неоднородного уширения оптических спектров. Было показано также, что флуоресценция красителя в сухих пленках ДНК практически отсутствует. По нашему мнению этот факт может объясняться присутствием в системе нелюминесцирующих ассоциатов красителя, переносом энергии электронного возбуждения от мономерных молекул красителя на такие ассоциаты, а также повышен-
ной конформационной подвижностью одноцепо-чечных фрагментов ДНК, что может приводить к увеличению вклада процессов безызлучательной релаксации.
В результате анализа спектров, полученных в [8], нами установлено, что эффект стабилизации В-формы ДНК даже при пониженных значениях о.в. среды может быть достигнут путем внесения в полимерные пленки добавок глицерина. Данные электронной и ИК спектроскопии свидетельствуют о том, что в исследуемых образцах наблюдается сохранение двуспиральной структуры ДНК. По нашему мнению, стабилизирующее влияние добавки может быть обусловлено, как высокой способностью глицерина удерживать сорбцион-ную воду, так и взаимодействием молекул глицерина с ДНК, сопоставимым с влиянием молекул воды на состояние двойной спирали. Молекулы красителя в такой системе присутствуют в виде наноразмерных оптически активных центров одного типа, которые формируются благодаря самосборке по принципу «гость-хозяин». В качестве «гостя» выступают молекулы красителя, а «хозяина» - сайты связывания интеркаляционного типа молекул нативной ДНК. При этом неоднородное уширение спектров красителя отсутствует.
Нами исследованы флуоресцентные свойства красителя пиронина G, внедренного в матрицу ДНК в форме биополимерной пленки, стабилизированной глицерином.
На рисунке 1 (кривая 1) представлен спектр флуоресценции пиронина G в пленке ДНК-глицерин, полученный при лазерном возбуждении на длине волны 532 нм DPSS YAG-Nd лазером. Такие же (по форме) спектры регистрируются при возбуждении аргоновым лазером на длинах волн 488 и 514 нм. Мощность возбуждающего лазерного излучения во всех случаях составляла 1 мВт.
Наличие интенсивной флуоресценции и независимость ее спектра от длины волны возбуждения свидетельствуют о том, что молекулы пиронина G в пленке ДНК, стабилизированной глицерином, представляют собой оптически активные центры одного типа. В сухих пленках ДНК флуоресценция пиронина G практически отсутствует.
Учитывая возрастающий интерес к разработкам полимерных оптических волокон и пленок с органическими красителями как активным средам перестраиваемых лазеров [10], нами была пред-
принята попытка получить суперлюминесценцию биополимерных пленок ДНК - пиронин G - глицерин, используя для накачки вторую гармонику импульсного YAG-Nd лазера (^ = 532 нм) и схему возбуждения с поперечной накачкой пленочного образца.
Энергия импульсов возбуждения Еимп изменялась в пределах от 0,05 до 5 мДж, длительность импульсов составляла 15 нс. Флуоресценция образца снималась с торца пленки. Спектр флуоресценции красителя регистрировался после каждого импульса лазерного возбуждения при помощи волоконного спектрометра AvaSpec 2048, работающего по принципу полихроматора. При малых энергиях импульсов накачки (~0,1 мДж) спектр флуоресценции практически совпадает по форме со спектром, полученным при возбуждении непрерывными лазерами (кривая 1 на рис. 1). По мере увеличения энергии импульсов возбуждения происходило возрастание интенсивности флуоресценции, а, начиная с некоторого значения, оно принимало нелинейный характер. При этом наблюдалось сужение спектра люминесценции и ее индикатрисы. Пример регистрируемого в этом случае спектра флуоресценции пиронина G приведен на рисунке 1, кривая 2 (Еимп= 3 мДж, величина сигнала уменьшена в 400 раз).
