CC BY
30
растворов до 10 см3 pH 3, перемешивали и давали отстояться 1час. Далее растворы центрифугировали 10 мин при 1500 об./мин, после сливали раствор центрифугата, оставляя образовавшиеся осадки на дне пробирок. Затем осадок растворяли 10-2 М раствором NaOH, всё тщательно перемешивают и через 20 минут оценивают окраску раствора, которая меняется от бледно-розового до насыщенно-фиолетового. Окраска устойчива длительное время (рис. 2).
I
0 0,01 0,015 0,022 0,025 0,03 0,03 0,032 0,035 0,04
Моль/см3 амикацина в пробе
Рис. 2. Колористическая тест-шкала для определения содержания амикацина в водных растворах Результаты определения амикацина в водных растворах методом «введено-найдено» по предлагаемой методике представлены в табл. 2.
Таблица 2 Результаты определения доксиламина и амикацина в водных растворах (n = 6, р = 0,95, tp = 2,57)
Введено, моль/см3 Содержание в пробе, моль/см3 Найдено, x = x + tp ■ s / Vn Содержание в пробе, моль/см3 Найдено, x = x + tp ■ S / *Jn
Доксиламин Амикацин
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
0,05 0,01 0,01±0,001 0,010 0,01±0,001
0,1 0,02 0,02±0,002 0,015 0,015±0,001
0,2 0,05 0,05±0,005 0,022 0,022±0,002
0,3 0,14 0,14±0,010 0,025 0,025±0,002
0,4 0,21 0,21±0,020 0,030 0,03±0,003
0,5 0,26 0,26±0,030 0,030 0,03±0,003
0,6 0,49 0,49±0,050 0,032 0,032±0,003
0,7 0,55 0,55±0,060 0,035 0,035±0,004
0,8 0,69 0,69±0,070 0,040 0,04±0,004
Таким образом, разработаны чувствительные методики определения компонентов, позволяющие определять их содержание в водных растворах, что результаты исследования могут быть внедрены в практику.
Литература
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: ООО «Издат. Новая Волна», 2002. В 2 т. Т. 1. 540 с. 8 с. ил.
2. Шачнева Е.Ю., Алыков Н.М., Арчибасова Д.Е. Адсорбция кадмия из водных растворов на модифицированных сорбентах // Техника и технология пищевых продуктов. - 2012. - № 4. - С. 171-176.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ / BIOLOGICAL SCIENCES
Андреева И.С., 2Пилипенко А.С., 3Пучкова Л. И., 4Емельянова Е.К., ®Репин В. Е.,6Молодин В.И.
1,2,3,4,5кандидат биологических наук федеральное бюджетное учреждение науки Г осударственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», р.п. Кольцово Новосибирской области, Россия; 2кандидат биологических наук, институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия; 5 кандидат биологических наук, институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г., Новосибирск; 6академик, доктор исторических наук, институт археологии и этнографии СО РАН,
Новосибирск, Россия.
ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ГЕНОМНЫЕ ПРИЗНАКИ МИКРООРГАНИЗМОВ, ИЗОЛИРОВАННЫХ ПРИ РАСКОПКАХ МЕРЗЛОТНЫХ КУРГАНОВ ПАЗЫРЫКСКОЙ КУЛЬТУРЫ ОЛОН-КУРИН-ГОЛ
Аннотация
В настоящем сообщении представлены результаты микробиологических исследований мерзлотных могильников Олон-Курин-Гол-6 (курган № 2) и Олон-Курин-Гол-10 (курган № 1), уникальных, погребальных комплексов пазырыкской культуры, открытых в 2006 г. в Монголии на южном склоне Сайлюгемского хребта совместной российско-германско-монгольской экспедицией, возраст которых исчисляется в 2,5 тыс. лет (IV-III век до н.э.) [1]. Оценена численность и разнообразие обнаруженных культивируемых микроорганизмов, продукция ими ряда ферментов, устойчивость к антибиотикам, наличие плазмидных ДНК, патогенные свойства. На основе результатов анализа нуклеотидных последовательностей 16SpРНК и фенотипических признаков определена родовая принадлежность большей части штаммов.
