CC BY
85
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2010 Биология Вып. 1 (1)
УДК 579.22+579.253.2
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ УСТОЙЧИВЫХ К ВАНКОМИЦИНУ ШТАММОВ КОАГУЛАЗОНЕГАТИВНЫХ СТАФИЛОКОККОВ
Л. И. Кононова, В. П. Коробов
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614990, Пермь, ул. Голева, 13; e-mail: info@iegm.ru
Селекционированные в лаборатории и клинические изоляты коагулазонегативных стафилококков, устойчивые к гликопептидному антибиотику ванкомицину, имеют ряд отличительных физиологических особенностей по сравнению с бактериями чувствительного к ванкомицину коллекционного штамма Staphylococcus epidermidis 33. Все Vanr-штаммы обладают не только высокой степенью устойчивости с ванкомицину, но и характеризуются множественной устойчивостью к другим антибиотикам, а также ослабленной чувствительностью к антибактериальному пептиду варнерину, снижением уровня гидрофобности поверхности клеточных стенок, замедленным ростом и слабой способностью к накоплению биомассы.
Ключевые слова: коагулазонегативные стафилококки, Staphylococcus epidermidis, антибиотикоустойчивость,
ванкомицин, низкомолекулярные катионные пептиды, варнерин, гидрофобность
Введение
Появление в 80-х гг. прошлого столетия резистентности бактерий родов Enterococcus и Staphylococcus к гликопептидным антибиотикам ванкомици-ну и тейкопланину быстро нашло биохимическое и генетическое объяснение благодаря интенсивному изучению ванкомицин-резистентных штаммов энтерококков (Al-Obeid et al., 1990) и S. aureus (Lyon et al., 1987). Однако, несмотря на неуклонный рост резистентных штаммов, гликопептидные антибиотики во всех странах мира в настоящее время остаются препаратами выбора при инфекциях, обусловленных метициллин-резистентными штаммами S. aureus (MRSA) и S. epidermidis (MRSE), а также устойчивыми к ампициллину и аминогликозидам штаммами энтерококков (Huycke et al., 1998; Зайцев, 2003).
Существенным событием последнего времени является появление и значительное увеличение гетерорезистентности к гликопептидам среди мети-циллин-устойчивых коагулазонегативных стафи-локков (КНС), механизмы которой до сих пор не раскрыты (Sieradzki et al., 1999). Это определяет необходимость дополнительных исследований природы такой устойчивости КНС и поиска путей ее преодоления.
Типы устойчивости к гликопептидам, обнаруженные среди различных видов энтерококков, обусловлены генами резистентности, которые расположены на мобильных генетических элементах и способны к переносу не только в чувствительные реципиенты этого рода, но и в другие грамположи-тельные бактерии (Arthur et al., 1993). При этом ус-
тановлено, что для штаммов S. aureus со сниженной чувствительностью или устойчивостью к ванкоми-цину (Van) характерно существенное утолщение клеточной стенки и избыточная продукция новых мишеней действия гликопептидов, локализованных вдали от истинных мишеней на плазматической мембране (Hanaki et al., 1998; Cui et al., 2003).
Механизмы устойчивости КНС к гликопептидам полностью не раскрыты (Biavasco et al., 2000). Показано, что устойчивые к Van КНС отличаются по некоторым свойствам (появлению множественной устойчивости к антибактериальным препаратам, изменению способности поглощать ванкомицин из среды культивирования) от чувствительных бактерий. Более того, гетерогенная природа устойчивости КНС к Van является характерной особенностью этой группы микроорганизмов (Biavasco et al., 2000).
Целью работы было изучение физиологических характеристик устойчивых к ванкомицину штаммов КНС и сравнение их со свойствами чувствительного к Van штамма S. epidermidis 33.
Материалы и методы
В работе исследовали коллекционный штамм S. epidermidis 33, полученный в ГНИИСКМБП им. Тарасевича, и его Van'-производные, селекционированные в лаборатории культивированием на средах с возрастающими концентрациями антибиотика, а также клинические Van'-штаммы КНС, выявленные посевом на агаризованные среды с градиентом концентрации этого антибиотика (Hanaki et al., 2001).