Из рисунка 1 видно, что при достаточном увеличении плотности мощности накачки сигналы флуоресценции изменялись по форме спектра и интенсивности от обычной люминесценции, обусловленной спонтанным излучением (кривая 1), до суперлюминесценции (кривая 2).
550 600 650 Л, ям
Рисунок 1. Спектры флуоресценции пиронина G в матрице ДНК-глицерин, P/D = 50, полученные при разных условиях возбуждения. Величина сигнала для кривой 2 уменьшена в 400 раз
Полученный результат по нашему мнению обусловлен тем, что в полимерных пленках ДНК- пиронин G с добавкой глицерина молекулы красителя интеркалированы в двойную спираль ДНК, являются оптически активными центрами одного типа и обладают высоким выходом флуоресценции.
В литературе известны примеры применения материалов, основанных на комплексах ДНК-краситель, для получения суперлюминесценции [9], [11], [12], но все они содержат поверхностно-активные вещества (ПАВ) в качестве компонентов, обеспечивающих внешнее связывание красителя с ДНК.
Отличительной особенностью нашего подхода к созданию пленочных структур на основе комплексов ДНК - органический краситель является отсутствие ПАВ как необходимого компонента. Это существенно упрощает процедуру получения пленок, и главное, позволяет использовать преимущества внутриспиральной упаковки молекул красителей.
Хитозан-краситель.
В данном разделе приведены результаты спектрально-люминесцентных исследований комплексов красителя сульфородамина В с хи-тозаном.
Поскольку хитозан является поликатионным полимером, то связывание анионных красителей с ним должно (в случае антикооперативного характера такого связывания) приводить к формированию комплексов мономерный краситель - хи-тозан с высокой плотностью упаковки красителя (методика самосборки наноструктур типа «снизу-вверх»). Люминесцентный канал дезактивации энергии электронного возбуждения (квантовый выход флуоресценции) в молекуле красителя в этом случае должен быть максимально высоким. На этом базируется идея создания пленочного активного элемента лазера на красителях.
На рисунках 2 и 3 представлены спектры поглощения и люминесценции сульфородами-на В в пленках хитозана. Концентрации красителя (в пленке) для кривых 1 - 4 на рис. 2 и
3 равны: 1 - 6,5х10-4, 2 - 3,2х10-4, 3 - 1,6х10-4,
4 - 8х10-5, моль/л.
Характерной особенностью известного люминофора анионного красителя сульфородами-на В является его высокая способность к обра-
зованию ассоциатов в водных растворах. Это существенно снижает выход люминесценции красителя.
Введение SB в матрицу хитозана приводит к формированию комплексов «мономер красителя -биополимер», что значительно уменьшает количество ассоциатов красителя в системе (рис. 2) и способствует развитию люминесцентного канала дезактивации энергии возбуждения (рис. 3).
Пунктирная кривая на рисунке 2 представляет спектр поглощения раствора SB в воде с концентрацией 10-5 моль/л.
На рисунке 4 представлены спектры люминесценции пленочной системы SB - хитозан при импульсном возбуждении второй гармоникой YAG -Nd лазера (^ = 532 нм) по схеме с поперечной накачкой.
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
550 600 650 Л мм
Рис. 3 Спектры люминесценции сульфородамина В в плёнках хитозана.
Рис. 2 Нормированные спектры поглощения сульфородамина В в плёнках хитозана.
Концентрация красителя в пленке составляла 8*10-5 моль/л.
Из рисунка видно, что по мере увеличения энергии накачки от 0,26 мДж (кривая 1) до 1,25 мДж (кривая 2) и 2,55 мДж (кривая 3) имеет место резкое нелинейное увеличение интенсивности сигнала и сужение его спектра. Также происходило сужение индикатрисы люминесцентного сигнала до нескольких мрад. Все это свидетельствует о проявлении в данной системе эффекта суперлюминесценции красителя.