Ключевые слова: погребальные комплексы, Олон-Курин-Гол, микроорганизмы, идентификация
'Andreeva I.S., 2Pilipenko A.S., 3Puchkova L. I., 4Emelyanova E.K., 5Molodin V.I 1,2,3,4,5Ph.D. of biological sciences, Federal State Research Institution State Research Center of Virology and Biotechnology Vector, Koltsovo, Novosibirsk region, Russia; 2Ph.D. of biological sciences, Institute of Cytology and Genetics SB RAS, Novosibirsk, Russia;
5academician, Doctor of historical sciences, Institute of Archaeology and Ethnography SB RAS, Novosibirsk, Russia. PHENOTYPIC AND GENOMIC CHARACTERISTICS OF MICROORGANISMS ISOLATED DURING EXCAVATIONS OF PAZYRYK PERMAFROST BURIALS OF OLON-KURIN-GOL
Abstract
The report presents the results of microbiological investigations of permafrost burials of Olon-Kurin-Gol-6 (tumulus # 2) and Olon-Kurin-Gol-10 (tumulus # 1), unique burial complexes of the Pazyryk Culture discovered in 2006 in Mongolia, on the southern slope of the Sailugem mountain ridge by the joint Russian-German-Mongolian expedition, which are 2500 years old (IV-III century B.C.) [1]. The number and diversity of detected viable microorganisms, their ability to produce some enzymes, antibiotic resistance, the presence of plasmid DNAs and pathogenic properties were evaluated. Based on the results of analysis of 16Sp RNA nucleotide sequences and phenotypic features, the strains most of the genera belonged to were determined.
Keywords: burial complexes, Olon-Kurin-Gol, microorganisms, identification
Комплекс методов, используемый в последнее время при исследовании палеопочв разновозрастных курганов эпох энеолита, бронзы, раннего железа и средневековья (IV тыс. до н.э.-XIV в. н.э.), позволил получить новые представления об истории развития почв и природной среды, оценить их роль в жизни древних обществ [1,2]. Исследование ДНК микроорганизмов из древних останков человека вносит вклад в палеоэпидемиологию [3]. Расшифровка информации, заключенной в достоверном фактическом материале, полученном при исследовании точно датированных археологических объектов, позволяет реконструировать палеоэкологическую обстановку существования человека в конкретном регионе и в определенное время, уточнить роль этих условий в формировании этносов прошлого [4]. В настоящей работе приведены данные по микробиологическому изучению содержимого погребальных камер древних захоронений Олон-Курин-гол.
Материалы и методы
Образцы для исследования. При раскопках курганов Олон-Курин-Гол отобраны образцы мерзлотных субстратов и органических останков из погребальных камер захоронений. Все работы проведены с соблюдением в асептических условий,
64
образцы незамедлительно помещали в стерильные пластиковые контейнеры с герметично завинчивающимися крышками. Описание образцов и места их взятия представлены в таблице 1.
Условия выделения и культивирования микроорганизмов. Образцы 1, 2, 3а, 3б, 3в, 5, 6, 7, представляющие собой талый лед с включениями различной природы, после усреднения образца растиранием в стерильной ступке, высевали по 0,1 мл на чашки с плотной питательной средой. К 1 г необводненных образцов (4, 8, 9) добавляли по 1 мл физиологического раствора, выдерживали смесь на качалке при комнатной температуре в течение 15 мин, затем растирали пробу до однородности в стерильной ступке. На чашки с питательной средой высевали по 0,1 мл полученных суспензий и их десятикратных разведений. Все процедуры по выделению психрофилов выполняли с использованием охлажденных питательных сред, растворов и инструментов.
Таблица 1. Перечень образцов, взятых для микробиологического анализа
№ пробы Образцы для исследования
Памятник: Олон-Курин-гол-6, курган 2.
1 Лед из центральной части сруба, кристаллы льда на частицах грунта и камнях. Глубина 2 м
2 Лед из сруба с вмороженными кусочками древесины. Глубина 2 м.
3а, 3б, 3в Лед из сруба, взят у северной стены. Крупная линза льда с вмороженными кусочками древесины и грунта. Глубина 2.1 м.
4 Останки мягких тканей лошади на глубине 170-180 см.
Памятник: Олон-Курин-гол-10, курган 1
5 Лед из сруба. Поверхность погребального ложа. Глубина 150 см.
6 Лед из сруба. Погребальное ложе. Части крупной линзы льда с вмороженными частицами грунта. Глубина 180 см.
