CC BY
158
Химия растительного сырья. 2007. №3. С. 69-76.
УДК 547.9:582.284.5
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ПОРОШКОВЫХ ЦЕЛЛЮЛОЗ, ПОЛУЧЕННЫХ РАЗЛИЧНЫМИ МЕТОДАМИ
© М.А. Торлопов1, Д.В. Тарабукин2, С.В. Фролова1, Т.П. Щербакова1, В.В. Володин2
1 Институт химии Коми научного центра Уральского отделения РАН, ул. Первомайская, 48, Сыктывкар (Россия)
2Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, ул. Коммунистическая, 28, Сыктывкар (Россия) E-mail: mator1opow@mail.ru
Гидролизом хлопковой, лиственной целлюлозы и волокон льна в среде неорганических и органических кислот, а также воздействием кислот Льюиса на целлюлозу получены порошковые целлюлозы, существенно отличающиеся по степени полимеризации и упорядоченности структуры от исходного сырья. Установлено, что наибольшие изменения в структуре претерпевают порошковые целлюлозы, полученные с применением кислот Льюиса, Показано влияние надмолекулярной структуры порошковых целлюлоз на их реакционную способность к ферментативному гидролизу,
Введение
Энзиматические методы применяются в химии углеводов для изучения строения природных и модифицированных полисахаридов [1], направленного синтеза полисахаридных фрагментов [2]. В литературе описаны многочисленные методы ферментного гидролиза целлюлозы и целлюлозосодержащего сырья. Большинство работ в этой области посвящено гидролизу целлюлозы до низкомолекулярных продуктов (глюкозы, целлобиозы) [3]. Между тем представляет интерес направленная деструкция целлюлозы и продуктов ее структурной и химической модификации до фрагментов с заданной молекулярной массой. Полученные таким образом материалы могут быть использованы в нанотехнологиях и биохимических исследованиях [4], Для направленной деструкции целлюлозы перспективно совмещение химических и биохимических методов, На первом этапе такого комплексного подхода удобно сначала получать порошковую целлюлозу (ПЦ) путем химического воздействия на волокнистое сырье, а затем целенаправленно осуществлять ферментативную деструкцию этого материала. Основным методом получения ПЦ в настоящее время является гидролитическая деструкция волокнистой целлюлозы. Высокое деструктирующее действие на макромолекулу целлюлозы оказывают также кислоты Льюиса [5, 6].
Цель настоящей работы - изучить влияние способа химического воздействия на структуру ПЦ, полученных из различного целлюлозосодержащего сырья, и их последующую реакционную способность к ферментативному гидролизу.
Экспериментальная часть
Аналитические методы
ИК-спектры получены на ИК-Фурье спектрометре MIR-8000 (ORIEL) в таблетках KBr,
Рентгенофазовый анализ (РФА) проведен на рентгеновском дифрактометре ДРОН-3 (начальный угол 5,00 град., шаг измерения 0,05 град., конечный угол 40,00 град.). Индекс кристалличности (IKp) рассчитан по отношению интенсивностей рефлекса при углах 22° и 19° при углах дифракции 20 - метод Сегала [7],
Степень полимеризации (СПср) образцов определяли по вязкости растворов в кадоксене на вискозиметре Оствальда с диаметром капилляра 0,82 мм [8],
Автор, с которым следует вести переписку,
Концентрацию восстанавливающих сахаров (ВС) определяли методом Шомоди-Нельсона [9].
Количественное содержание лигнина определяли сернокислотным методом в модификации Комарова [10].
Реактивы и материалы
В работе использовали белёную сульфатную целлюлозу лиственных пород древесины производства ОАО «Сыктывкарский ЛПК» (СПср=520, содержание лигнина - 0,6%); хлопковую микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) производства АО «Полиэкс», Бийск (СПср = 230); льняное волокно (СП>2000, содержание лигнина - 2,0%).
Минеральные соединения в исходном сырье предварительно удаляли обработкой 1 н раствором соляной кислоты, затем отмывали водой до нейтральной реакции и обезвоживали ацетоном. Сушили на воздухе при комнатной температуре.
Промышленный ферментный препарат Целловиридин Г20х (активность по хроматографической бумаге 500±50 ед/г) использовали в виде раствора в 0,1 М ацетатном буфере (рН=4,7).
Для получения ПЦ применяли следующие методы.