Сенсор влажности на основе пленки ДНК -краситель
Существуют некоторые задачи измерения влажности, относящиеся к наиболее сложным. Это измерение влажности в замкнутых объемах, удаленный (до нескольких метров) мониторинг влажности сред, а также измерения, не позволяющие пользоваться электропитанием в сенсорных устройствах.
По нашему мнению, именно решению таких задач может способствовать предлагаемый нами подход с использованием функционального материала на основе нанокомплексов ДНК - краситель.
Принцип действия такого сенсорного элемента основан на изменении конформационного состояния ДНК в форме пленочного образца при изменении влагосодержания пленки.
На рисунке 5 представлены спектры поглощения пленки акридиновый оранжевый - ДНК при различных уровнях относительной влажности воздуха.
Если сухую пленку ДНК-АО подвергнуть увлажнению, ее спектр поглощения в видимой области претерпевает изменения: димерная полоса в области 476 нм исчезает, а мономерный максимум при 502 нм растет, и при относительной влажности среды 95% спектр становится полностью «мономерным». На рисунке 5 такие изменения соответствуют переходу от спектра 1 к спектру 2. При высыхании пленки ее спектр возвращается к исходному виду 1. Число циклов «увлажнение-высыхание», сопровождающихся отмеченной трансформацией спектров, в наших экспериментах составляло более 20 без заметных изменений свойств пленки.
Процессы, лежащие в основе наблюдаемых эффектов, связаны с обратимым конформацион-
ным переходом между денатурированной ДНК и ее нативной В-формой. Такой переход приводит к изменению типа комплексов связывания АО с ДНК. При увлажнении сухой пленки происходит диссоциация димеров красителя с последующей интеркаляцией мономерных молекул между парами оснований. По мере понижения о.в. происходит перераспределение красителя: часть молекул высвобождается из двойной спирали, образуя димерные агрегаты, связанные с ДНК по внешнему типу.
Отмеченный процесс, как видим, доступен для мониторинга спектрофотометрически в видимой области, что может быть положено в основу создания оптического датчика влажности.
550 600 650 Л, нм
Рис.4. Спектры люминесценции (суперлюминесценции) пленки сульфородамин В - хитозан при импульсном возбуждении второй гармоникой YAG -Nd лазера ( = 532 нм).
D
450 475 500 525 550
Рис. 5 - Спектры поглощения акридинового оранжевого в плёнке ДНК при различных уровнях относительной влажности. 1 - о.в. 50%, 2 - о.в. 95%.
Таким образом, в настоящей работе показано, что в пленочных образцах на примере систем ДНК-краситель и хитозан - краситель реализуется принцип самосборки однородных супрамолекулярных структур по методике «снизу-вверх» и указанные пленочные структуры можно отнести к функциональным материалам с заранее заданными свойствами. В образцах ДНК-пиронин G-глицерин и хитозан - SB получена суперлюминесценция красителя.
Экспериментально продемонстрирована
ДНК-краситель в качестве бесконтактного датчика (сенсорного элемента) относительной влажности воздуха.
В качестве других примеров наших разработок оптоэлектронных приложений систем на основе биополимерных матриц (ДНК, хитозан) с внедренными органическими красителями можно привести регистрирующие среды для записи голограмм [13]-[15], пленочные системы, содержащие J-агрегаты красителей и другие.
10.12.2015
возможность применения пленочного материала
Работа выполнялась при поддержке РФФИ, грант №11-02-97021-р_поволжье_а. Работа выполнялась при поддержке Минобрнауки РФ, ГЗ на проведение НИР №450
от 01.02.2014 г.
Список литературы:
1. Seeman N.S. Nanomaterials based on DNA // Annu. Rev. Biochem. — 2010. — V. 79. — P. 65-87.
2. Steckl A.J., Spaeth H., et al. DNA as an Optical Material // OPN Optics & Photonics News. — 2011 — P.35-39.
3. Fredericq E., Houssier C. Study of the Interaction of DNA and Acridine Orange by Various Optical Methods // Biopolymers — 1972. — V. 11, — N. 11. — P. 2281-2308.