7 Лед из северо-восточного угла сруба. Проба взята из толщи льда (крупная линза) на глубине 5-10
см от поверхности линзы с помощью бура. Глубина 180 см.
8 Останки органических тканей лошади №1 Глубина 120-130 см.
9 Останки органических тканей лошади №2. Глубина 120-130 см.
Для выделения и культивирования микроорганизмов применяли питательные среды: рыбно-пептонный агар (РПА, ФГУП НПО «Микроген», МЗ РФ); жидкую и агаризованную среду LB (“Difco”, США); крахмало-аммиачный агар [5], среду LB, разведенную дистиллированной водой в 5-10 раз. Высевы инкубировали при температурах 4, 20, 30, 37, 45 и 60°С. Выросшие колонии в течение 1-4 недель, отличающиеся морфологически, использовали для получения чистых культур.
Изучение морфологических свойств микроорганизмов Клетки микроорганизмов исследовали методом фазово-контрастной микроскопии с помощью микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия). Окраску клеток по Граму определяли методом [6], способность к образованию эндоспор - на РПА с добавлением MnSO4x Н2О в концентрации 0,005 г/л среды.
Физиологические и биохимические признаки, косвенные тесты на патогенность микробных изолятов выполняли в соответствии с [7]. Чувствительность к антибиотикам определяли с помощью аппликации дисков производства НИЦФ (Санкт-Петербург, Россия) на поверхность питательного агара, засеянного испытуемым микроорганизмом.
Наличие эндонуклеаз рестрикции в микроорганизмах определяли при скрининге отдельных колоний штаммов используя в качестве субстратов для гидролиза ДНК фагов Хс1857 и Т7. Электрофорез ДНК после рестрикции проводили в 1%-ной агарозе фирмы “Sigma”(COA). В работе применены ферменты и субстратные ДНК производства фирмы СибЭнзим (г. Новосибирск). Содержание плазмидной ДНК в штаммах определяли методом скрининга по стандартной методике [8]. Выделение суммарной ДНК из чистых культур проводили путем лизиса клеток 5M гуанидинтиоционатным буфером (pH 11.0) при 65°С с последующей экстракцией сначала смесью фенола и хлороформа (1:1), а затем хлороформом. Осаждение ДНК из водной фазы осуществляли изопропиловым спиртом в присутствии 1М NaCl. Образцы ДНК хранили при температуре минус 20°С. ПЦР проводили с универсальными праймерами, соответствующими гену 16S рРНК эубактерий: 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ и 5'-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3'. ПЦР проводили в режиме: 95°С - 3 мин (1 цикл); 95°С - 60 сек, 55°С - 60 сек, 72°С - 60 сек (30 циклов); 72°С - 5 мин (1 цикл). Нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР определяли с использованием BigDye 3,1 Terminator Cycle Sequencing Kit и автоматического анализатора ДНК модели ABI 3100 (Applied Biosystems, США), в Межинститутском Центре секвенирования ДНК СО РАН (г. Новосибирск; www.sequest.niboch.nsc.ru). При проведении секвенирующей реакции использовали внутренний праймер 5'-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3'. Полученные последовательности нуклеотидов гена 16S РНК сравнивали с последовательностями из международного банка данных NCBI c помощью пакета программ BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
Результаты и обсуждение
Численность культивируемых микроорганизмов в образцах, отобранных в условиях мерзлоты, составляла от 1,4х102 до 4,8х104 КОЕ/мл пробы и в большинстве образцов была достаточно близка для выделенных мезофильных и психрофильных изолятов (таблица 2).