Гидролиз целлюлозы, выделенной из древесины лиственных пород, осуществляли в водном растворе пе-роксимоносерной кислоты (1%-ный раствор пероксида водорода в растворе 10%-ной серной кислоты), гидролиз льняного волокна - перуксусной кислотой (10%-ный раствор). Гидролиз проводили при температуре кипения смеси. Затем образцы отделяли на фильтре, промывали до нейтральной реакции дистиллированной водой, инклюдировали ацетоном и сушили на воздухе при комнатной температуре.
Для получения ПЦ каталитической деструкцией с применением кислот Льюиса навеску высушенной при 105 °С целлюлозы помещали в коническую колбу и заливали 100 см3 свежеприготовленного раствора тетрахлорида титана (0,1 и 1,5% масс.) или трёххлористого алюминия в среде тетрахлорметана (0,1% масс.) [11]. Был использован коммерческий ТЮ4 квалификации «ч», который очищали простой перегонкой при атмосферном давлении [11]. А1С13 получали по методике [11]. Препарат перед применением очищали методом возгонки при атмосферном давлении. Обработку целлюлозы проводили при температуре кипения растворителей. По истечении заданного времени реакционную смесь переносили на стеклянный фильтр, отфильтровывали раствор, в целлюлозе отмывали остатки катализатора тем же растворителем, инклюдировали этанолом и высушивали.
Ферментативный гидролиз ПЦ проводили на водяной качалке в герметично закрытых бюксах при 55 °С и 150 об/мин. Масса образца - 50 мг, объем реакционной смеси - 2 см3. Концентрация ферментного препарата 0,25 мг/см3. Отбор проб осуществляли через 3, 6, 15, 24, 48 ч.
Адсорбцию целлюлаз на ПЦ проводили при 25 °С в течение 30 мин, концентрация субстрата составляла 5 мг/см3. Коэффициент распределения (Кр), адсорбируемый на субстрате, рассчитывали по формуле [9]:
-ж!1 х 100 (дм3/г),
где [Е] - исходная ферментативная активность целлюлаз в растворе, ед/см3; [Ея] - остаточная ферментативная активность целлюлаз в растворе, ед/см3; С - концентрация целлюлозы в суспензии, г/дм3.
Результаты и их обсуждение
Получение и физико-химическая характеристика порошковых целлюлоз
Для получения ПЦ нами использованы методы гидролиза целлюлозы перкислотами и обработка целлюлозы растворами кислот Льюиса в апротонных растворителях. Деструкцией волокнистых форм лиственной целлюлозы и льняного волокна в водных растворах перкислот выделены ПЦ с различными степенью полимеризации и содержанием упорядоченной части (образцы 1, 7, 8, табл. 1). Коммерческий препарат хлопковой МКЦ, согласно ТУ 64-11-124-90, получен гидролизом в присутствии соляной кислоты (образец 5).
ПЦ, выделенные при гидролитической обработке целлюлозосодержащего сырья, характеризуются высокими значениями 1кр (табл. 1). На рентгенограммах образцов ПЦ (рис. 1) присутствует область интенсивного рассеяния в области 22° при углах 20. Максимальное содержание упорядоченной части (1кр=0,88) характерно для образца 5, минимальное - для образца 1 (1кр=0,72).
Рис. 1. Рентгенограмма образцов ПЦ: а - образец 5 (хлопковая МКЦ); б - образец 1 (лиственная ПЦ); в - образец 3 (лиственная ПЦ)
Таблица 1. Условия получения и свойства ПЦ
Образец Исходное сырье СПср исходного субстрата Условия обработки СПср после обработки 1кр (ИКС) 1кр (РФА)
1 Лиственная целлюлоза 520 Н2Б04-Н202, 120 мин 240 0,72 0,70
2 Лиственная целлюлоза 520 0,1% Т1С14 в СС14, 10 мин 180 0,54
3 Лиственная целлюлоза 520 1,5% Т1С14 в СС14, 60 мин 2б0 0,12 0,15
4 Лиственная целлюлоза 520 0,1% А1С13 в СС14, 60 мин 210 0,00 0,00
5а Хлопковая целлюлоза НС1 230 0,86 0,88
б6 Льняное волокно =10000 Н202, 120 мин >2000 0,63
76 Льняное волокно =10000 СН3С00Н-Н202, 120 мин 330 0,74 0,84
86 Льняное волокно =10000 СН3С00Н-Н202, 240 мин 300 0,82
а - коммерческий образец; б - значения СПср приведены согласно литературным данным [12 .