4. Geacintov N.E., Waldmeyer J., Kuzmin V.A., Kolubayev T. Dynamics of the Binding of Acridine Dyes to DNA Investigated by Triplet Excited State Probe Techniques // J. Phys. Chem. — 1981. — V.85(24). — P. 3608-3613.
5. Kononov A.I., Moroshkina E. B., Tkachenko N. V., Lemmetyinen H. Photophysical Processes in the Complexes of DNA with Ethidium Bromide and Acridine Orange: A Femtosecond Study // J. Phys. Chem. B. — 2001. — V.105 (2). — P. 535-541.
6. Kapuscinski J., Darzynkiewicz Z. Interactions of Pyronin Y(G) With Nucleic Acids // Cytometry. — 1987. — V. 8 - P. 129-137.
7. Darzynkiewicz Z., Kapuscinski J., Traganos F., Crissman H.A. Application of Pyronin Y(G) in Cytochemistry of Nucleic Acids // Cytometry. — 1987. — V. 8 - P. 138-145.
8. Лантух Ю.Д., Пашкевич С.Н., и др. Спектроскопические свойства биополимерных пленок ДНК - акридиновый оранжевый // Оптика и спектроскопия. — 2011. — T. 110. — №6. — C. 932-937.
9. Kawabe Y. et al. Thin-film lasers based on dye-deoxyribonucleic acid-lipid complexes // Appl. Phys. Lett. — 2002. — V. 81. — P. 1372-1374.
10. Майер Г.В., Копылова, В.А. и др. Активные полимерные волокна с органическими красителями. Генерация и усиление когерентного излучения // Квантовая электроника. — 2007. — Т. 37. — №1. — С. 53-59.
11. Kawabe Y., Wang L., Horinouchi S., T., Ogata N. Amplified Spontaneous Emission from Fluorescent-Dye-Doped DNA+Surfactant Complex Films. // Adv. Mater. — 2000. — 12. — N. 17. — P. 1281-1283.
12. Mysliwiec J., Sznitko L., et al. Lasing effect in a hybrid dye-doped biopolymer and photochromic polymer system // Appl. Phys. Lett. — 2010. — V. 96. — P. 141106-1 - 141106-3
13. Лантух Ю.Д., Пашкевич С.Н. и др. Нестационарная голографическая запись в биополимерных пленках ДНК - акридиновый оранжевый // Оптика и спектроскопия — 2013. — Т. 114. — С. 312-317.
14. Lantukh Yu.D., Ketsle G.A. et al. Holographic investigation of DNA activated by organic dyes // Proc. SPIE. 2004. V. 5447. P. 375-380
15. Lantukh Yu.D., Paschkevich S.N., et al Investigation of DNA - acridine orange biopolymer films by holographic and spectroscopic techniques // Proc. SPIE. 2008. V. 7006. P. 7006141-7006148.
Сведения об авторах
Лантух Юрий Дмитриевич, старший научный сотрудник Института микро- и нанотехнологий Оренбургского государственного университета, доцент кафедры биофизики и физики конденсированного состояния физического факультета Оренбургского государственного университета,
кандидат физико-математических наук, доцент. E-mail: lantukh@yandex.ru Пашкевич Сергей Николаевич, директор Института микро- и нанотехнологий Оренбургского государственного университета, доцент кафедры биофизики и физики конденсированного состояния физического факультета Оренбургского государственного университета, кандидат физико-математических наук, доцент. E-mail: ppsnya@yandex.ru Алиджанов Эскендер Куртаметович, старший научный сотрудник Института микро- и нанотехнологий Оренбургского государственного университета, доцент кафедры биофизики и физики конденсированного состояния физического факультета Оренбургского государственного университета, кандидат физико-математических наук. E-mail: ekaalid@yandex.ru
460018, г. Оренбург, пр-т Победы, 13