Выращивание бактерий проводили в питатель-
© Л. И. Кононова, В. П. Коробов, 2010
ной среде LB (Миллер, 1976) на орбитальном шейкере Certomat (Sartorius, Германия) при 150 об/мин и температуре 37°C. За динамикой роста следили по изменению оптической плотности бактериальных культур при 600 нм на спектрофотометре PD-303 (APEL, Япония). МПК ванкомицина всех изучаемых штаммов определяли методом двукратных серийных разведений в 96-луночных иммунологических планшетах. В лунки, содержащие питательную среду LB, вносили бактерии логарифмической фазы роста в конечной концентрации 105 КОЕ/мл.
Определение чувствительности бактерий к низкомолекулярному пептиду варнерину проводили, как представлено ранее (Korobov et al., 2003). Чувствительность к антибиотикам выявляли методом диффузии с дисков (Скала и др. 2004). Степень гидрофобности поверхности бактериальных клеток определяли с помощью BATH-теста в двухфазной системе с гексадеканом (Rosenberg et al., 1980). Способность штаммов к образованию биопленок изучали в плоскодонных полистироло-вых планшетах при культивировании на среде LB при 37°C без перемешивания в течение двух суток.
После окончания культивирования и двухкратного промывания биопленок физиологическим раствором проводили их окрашивание 0.1% раствором генцианвиолета. Количество связавшегося красителя определяли после экстракции пленок этанолом и измерения оптической плотности спиртовых экстрактов на планшетном спектрофотометре Benchmark Plus (Bio-Rad, США) при 570 нм (Christensen et al., 1985).
Результаты и их обсуждение
Результаты исследований представлены в табл. 1, 2. Обнаружено, что полученные в лаборатории под прессом возрастающих концентраций антибиотика Vanr-производные штамма S. epidermidis 33 и клинические Vanr-изоляты стафилококков обладали высоким уровнем устойчивости к Van (МПК от 250 до 1000 мкг/мл). Устойчивость всех изученных Van'-штаммов к варнерину была приблизительно одинакова. МПК варнерина для них составляла >125 мкг/мл, что значительно превышало МПК варнерина родительского штамма S. epidermidis 33, равную 0.25 мкг/мл.
Таблица 1
Характеристика гидрофобности и чувствительности к ванкомицину и варнерину использованных в работе штаммов
Штаммы МПК ванкомицина, мкг/мл МПК варнерина, мкг/мл Г идрофобность клеточной поверхности, %
S. epidermidis 33 1.1 0.25 34 - 55
S. epidermidis 33 Vanr (16)* > 400.0 > 125.0 7 - 14
S. epidermidis 33 Vanr2(i2)* > 500.0 > 125.0 7 - 26
S. epidermidis 33 Vanr3(i2)* > 1000.0 > 125.0 22 - 26
КНС клинический 337 Vanr > 250.0 > 62.5 5 - 15
КНС клинический 713 Vanr > 250.0 > 62.5 4 - 9
КНС клинический 699 Vanr > 250.0 > 62.5 6 - 12
(12)*, (16)* - число пассажей на средах с возрастающей концентрацией ванкомицина.
Чувствительность исследованных штаммов стафилококков к антибиотикам
Таблица 2
Антибиотики
Бен Ген Цеф Тет Лин Окс Риф Эр Фуз Лев Ван Цип
S. epidermidis 33 Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч
S. epidermidis 33 Vanr (16)* У Ч Ч П У У П Ч У Ч У Ч
S. epidermidis 33 Van1"2 (12)* У Ч Ч П У У П Ч У Ч У Ч
S. epidermidis 33 Vanr3a2)* У Ч Ч П У У П Ч У Ч У Ч
КНС клинический 337 Vanr У Ч Ч Ч У У Ч Ч Ч Ч У Ч
КНС клинический 713 Vanr У Ч Ч Ч У У Ч Ч Ч Ч У Ч
КНС клинический 699 Vanr У Ч Ч Ч У У Ч Ч Ч Ч У Ч
Степень устойчивости к антибиотикам: У - устойчивый, П - промежуточный, Ч -ки: Бен - бензилпенициллин, Ген - гентамицин, Цеф - цефалексин, Тет - тетрациклин, сациллин, Риф - рифампицин, Эр - эритромицин, Фуз - фузидин, Лев - левомицетин, профлоксацин.