Степень полимеризации ПЦ (табл. 1), полученных гидролитическими методами из разных видов сырья, варьирует от 230 (образец 1) до 330 (образец 7). При этом все ПЦ представляют собой белые или светложелтые (образцы 7, 8) порошки.
Для изучения реакционной способности к ферментативному гидролизу нами впервые были использованы ПЦ, полученные деструкцией волокнистой целлюлозы кислотами Льюиса: А1С13 и ТЮ4 в четыреххлористом углероде. Следует отметить, что продолжительная обработка лиственной целлюлозы в системе А1С13-СС14 позволяет выделять образцы ПЦ с полностью аморфной структурой (образец 4, табл. 1). После продолжительной обработки лиственной целлюлозы в системе ТЮ4-СС14 с высоким содержанием катализатора (образец 3, табл. 1) в ПЦ сохраняется упорядоченная часть, хотя его надмолекулярная структура характеризуется низким значением 1кр. У образца 2 (табл. 1), полученного в более мягких условиях обработки лиственной целлюлозы в той же системе, содержание упорядоченной части составляет 0,54.
Ферментативная деструкция целлюлозных материалов
Известно, что полноценный комплекс целлюлаз состоит из четырех типов ферментов - эндо-Р-1,4-глюканазы (КФ 3.2.1.4), экзо-Р-1,4-глюканазы, или целлообиогидролазы (КФ 3.2.1.91), экзо-Р-1,4-глюкозидазы (КФ 3.2.1.74), целлобиазы, или Р-глюкозидаза (КФ 3.2.1.21), при этом могут существовать множественные формы данных ферментов, отличающиеся способностью сорбироваться на целлюлозе, что обусловлено наличием (или отсутствием) помимо каталитического домена целлюлозосвязывающего домена (ЦСД) [13]. Слабо-сорбирующиеся эндоглюканазы, лишенные ЦСД, первыми статистически расщепляют связи в аморфных пучках элементарных фибрилл, открывая их для действия содержащих ЦСД, прочно сорбирующихся эндоглюка-наз, образующих концы полимерных молекул в более упорядоченных областях (рис. 2).
По мере накопления восстанавливающих и невосстанавливающих концов в процесс биодеструкции вступают экзоцеллобиогидролазы, последовательно расщепляющие молекулу целлюлозы в упорядоченных областях, образуя растворимые сахара [14]. Следует отметить, что используемый нами ферментный препарат Целловиридин Г20х характеризуется высокой эндоглюканазной и целлобиогидролазной и низкой целло-биазной активностью.
эндоглюконаза
целлобиогидролаза
целлобиоза
СО
экзоглюкозидаза
Рис. 2. Схема ферментативного гидролиза целлюлозы: а - целлюлоза; б - целлоолигосахариды; в - целлобиоза; г - глюкоза
Рис. 3. Накопление ВС в гидролизате, мг/см3 (*10-2). Примечание: нумерация образцов соответствует порядковым номерам, приведенным в таблице 1
Реакционная способность целлюлозных материалов при ферментативном гидролизе может быть оценена по накоплению восстанавливающих сахаров. Зависимость накопления ВС в реакционной смеси в процессе ферментативного гидролиза представлена на рисунке 3.
Так, для образцов 3 и 4 (см. табл. 1) отмечена наиболее значительная скорость накопления ВС в начальный период реакции, однако после 6 ч ферментативной обработки скорость накопления ВС снизилась и далее изменялась незначительно (рис. 2). Вероятно, происходит ингибирование ферментов продуктами реакции. Для проверки этого предположения оставшийся после 15 ч обработки субстрат промывали водой. Затем процедуру ферментативного гидролиза повторяли. При этом значимого накопления ВС не происходило. Следовательно, можно говорить о существенном влиянии структуры ПЦ на замедление гидролиза после первой стадии разрушения доступных областей материала и быстрого накопления ВС.
Как следует из приведённых кинетических зависимостей (рис. 3), для остальных образцов скорость накопления ВС также уменьшается после 6 ч обработки. В целом для образцов с высокими значениями 1кр (образцы 1, 5, 7, 8, табл. 1) накопление ВС наблюдается в меньшей степени.