Таблица 2. Титр жизнеспособных микроорганизмов, выделенных из мерзлотных образцов и органических останков ____________________________погребальных камер курганов Олон-Курин-Г ол________________________________
Проба Численность микроорганизмов (КОЕ/г или мл пробы) Выделенные штаммы
Мезофилы Психротолеранты
1 4,8х103 7,2х103 Ок1 - Ок14, Ok75p - Ok 81p
2 2,7х104 1,3х104 Ок15 - Ок21, Ok82 - Ok84p Ok92 - Ok94p
3а 6,8х103 8,8х103 Ок22 - Ок26, Ок28, Ok30 -Ok 32, Ok85p - Ok 87p
3б 6,5х103 8,5х103 ОК27, ОК29, Оk33 - Оk35, Оk88р - Оk91р
3в 6,4х103 1,8х104 Ok36 - Ok41, Ok95p - Ok96p
4 3,4х104 1,5х104 Ok42 - Ok47, Ok97p - Ok99p
5 4,8х104 3,2х104 Ok51 - Ok54, Ok73t - Ok74t, Ok100p - Ok103p
6 2,8х104 5,8х104 Ok48 - Ok50, Ok104p, Ok105
7 4,5х103 1,2х104 Ok55 - Ok60, Ok106p - Ok108p
8 1,4х102 2,8х103 Ok61, Ok63 - Ok68, Ok109p - Ok112p
9 1,9х103 1,6х104 Ok69 - Ok72, Ok113p, Ok114p
Идентификация выделенных штаммов микроорганизмов. На основе результатов анализа нуклеотидных последовательностей (н.п.) 16SpРНК и фенотипических признаков микробных изолятов проведено определение их
65
таксономической принадлежности. Преобладающими среди выделенных микроорганизмов были представители таких повсеместно широко распространенных родов неспороносных бактерий как Pseudomonas (30 штаммов), Arthrobacter (13 штаммов), Acinetobacter (9 штаммов). В меньшем количестве обнаружены бактерии родов Flavobacterium (2 штамма), Stenotrophomonas (3 штамма), Chryseobacterium (3 штамма), Terrabacter (2 штамма). В единичных количествах в полученной коллекции микробных изолятов курганов Олон-Курин-Гола присутствовали штаммы родов Microbacterium, Exiguobacterium, Agrococcus, Brevundimonas, Аeromicrobium, Planococcus, Pussilimonas. Выделены также грамположительные коринеморфные бактерии родов Rhodococcus (4 штамма), Nocardia (1 штамм) и три штамма актиномицетов рода Streptomyces. Бактерии, образующие эндоспоры, были представлены двумя родами: Bacillus (21 штамм) и Sporosarcina (2 штамма). На филогенетических деревьях исследуемые штаммы имеют пронумерованное обозначение «ОК», образуют ветви, как близкие по таксономической принадлежности к ранее известным эубактериям (95-100% сходства), так и далеко от них отстоящие, в том числе выявлены микроорганизмы, не имеющие известных аналогов в банке данных.
Штаммы рода Pseudomonas являются обычными обитателями холодных почв, составляя около 7% от всего количества выделяемых психротолерантных микроорганизмов. Штаммы этого рода, изолированные из исследуемых образцов (рис.1) как правило хорошо росли при 4, 20°С и 28-30°С, некоторые - при температуре от 4 до 45°С. К психрофилам, имеющим температурный оптимум ниже 10°С, можно было отнести штаммы Ok82р, Оk84р, Оk89р, Оk91р, ОЫ00р, ОЫ06р.
CeMvibrio japonicus AF452103
0.001
Рис. 1. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК эубактерий рода Pseudomonas,
построенное методом ближайших соседей.
Примечание: на рисунке указаны виды эубактерий и номера доступа в базе данных GenBank. В узлах указаны индексы поддержки кладистических групп.
66
Особое внимание обращают на себя плазмидосодержащие штаммы Pseudomonas sp. Ок92 и Ок27, для которых характерны такие признаки патогенности, как плазмокоагулирующая, гемолитическая, желатиназная и лецитиназная активности. Кроме того, эти штаммы проявили множественную устойчивость к антибиотикам. Для псевдомонад характерно наличие плазмид, несущих гены устойчивости к неблагоприятным факторам среды, включая антибиотики. С помощью экспресс-метода плазмидные ДНК различного молекулярного веса обнаружены у большинства штаммов выделенных псевдомонад.
Грамположительные, аэробные коринебактерии рода Arthrobacter, часто обнаруживаемые среди психротолерантных бактерий, также выделенны из исследуемых образцов (штаммы Ok4, Ok9, Ok35, Ok43, Ok60, Ok66, Ok71, Ok85р, Ok108р, Ok109р, OkП0р, OkП3р, OkП4р) (рис.2). В отличие от мезофильных бактерий этого рода, температурный оптимум у них был сдвинут в сторону пониженных температур - особенность, известная для многих микроорганизмов холодных и мерзлотных условий обитания [9,10]. Ферментативная активность штаммов в условиях опыта была слабо выражена. Эндонуклеазы рестрикции обнаружены у штаммов Оk85р и ОЫ09р, плазмидные ДНК - у штаммов Ok4, Ok9, ОЫ09р. Близкородственными микроорганизмами артробактерий являются выделенные аэробные коринеморфные бактерии родов Rhodococcus (штаммы ОЫ0, ОЫ3, Ok58, Ok70), Nocardia (штамм Ok98р) и актиномицеты рода Streptomyces (штаммы Ok22, Ok26 и Ok65).