чувствительный. Антибиоти-Лин - линкомицин, Окс - ок-Ван - ванкомицин, Цип - ци-
Физиологические особенности устойчивых к ванкомицину штаммов
43
Как видно из табл. 1, для всех Vatf-штаммов было характерно значительное снижение гидро-фобности клеточной поверхности. Возможно, это играет существенную роль в снижении чувствительности Vatf-штаммов к варнерину за счет ослабления гидрофобных взаимодействий молекул пептида с поверхностными структурами бактериальных клеток. Интересно отметить, что рост всех Van'-штаммов подавлялся концентрациями NaCl (10-15%), при которых чувствительный штамм S. epidermidis 33 обладал способностью к обильному росту.
Исследования показали, что образование Vanr-фенотипа стафилококков сопровождалось приобретением устойчивости и к ряду других антибиотиков (табл. 2). При этом клинические штаммы, по данным первых экспериментов, обладали одинаковыми плазмидными спектрами.
Сравнительный анализ динамики роста на среде LB стафилококков, различающихся по чувствительности к Van, показал, что характерной особенностью всех клинических и лабораторных Van'-штаммов стафилококков является значительное увеличение времени генерации и меньшее накопление биомассы по сравнению с исходными штаммами (рис. 1, 2). Особенно важно отметить, что приобретение устойчивости к Van не вызывало каких-либо значительных изменений в способности штаммов к образованию биопленок. На рис. 3 приведены результаты двух независимых исследований биопленок, образованных на вторые сутки культивирования штаммов.
КОЕ OD600
(кл/мл) 1 1КОЕ (кл/мл)
OD5
4
Рис. 1. Динамика роста культуры S. epidermidis 33 І ІЕІОЕ (кл/мл)
ЕІОЕ (кл/мл) х108
OD6
0,2
0,1
ІІІІІІІ
1 2 3 4 5 6 7
штаммы
Рис. 3. Способность изученных штаммов стафилококков к образованию биопленок:
1 - S. epidermidis 33, 2 - S. epidermidis 33Vanr (16), 3 -S. epidermidis 33 Vanr2 (12), 4 - S. epidermidis 33 Vanr3(12), 5 - ХНС клинический 337 Vanr, 6 - ХНС клинический 713 Vanr, 7 - ХНС клинический 699 Vanr
Таким образом, развитие устойчивости к Van сопровождается выраженными изменениями некоторых важных физиологических характеристик коагулазонегативных стафилококков. Обнаруженная взаимосвязь резистентности стафилококков к ванкомицину с изменением чувствительности к антибактериальному пептиду варнерину требует дальнейшего изучения для выяснения механизмов формирования защиты Van-устойчивых бактерий от катионных антибактериальных пептидов.
Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований и Министерства промышленности, инноваций и науки Пермского края № 10-04-96086-р_урал_а, Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Междисциплинарного проекта фундаментальных исследований, выполняемых в учреждениях УрО РАН.
Рис. 2. Динамика роста культуры S. epidermidis 33 Vanr(16)
Библиографический список
Зайцев, А.А. Стафилококки и ванкомицин: тенденции противостояния / А.А. Зайцев, О.И. Карпов, С.В. Сидоренко // Антибиотики и химиотерапия. 2003. Т. 48, № 6. С. 20-26.
Миллер, Д. Эксперименты в молекулярной генетике / Д. Миллер. М.: Мир, 1976. 394 с.
Скала, Л.З. Практические аспекты современной клинической микробиологии / Л.З. Скала, С.В. Сидоренко, А.Г. Нехорошева, И.Н. Лукин, С.А. Грудинина. М.: ООО Изд-во Триада. 2004. 312 с.
Arthur, M. Genetics and mechanisms of glycopeptide resistance in enterococci / M. Arthur, P Courvalin // Antimicrob. Agents Chemother. 1993. Vol. 37, № 8. P. 1563-1571.