Известно, что первой стадией ферментативного гидролиза целлюлозы является адсорбция фермента на поверхности субстрата [3], причем существует прямопропорциональная зависимость между адсорбционной способностью фермента и скоростью ферментно-катализируемой реакции. Адсорбционную способность образцов ПЦ по отношению к ферментам оценивали по их коэффициентам распределения (табл. 2). Для ПЦ, полученных кислотным гидролизом (образцы 1, 5, 7, табл. 2), наблюдали высокие показатели адгезии, коррелирующие с их реакционной способностью, оцененной по скорости накопления ВС и по изменению СПср. Образец 8, выделенный (как и образец 7) гидролизом волокон льна перуксусной кислотой, но при более продолжительной обработке, отличался наименьшей сорбционной способностью по отношению к ферментам (рис. 3) и при этом наиболее низкой реакционной способностью. Образцы 3 и 4 (табл. 2) полностью сорбировали ферменты препарата Целловиридин Г20х, что резко выделяет их среди прочих ПЦ. Показатель сорбции ферментов на волокнах льна после обработки перуксусной кислотой сопоставим с аналогичными показателями группы ПЦ, полученных методами кислотного гидролиза.
Таблица 2. Изменение степени полимеризации целлюлозы в образцах ПЦ после ферментативной обработки
Образец Исходное сырье Коэффициент распределения Кр, % СПср в процессе с зерментативной деструкции (время, ч)
0 3 6 15 24 48
1 Лиственная целлюлоза 22 240 170 170 170 1 70 162
2 Лиственная целлюлоза 180 180 180 180 180 140
3 Лиственная целлюлоза 0 260 260 210 180 180 160
4 Лиственная целлюлоза 0 210 190 190 190 190 180
5 Хлопковая целлюлоза 37 230 220 210 210 200 110
6 Льняное волокно 33 > 2000 1290 1300 1280 1280 1240
7 Льняное волокно 13 300 280 280 270 140
8 Льняное волокно 39 330 320 300 300 260
Для образцов 3, 5, 7 и 8 (табл. 2), полученных из различных видов сырья, наблюдали продолжительный период медленного снижения СПср. Незначительное снижение СПср в период обработки от 0 до 3 ч для образцов 5, 7, 8 может быть объяснено быстрым ферментативным гидролизом присутствовавших в образцах более доступных низкомолекулярных фракций, доля которых в них низка. Значительное снижение СПср наблюдалось у образцов с относительно высоким содержанием аморфной части (образцы 1 и 6, табл. 2). Так, для образца волокнистой льняной целлюлозы (образец 6) быстрое снижение СПср отмечается после 3 ч обработки, далее происходит ее незначительное падение.
Следует особо выделить ПЦ, полученные обработкой лиственной целлюлозы кислотами Льюиса. Приведенные результаты расчета 1^ (табл. 1) показывают, что в структуре образцов 3 и 4 преобладает аморфная фаза, значит, следовало ожидать значительных скоростей снижения их СПср [15]. Однако прогнозируемый эффект не наблюдали. Для образца 4 снижение СПср происходит в течение первых 3 ч ферментативной обработки, и в дальнейшем наступает стабилизация СП. Для образца 3 по истечении 3 ч обработки отмечается постепенное снижение СПср. Для образца 2 наблюдается период стабилизации СПср, достигающий 24 ч, после чего зафиксировано снижение СПср.
Изменение молекулярно-массового распределения (ММР) в процессе ферментативной деструкции образца 1 (табл. 1) было изучено методом корреляционно-лазерной спектроскопии (измерения проведены С.Д. Форофонтовой в ЛИЯФ РАН). Оказалось, что на начальном этапе деструкции (0^3 ч) подвергаются лишь низкомолекулярные фракции целлюлозы (^ М„= 4,4^5,4), а высокомолекулярные практически не затрагиваются. Отмечено, что гидролиз этих фракций протекает наиболее полно. Анализ ММР выявил отсутствие каких-либо других нерастворимых продуктов гидролиза. В то же время, по данным жидкостной хроматографии и анализа ВС (рис. 3), начальный этап (0^3 ч) характеризуется быстрым накоплением глюкозы в растворе. При сопоставлении этих данных с данными корреляционно-лазерной спектроскопии обнаружено, что по мере исчерпания низкомолекулярных фракций целлюлозы скорость накопления глюкозы резко уменьшается. Таким образом, можно утверждать, что наибольшей реакционной способностью обладают низкомолекулярные фракции целлюлозы.