Штаммы рода Acinetobacter. В соответстви с результатами анализа н.п. 16SрРНК штаммы Ok45, Ok 48, Ok49, Ok50, Ok54, Ok57, Ok97р, Ok103р, ОЫ05р определена: как принадлежащие к роду сапрофитных бактерий Acinetobacter широко распространенных в почве и воде. Известно также, что штаммы Acinetobacter spp. входят в состав микрофлоры кожи, желудочнокишечного и урогенитального тракта и могут относиться к патогенам.
67
65
92
OK9
Arthrobacter sp. DQ1 08398
Arthrobacter psychrophenolicus AJ616763 Arthrobacter sulfureus X83409 Arthrobacter sp. DQ1 7301 0 Arthrobacter kerguelensis AJ6006061
Arthrobacter gangotriensis AJ606061 66 I— Arthrobacter sp.EU196326 74Г OK4
97 I I— Arthrobacter sp.GU570656
Arthrobacter protophormiae X80745 OK1 10 OK114
Arthrobacter sp.AF51 3394 Arthrobacter sp. F N37771 7 Arthrobacter globiformis X80736 Arthrobacter cryotolerans GQ40681 2 Arthrobacter halodurans EU583729 OK23
Arthrobacter sp. FJ005001 99 | OK66
Arthrobacter luteolus AJ243422 ----- OK71
Arthrobacter nicotinovorans X80743 Arthrobacter nitroguaiacolicus AJ512504 OK55
Microbacterium phyllosphaerae AJ277840 Microbacterium oxydans Y17227 M. hydrocarbonoxydans AJ698726
— Microbacterium foliorum AJ249780
— Microbacterium lacticum X77441 Agrococcus versicolor AM940157
Agrococcus citreus AB279547 — Agrococcus sp.EU584505 OK32
Agrococcus baldri AB279548 Agrococcus jenensis X92492 Agrococcus sp.DQ177486
OK61
Terrabacter aeriphilus EU573947 Terrabacter tumescens AF005023 Terrabacter aerolatus EF212039 Terrabacter terrae AY944176 Terrabacter lapilli AM690744 Terrabacter terrigena FJ423552 OK35 OK70
Rhodococcus erythropolis X79289 Rhodococcus qingshengii DQ090961 OK13 OK58
Rhodococcus boritolerans FJ597543 Rhodococcus globerulus X80619 Rhodococcus rhodochrous X79288 Streptomyces humidus DQ442508
Streptomyces acrimycini AY999889 Streptomyces albus AJ621602
Streptomyces macrosporus Z68099 83 г Streptomyces kunmingensis DQ442513
Streptomyces bungoensis AB184696
Streptomyces prasinopilosus AB249968 Streptomyces flavoviridis AB184842 Streptomyces sclerotialus AJ621608 8^ I I Streptomyces platensis AB045882 6^i Streptomyces niger AJ621607 54I Streptomyces olivaceiscleroticus AJ62160
0.01
Рис.2. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК эубактерий рода Arthrobacter, Agrococcus, Microbacterium, Terrabacter, Rhodococcus, Streptomyces, построенное методом ближайших соседей. На рисунке указаны виды эубактерий и номера доступа в базе данных GenBank. В узлах указаны индексы поддержки
кладистических групп.
68
Клетки психротолерантных микробных изолятов, выделенных из образцов Олон-Курин-Гола и отнесенных к роду Acinetobacter, представляли собою грамотрицательные кокко-бациллы, кокки или укороченные, палочки, каталазоположительные, отрицательные по оксидазе и, как это свойственно представителям рода Acinetobacter, устойчивые к пенициллину (25 мкг/мл). Ферментативная активность штаммов этой группы была слабо выражена или в рамках проведенного тестирования отсутствовала. Признаки патогенности (гемолитическая, плазмокоагулазная, желатиназная, лецитиназная активности), выявляемые косвенным образом, у данных штаммов не были обнаружены.
