CC BY
10
УДК 575.174.015.3:582.599
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОТНОШЕНИЯ У ВИДОВ FAGOPYRUM, ОСНОВАННЫЕ НА ДАННЫХ АНАЛИЗА b/c ИНТРОНА ГЕНА NAD1
Г.Д. Кадырова12, Н.Н. Рыжова1, Е.З. Кочиева1
(1Центр "Биоинженерия" РАН, г.Москва, 2 Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, г. Казань; e-mail: guzel_asd@rambler.ru)
Впервые был охарактеризован b/c интрон гена nadl 13 видов Fagopyrum и показана возможность использования интрона гена nadl для идентификации видов гречихи. Размеры b/c интрона гена nadl варьировали от 1217 п.н. (F. tataricum, F. cymosum) до 1239 п.н. (F. capil-latum). Были определены видоспецифичные SNPs и индели. Полученная филогения рода совпала с основанной на морфологических признаках. NJ и MP дендрограммы выявили четкое разделение анализируемых видов на две основные группы: cymosum и urophyllum. Группа видов urophyllum характеризовалась присутствием нескольких синапоморфных замен и инделей, включая 11-нуклеотидную вставку, фланкированную прямыми повторами.
Ключевые слова: гречиха, полиморфизм, митохондриальный геном, эволюция.
Гречиха (род Fagopyrum Mill, сем. Polygonaceae) — одна из ценнейших крупяных культур. Согласно последним данным, принято выделять 16 видов Fa-gopyrum, которые подразделяются на две главные филогенетические группы: cymosum и urophyllum. Группа cymosum характеризуется крупными плодами и включает два культурных (F. esculentum Mo-ench, F. tataricum Gaertn) и два диких вида (F. homo-tropicum Ohnishi, F. cymosum Meissn) гречихи. Вторая группа, или группа urophyllum, с мелкими плодами, включает вид F. urophyllum (Bur. et Franch) Gross и 11 оставшихся диких видов [1]. Из 16 видов гречихи, культивируется два вида — посевная (F. esculen-tum) и татарская (F. tataricum) [2]. Однако состав и филогенетические отношения рода Fagopyrum окончательно не определены, что связано еще и с тем, что с 1990 по 2002 г. было обнаружено более 10 новых видов и подвидов [3].
В настоящее время для решения таксономических и филогенетических вопросов у рода Fagopyrum широко используются методы как мульти-локусного анализа, так и исследования отдельных участков ядерного и хлоропластного геномов [4]. Однако до настоящего момента не было данных о митохондриальном геноме гречихи.
Второй (b/c) интрон гена nadl митохондриаль-ной ДНК (мтДНК) считается наиболее полиморфным и используется для филогенетических исследований у растений [5].
Целью данной работы стал анализ степени вариабельности интрона b/c гена nadl (мтДНК) у Fagopyrum: характеристика нуклеотидной последовательности этого интрона у представителей различных видов и оценка возможности его использования для решения таксономических проблем и выявления филогенетических отношений в роде Fagopyrum.
Материалы и методы
Для молекулярного анализа генома из коллекций ГНУ ГНЦ РФ ВИР и ГНУ ТагНИИСХ были подобраны 23 образца 13 видов рода Fagopyrum различного географического происхождения.
ДНК выделяли по стандартной методике [6]. Для амплификации b/c интрона гена nadl мтДНК последовательности праймеров были взяты из статьи Demesure et al. [7]. Все амплифицированные фрагменты секвенировали с использованием ABI 310 cap-pilary DNA Analyzer (Центр "Биоинженерия" РАН).
Последовательности выравнивали и анализировали с помощью программы MEGA 3.0. Филогенетические деревья строили методами объединения соседей (Neighbor-Joining, NJ) и максимальной экономии (Maximum Parsimony, MP) в программе PAUP 4.0b10. Устойчивость филогенетических деревьев в NJ и MP анализах оценивали методом бут-стрепа, используя 1000 реплик.