Анализ нерастворимых продуктов гидролиза, отобранных в течение последующих суток, показал, что каких-либо видимых изменений ММР целлюлозы не наблюдается. Следовательно, существует длительный (до 24 ч) период существования только высокомолекулярной целлюлозы с узким ММР (^М„= 5,5), как показано на рисунке 46. После 24 ч гидролиза на кривой ММР видны заметные изменения. При этом обнаруживается закономерность: сохранение величины ММР высокомолекулярных фракций и появление нерастворимых олигомерных (^М„= 4,0) продуктов гидролиза (рис. 4в). С увеличением глубины гидролиза происходит их накопление и некоторое смещение по величине молекулярных масс (рис. 4г). По-видимому, высокомолекулярные фракции целлюлозы образуют плотные кристаллические области, труднодоступные для ферментов. Представленные закономерности изменения ММР при ферментативном гидролизе целлюлозы могут иметь значение для получения высокомолекулярных фрагментов целлюлозы с узким ММР.
Изменение надмолекулярной структуры целлюлозы в ходе ферментативного гидролиза оценивали по изменению 1кр, который рассчитывали по рентгенограммам препаратов (рис. 5, 6). Для образцов с преобладанием кристаллической структуры (образцы 1, 5, 7, 8, табл. 2) при продолжительности ферментативного гидролиза до 24 ч наблюдали незначительные изменения 1^. Как правило, происходил небольшой рост содержания упорядоченной части в препаратах (рис. 5, 6). При продолжительности ферментативного гидролиза 48 ч было отмечено снижение содержания в целлюлозе упорядоченной части относительно ее содержания в исходном образце.
|д м„
° \л
W
кДа
3 4 5 6 7 1д MW
Рис. 4. Изменение молекулярно-массового распределения целлюлозы в процессе ферментативного гидролиза по периодам: в начальный момент времени (а), в интервале 2^24 ч (б), в интервале 24^48 ч (в), свыше 48 ч (г)
5 10 15 20 25 30 35
■V0
Рис. 5. Рентгенограмма образца 5 (хлопковая МКЦ) Рис. 6. Рентгенограмма образца 1 (лиственной ПЦ) после 6 ч (а) и 24 ч (б) ферментативного гидролиза после 6 ч (а) и 24 ч (б) ферментативного гидролиза
Ранее нами сделано сообщение о необычном поведении ПЦ, выделенных деструкцией целлюлозы кислотами Льюиса в реакции сульфатирования, и неожиданных свойствах образовавшихся производных [16]. Результаты, представленные в данной работе, согласуются с выводами авторов [17] о процессах «сшивки» и функциональной модификации целлюлозы при ее обработке кислотами Льюиса. В частности, при получе-
нии ПЦ каталитической деструкцией кислотами Льюиса происходит накопление в образцах металла-катализатора, увеличивается содержание карбонильных и карбоксильных групп, появляются кратные угле-род-углеродные связи [17]. Так, в процессе экспериментальной работы по ферментативному гидролизу нами отмечены гидрофобные свойства этих ПЦ. Данные свойства связаны с изменившимся составом функциональных групп ПЦ. Присутствие ненасыщенных связей в образцах ПЦ подтверждено методом Польгара и Юнгникеля [18].
Следствием указанных изменений в структуре и составе ПЦ, полученных каталитической деструкцией кислотами Льюиса, является повышение реакционной способности в ферментативном гидролизе. Обращает на себя внимание активность к ферментному гидролизу образцов 3 и 4 (табл. 1) при более интенсивной каталитической обработке. Данные мы интерпретируем следующим образом: при получении ПЦ каталитической деструкцией кислотами Льюиса происходит значительная модификация исходной целлюлозы. Изменения тем глубже, чем интенсивней обработка кислотой Льюиса [19]. При этом большое влияние оказывают не только концентрация кислоты Льюиса, температура и продолжительность обработки, но и активность этой кислоты [5].
В свою очередь накопленные изменения в структуре целлюлозы влияют на процесс ферментативного гидролиза. Так, разрушение упорядоченных участков и другие процессы, увеличивающие доступность внутренних областей материала, становятся причинами, объясняющими высокие скорости накопления ВС при ферментативном гидролизе этих ПЦ.