Штамм Acinetobacter sp. Ok103р продуцировал эндонуклеазу рестрикции (ЭР) Asp103I, являющуюся изошизомером ЭР BamHI, представляющую биотехнологический интерес, так как максимальный уровень активности ЭР Asp103I проявляется при температуре 6-10°С. В настоящее время, в литературных источниках имеются сведения о изошизомерах данного фермента, однако, ни один из них не обладает температурным оптимумом ниже 20°С.
Грамположительные бактерии, образующие эндоспоры. Среди микроорганизмов, выделенных из мерзлотных образцов захоронения, преобладали неспороносные бактерии. В большинстве публикуемых работ указывается на малое содержание бактерий образующих эндоспоры в различных мерзлотных субстратах, либо их полное отсутствие. Отмечена высокая чувствительность бактериальных спор к негативным условиям среды в момент прорастания [11, 12]. Из 21-го штамма спорообразующих бацилл, выделенных из мерзлотных образцов, отобранных в камерах захоронения курганов Олон-Курин-Гола, 16 штаммов оказались мезофиллами, оптимальная температура роста этих штаммов составляла 20-28°С. Большая часть из них образовывала эллиптические эндоспоры, расположенные в клетке центрально или терминально. Исключением были штаммы Оk38 и Оk76р формирующие сферические эндоспоры терминального расположения, значительно превышающие диаметр клеток, аналогично клеткам известного вида Bacillus sphaericus. Для тринадцати штаммов бацилл показано наличие протеаз. Семь из них дополнительно продуцировали зкзонуклеазы. За исключением штамма Оk14 для всех бацилл была характерна каталазная активность, выраженная в разной степени, не обнаружены эндонуклеазы рестрикции; амилолитическая и липолитическая активности выявлены у единичных штаммов. Штамм Bacillus sp. Оk39 обладал наибольшей ферментативной активностью (шестью из восьми тестированных) и обнаружил при этом три косвенных фактора патогенности: лецитиназную, гемолитическую и желатиназную активности, проявил устойчивость к четырем широко применяемым антибиотикам - стрептомицину, гентамицину, эритромицину и левомицетину.
Штаммы Ок33, Ок72 и Ок88 отнесены к роду Sporosarcina в соответствии с данными анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК. Из микроорганизмов этого рода наиболее известна подвижная, спороносная уробактерия Sporosarcina ureae, обитающая в почве, моче, навозе, сточных водах и в воде очистных сооружений, способная расти в условиях щелочных сред [13]. Известны психрофильные представители этого рода, такие как Sporosarcina antarctica [14], Sporosarcina psychrophila и целый ряд других видов. Штаммы Sporosarcina sp. Оk72 и Оk88 являются психротолерантными, имеют фенотипические признаки характерные для представителей рода Sporosarcina, подтверждающие таксономическое определение штамма Оk72, полученное при анализе нуклеотидной последовательности 16S pРНК.
Грамотрицательные и грамположительные неспороносные бактерии, обладающие факторами патогенности. В эту группу условно объединены бактерии нескольких родов, не образующие эндоспоры: штаммы родов Terrabacter (штаммы Ok2 и Ok61), Stenotrophomonas (штаммы Ok6, Ok16 и Ok46), Agrococcus (штамм Ok32), Exiguobacterium (штамм Ok32), Microbacterium (штамм Ok55), Chryseobacterium (штаммы Ok56, Ok59, Ok67) и штамм Ok64, отнесенный к Brevundimonas. Штаммы Ok2, Ok61 по н.п. 16S РНК имеют 98-99% гомологии с представителями рода Terrabacter [15], обладают рядом признаков, характеризующих бактерии этого рода: имеют сферические, грамположительные клетки, с оптимум роста в пределах 20-30°С, не сбраживают глюкозу, отрицательны по оксидазе и имеют выраженную гемолитическую активность, для более точной идентификации штаммов Ok2 и Ok61 нужны дополнительные исследования.
Штаммы Ok6 и Ok16, определенные в соответствии с результатами анализа н.п. 16S рРНК как Stenotrophomonas sp., обладают рядом сходных черт с бактериями этого рода: имеют грамотрицательные, палочковидные клетки, проявляют множественную, высокую устойчивость к антибиотикам, обладают гемолитической и желатиназной активностями. Для них также характерно наличие высокой протеолитической, липолитической и экзонуклеазной активности.