Biavasco, F. Glycopeptide resistance in coagulase-negative staphylococci / F. Biavasco, C. Vignaroli, P.E. Varaldo // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.
2000. Vol. 19, № 6. P. 403-417.
0
Christensen, G.D. Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices // G.D. Christensen, W.A. Simpson, J.J. Younger [et al.] // J. Clin. Microbiol. 1985. Vol. 22, № 6. P. 996-1006.
Cui, L. Cell wall thickening is common feature of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus / L. Cui, X. Ma, K. Sato [et al.] // J. Clin. Microbiol. 2003. Vol. 41, № 1. P. 5-14.
Hanaki, H. Activated cell-wall synthesis is associated with vancomycin resistance in methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical strains Mu3 and Mu50 / H. Hanaki, K. Kuwahara-Arai, S. Boyle-Vavra [et al.] // J. Antimicrob. Chemother. 1998. Vol. 42, № 2. P. 199-209.
Hanaki, H. Detection methods of glycopeptide-resistant Staphylococcus aureus / H. Hanaki, K. Hiramatsu // Antibiotic resistance. Humana Press,
2001. Vol. 48. P. 85-91.
Huycke, M. M. Multiple-drug resistant Enterococci: The nature of the problem and an agenda for the future / M. M. Huycke, D.F. Sahm, M.S. Gilmore // Emerg. Infect. Dis. 1998. Vol. 4, № 2. P. 239-249.
Korobov, V.P. Production of a wide-spectrum antibacterial factor by Staphylococcus warneri cells / V.P. Korobov, L.M. Lemkina, T.V. Polyudova // Docl. Biol. Sci. 2003. Vol. 390, № 5. P. 286-288.
Lyon, B.R. Antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus: genetic basis / B.R. Lyon, R. Skurray // Microbiol. Rev. 1987. Vol. 51, № 1. P. 88-134.
Al-Obeid, S. Mechanism of Resistance to Vancomycin in Enterococcus faecium D366 and Enterococcus faecalis A256 / S. Al-Obeid, E. Collatz, L. Gut-mann // Antimicrob. Agents Chemother. 1990. Vol. 34, № 2. P. 252-256.
Rosenberg, M. Adherence of bacteria to hydrocarbons: a simple method for measuring cell-surface hydro-phobicity / M. Rosenberg, D. Gutnick, E. Rosenberg // FEMS Microbiol. Lett. 1980. Vol. 9, № 1. P. 29-33.
Sieradzki, K. Heterogeneously vancomycin-resistant Staphylococcus epidermidis strain causing recurrent peritonitis in a dialysis patient during vancomycin therapy / K. Sieradzki, R.R. Roberts, D. Se-rur [et al.] // J. Clin. Microbiol. 1999. Vol. 37, № 1. P. 39-44.
Поступила в редакцию 31.03.2010
Physiological peculiarities of vancomycin-resistant strains of coagulase-negative
staphylococci
L. I. Kononova, engineer
V. P, Korobov, candidate of medicine, head of laboratory
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str,, Perm, Russia, 614081; info@iegm.ru; (342)2446714
In vitro selected and clinical isolates of coagulase-negative staphylococci being resistant to glycopeptide antibiotic vancomycin were examined. Those were found to possess a number of distinctive physiological properties as compared to the bacterial vancomycin-sensitive collection strain Staphylococcus epidermidis 33. It was observed that all of the Vanr-strains had not just the high extent of vancomycin resistance, but were also characterized by multiple resistances to other antibiotics, as well as weakened sensitivity to the antibacterial peptide war-nerin, decrease in the level of surface hydrophobicity of cell wall surfaces, delayed growth, and poor ability of biomass accumulation.
Key words: coagulase-negative staphylococci; Staphylococcus epidermidis; antibiotic resistance; vancomycin; low molecular weight cationic peptides; wamerin; hydrophobicity.
Кононова Людмила Ивановна, инженер
Коробов Владимир Павлович, кандидат медицинских наук, зав. лабораторией ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