Результаты и обсуждение
Размеры b/c интрона гена nadl варьировали от 1217 п.н. у представителей видов F. tataricum, F. cymosum и F. giganteum до 1239 п.н. у представителей вида F. capillatum. Общая длина выравненной последовательности составила 1244 п.н.
Анализ b/c интрона nadl мтДНК гречихи показал, что данный участок достаточно вариабелен и по присутствию нуклеотидных замен все виды гречихи могут быть легко различимы и, следовательно, b/c интрон гена nadl может быть использован для идентификации видов Fagopyrum. При этом выявленные точковые нуклеотидные замены (SNP) и индели позволили определить генетически родственные группы видов. Так, например, были выяв-
MP-дендрограмма, построенная по последовательностям нитрона nad1 митохондриального генома Fagopyrum (CI = 0,963;
RI = 0,975). Указаны значения бутстреп-поддержки > 50%
лены нуклеотидные замены, специфичные для филогенетических групп cymosum и urophyllum. Группа cymosum (F. cymosum, F. tataricum, F. giganteum, F. es-culentum и F. homotropicum) характеризовалась присутствием замен C378 и A743 (от начала интрона), тогда как для группы urophyllum (F. gracilipes, F. capillatum, F. rubifolium, F. callianthum, F. macrocarpum, F. lepto-podum, F. lineare, F. urophyllum) в этих же позициях были нуклеотидные замены A378 и T743. Для F. escu-lentum и F. homotropicum детектированы замены, специфичные лишь для этих двух видов (A137, G570).
Несмотря на небольшое число видоспецифич-ных замен, последовательность интрона оказалась весьма интересной. Так, было показано, что при относительной консервативности 5'- и 3'- концов ин-трона последовательности его центральной части значительно различались прежде всего за счет ви-доспецифичных инделей. Так, все виды группы urophyllum, взятые в анализ, характеризовались наличием 11-нуклеотидной GA-богатой синапоморф-ной вставки в позиции 343 от начала интрона, фланкированной прямыми GAGG-повторами. Также хотелось бы отметить последовательность AGAAA в позиции 949. У всех видов группы cymosum данный пентануклеотид присутствовал в последовательности один раз. У всех анализируемых видов группы urophyllum последовательность AGAAA была повторена тандемно, кроме вида F. capillatum, у которого этот пентануклеотид повторялся трижды.
Помимо инсерций, которые были описаны выше, для некоторых видов рода Fagopyrum были выявлены специфичные делеции. Так, виды F. tataricum, F. cymosum и F. giganteum характеризовались деле-цией 6-нуклеотидной последовательности TTGAAC в позиции 707, тогда как у всех остальных анализируемых видов групп cymosum и urophyllum данная последовательность присутствовала. Кроме этого в положении 632 была обнаружена делеция 10-нук-леотидной последовательности (TCTAGAGAGG), специфичная для вида F. lineare.
Дендрограммы (NJ и МР), построенные на основе полученных результатов, показали четкое разделение анализируемых видов на две группы (рисунок). Один кластер объединил все виды, относящиеся к группе cymosum, другой кластер образовали виды группы urophyllum. Анализ b/c интрона гена nad1 мтДНК на обеих дендрограммах выявил четкую дифференциацию группы cymosum на два субкластера, поддерживаемых высокими значениями бутстрепа (99 и 77%). Первый субкластер объединил виды F. esculentum и F. homotropicum, а второй — F. tataricum, F. cymosum и F. giganteum. Аналогичное деление видов группы cymosum было показано ранее при исследовании полиморфизма rbcL-accD спейсе-ра хпДНК и ITS-района ядерной ДНК [4]. В то же время группа urophyllum не разделилась на субкластеры, которые были выявлены при анализе хлоро-пластного генома [8].
Проведенный анализ b/c интрона гена nad1 мтДНК не подтвердил гипотезу о происхождении вида F. esculentum от F. cymosum и совпал с результатом анализа хлоропластного генома, предлагающим F. homotropicum в качестве одного из предков гречихи посевной [2].