Выводы
Таким образом, структура порошковых целлюлоз зависит от способа химического воздействия на исходные целлюлозосодержащие материалы и определяет их реакционную способность к ферментативному гидролизу, степень полимеризации и молекулярно-массовое распределение продуктов деструкции. Представленные закономерности изменения ММР при ферментативном гидролизе целлюлозы могут иметь значение для получения высокомолекулярных фрагментов целлюлозы с узким ММР.
При ферментативном гидролизе ПЦ, полученных деструкцией целлюлозы кислотами Льюиса, наблюдаются быстрое накопление ВС и незначительное падение СПср или длительный период стабилизации, предшествующий снижению СПср.
Кислотный гидролиз волокнистых целлюлоз приводит к получению материалов, менее активно деструк-тирующих при ферментативном воздействии.
Процесс ферментативного гидролиза ПЦ сопровождается накоплением низкомолекулярных продуктов и снижением СПср, изменениями в надмолекулярной структуре и молекулярно-массовом распределении полимеров. Наибольшее влияние на эти процессы оказывает степень кристалличности образца.
Список литературы
1. Thomas M., Chauvelon G. et al. Location of sulfate groups on sulfoacetate derivatives of cellulose // Carbohydrate Research. 2003. V. 338 P. 761-770.
2. Wang Q., Dordick J.S., Linhardt R.J. Synthesisand application of carbohydrate-containing polymers // Chem. Mater. 2002. V. 14. P. 3232-3244.
3. Beguin P., Aubert J.P. The biological degradation of cellulose // FEMS Microbiology Reviews. 1994. V. 13. P. 25-28.
4. Гусев А.И. Нанокристаллические материалы: методы получения и свойства. Екатеринбург, 1998. 198 с.
5. Сарыбаева Р.И., Афанасьев В.А., Заиков Г.Е., Щелохова Л.С. Применение кислот Льюиса в химии углеводов. // Успехи химии. 1977. Т. XLVI. Вып. 8. С. 1395-1410.
6. Sarybaeva R.I., Sultankulova A.S. et al. Physico-chemical and technological properties of powdery celluloses, obtained by the Lewis acids // Cellulose Chem. and Technol. 1991. V. 24. P. 199-210.
7. Целлюлоза и ее производные / Под ред. Н. Байклза и Л. Сегала. М., 1974. 499 с.
8. Болотникова Л.С., Данилов С.Н., Самсонова Т.П. Метод определения вязкости и степени полимеризации целлюлозы // Журнал прикладной химии. 1966. №1. С. 176-180.
9. Синицын А.В., Черноглазов В.М., Гусаков A.B. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов // Биотехнология. (Итоги развития науки и техники АН СССР). М., 1990. Вып. 25. С. 152.
10. Оболенская A.B., Щеголев В.П. и др. Практические работы по химии древесины и целлюлозы. М., 1965. 412 с.
11. Карякин Ю.В., Ангелов И.И. Чистые химические вещества. М., 1974. 408 с.
12. Льноводство. Под ред. A.P. Рогаш. М., 1967. 583 с.
13. Марков A.B. и др. Новый эффективный метод анализа компонентного состава ферментных комплексов Tricho-derma reesei // Биохимия. 2005. T. 70. №6. С. 796-805.
14. Болобова А.В., Аскадский А.А., Кондращенко В.И., Рабинович М.Л. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов: В 2 кн. Кн. II: Ферменты, модели, процессы. М., 2002. 343 с.
15. Синицын А.П., Клесов А.А. Биотехнология ферментативного превращения целлюлозы // Биотехнология (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН). М., 1988. Вып. 12. 156 с.
16. Торлопов М.А., Фролова С.В., Демин В.А. Сульфатирование порошковых материалов полученных деструкцией целлюлозы тетрахлоридом титана // Химия в интересах устойчивого развития. 2007. (В печати).
17. Сарыбаева Р.И., Василькова Т.В., Афанасьев В.А. Реакции целлюлозы в присутствии кислот Льюиса. Реакция деструкции // Изв. АН Киргизской ССР. 1979. №2. С. 42-48.
18. Сиггиа С., Хана Г. Количественный органический анализ по функциональным группам: Пер. с англ. М., 1983. С. 294.
19. Торлопов М.А., Фролова С.В., Демин В.А. Сульфатирование порошковых материалов, полученных деструкцией целлюлозы тетрахлоридом титана // Химия в интересах устойчивого развития. 2007. Т. 15. №4. С. 491-496.
Поступило в редакцию 6 августа 2007 г.