Таким образом, в данной работе впервые проведен анализ полиморфизма участка митохондриального генома гречихи. Для всех анализируемых видов выявлены специфичные замены и индели и, следовательно, показана возможность использования интрона гена nad1 для идентификации видов Fagopyrum и выявления филогенетических отношений представителей рода. Полученная филогения рода в целом совпала с основанной на морфологических признаках. Также показано совпадение эволюционной направленности хлоропластного и мито-хондриального геномов, что выражается в выделении
группы видов cymosum и urophyllum.
* * *
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 10-04-01564-а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Yamane K., Yasui Y., Ohnishi O. Intraspecific cpDNA gopyrum cymosum (Polygonaceae) // Am. J. Bot. 2003. Vol. 90. variation of diploid and tetraploid perennial buckwheat, Fa- P. 339—346.
19 ВМУ, биология, № 4
2. Campbell C.G. Buckwheat. Fagopyrum esculentum Mo-ench // International Plant Genetic Resources Institute. Rome, Italy, 1997. 95 p.
3. Ohsako T, Yamane K, Ohnishi O. Two new Fagopyrum (Polygonaceae) species F.gracilipedoides and F.jinshaense from Yunnan, China // Genes and Genet. Syst. 2002. N 77. P. 399-408.
4. Yasui Y, Ohnishi O. Interspecific relationships in Fagopyrum (Polygonaceae) revealed by the nucleotide sequences of the rbcL and accD genes and their intergenic region // Am. J. Bot. 1998a. Vol. 85. P. 1134-1142.
5. Cameron K.M. On the value of nuclear and mitochon-drial gene sequences for reconstructing the phylogeny of va-
nilloid orchids (Vanilloideae, Orchidaceae) // Ann. Bot. 2009. Vol. 104(3). P. 377-385.
6. Edwards K, Johnstone C, Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis // Nucl. Acids Res. 1991. Vol. 19(6). Р. 1349.
7. Demesure B., Sodzi N, Petit R.J. A set of universal primers for amplication of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants // Molec. Ecol. 1995. Vol.4. P. 129-131.
8. Sharma T.R., Jana S. Species relationships in Fagopyrum revealed by PCR-based DNA fingerprinting // Theor. Appl. Genet. 2002. Vol. 105. P. 306-312.
Поступила в редакцию 04.04.2010
PHYLOGENETIC RELATIONSHIPS IN FAGOPYRUM SPECIES BASED
ON NUCLEOTIDE POLYMORPHISM OF b/c INTRON OF NAD1 GENE
G.D. Kadyrova, N.N. Ryzhova, E.Z. Kochieva
The sequence analysis of b/c intron of nadl mitochondrial gene in 13 Fagopyrum species was carried out and demonstrated ability of this intron to use in phylogenetic studies. The length of the mitochondrial nadl b/c intron varied from 1217 bp in F. tataricum, F. cymosum, F. giganteum to 1239 bp in F. capillatum. Species- and accession- specific SNPs and indels were detected. For obtained molecular phylogeny of Fagopyrum species a good agreement with the recognized taxo-nomic divisions within the genus was observed. NJ and MP trees showed a clear clustering into two major genetic groups: cymosum and urophyllum. The urophyllum group was characterized by the presence of several synapomorphic characters including 11 bp insert flanked by directrepeats.
Key words: buckwheat, polymorphism, mitochondrial genome, evolution.
Сведения об авторах
Кадырова Гузель Дамировна — науч. сотр., ГНУ Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, 420059, Казань, Оренбургский тракт, 48. E-mail: guzel_asd@ rambler.ru
Рыжова Наталья Николаевна — науч. сотр. Центра "Биоинженерия" РАН, 117312, Москва, ул. 60-летия Октября, д. 7, корп. 1. E-mail: rynatalia@yandex.ru
Кочиева Елена Зауровна — вед. науч. сотр. Центра "Биоинженерия" РАН, 117312, Москва, ул. 60-летия Октября, д. 7, корп. 1. E-mail: ekochieva@yandex.ru