Более детального рассмотрения заслуживают неферментирующие, грамотрицательные, гемолитические штаммы Ok-56, Ok-59 и Ok-67, определенные как Chryseobacterium sp. Основные клинические формы проявления инфекций, вызываемых Chryseobacterium meningisepticum - менингит и бактериемия. Выделенные в работе штаммы, как свойственно батериям этого рода, обладают устойчивостью ко многим антимикробным препаратам, применяемым для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями. На агаризованных средах эти штаммы образуют полупрозрачные колонии темно-желтого цвета, что обусловлено синтезом водонерастворимого пигмента флексирубина [16].
Неидентифицированные штаммы Ok19, Ok52, Ok62, Ok68, Ok69, Ok78р, Ok83р, Ok89р, Ok94, Ok95p, Ok100р, Ок101р, Ok104р, Ok107р, Ok111 и ряд других по первичным данным являются палочковидными, неспорообразующими, неферментирующими, грамотрицательными или грамположительными, психротолерантными бактериями, растущими в диапазоне температур 4 - 30°С. Детальная идентификации этих штаммов затруднительна ввиду очень слабого роста или его отсутствия при повторных попытках культивирования.
Следует отметить, что около 40% штаммов от общего количества выделенных 114 изолятов обладали гемолитической активностью и другими косвенными факторами патогенности. Среди них - 12 штаммов мезофильных бактерий Bacillus ssp., 5 штаммов Artrobacter ssp., а также - штаммы, идентифицированные как представители родов Stenotrophomonas,, Chryseobacterium, в составе которых известно большое количество высокопатогенных видов, и ряд других.
Тем не менее, несмотря на значительное количество условно патогенных штаммов, обнаруженных в образцах, взятых в погребальных камерах курганов, нет возможности говорить определенно об их причастности к болезни или смерти объектов захоронения, так как микроорганизмы упомянутых родов повсеместно встречаются в почве, воде, в составе нормальной микрофлоры людей и животных.
Литература
1. Молодин, В. И. Исследование российско-германско-монгольской экспедиции на северо-западе Монголии летом 2006 г. / В. И. Молодин // Российская археология. -2007.- №4.- С.42-50.
2. Демкина Т. С. Демкин В. А. Микробиологическая характеристика погребенных почв археологических памятников: новый подход в изучении палеоэкологии комплексных обществ // Комплексные общества Центр. Евразии в III-I тыс. до н. э. - Челябинск. -1999. - С. 321-325.
3. Hershkovitz I., Donoghue H.D., Minnikin D.E. et al.Detection and molecular characterization of 9,000-year-old Mycobacterium tuberculosis from a Neolithic settlement in the Eastern Mediterranean // PLoS ONE. 2008. V. 3. № 10. P. e3426.
4. Демкин В.А. Палеопочвоведение и археология / В.А. Демкин. - Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1997. - 213 с.; Демкина Т. С. Демкин В. А. Палеоэкологическое значение микробоценозов погребенных почв археологических памятников степной зоны // Экология древних и современных обществ: ТДК. - Тюмень. - 1999. - С. 51-52.
5. Методы общей бактериологии /под ред. Ф. Герхарда и др. М.: Мир. 1983. -Т. 1. -536 C.; 1984. -Т. 3. -264 с.
69
6. Gregersen, T. Rapid method for distinction of gramnegative from gram-positive bacteria // Eur. J. Appl. Microbiol.Biotechnol.-1978.- Vol.5.- P. 123-127.
7. Holt J.G. et al.. (Eds) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 8th edition - Baltimore-London, William & Wilkins,1986.-Vol.1-2.- 1105 p.
8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. -480 с.
9. Абызов С.С. Микрофлора ледникового щита Центральной Антарктиды// Автореф. дис. докт. биол. наук.-М., 2001.
10. Vorobyova E., Soina V., Gorlenko M., Minkovskaya N., Zalinova N., Mamukelashvili A., Gilichinsky D.A, Rivkina E., Vishnivetskaya T. The deep cold biosphere: facts and hypothesis.// FEMS, 1997.- 20: 277-290.
11. D'Amico S., Collins T., Marx J.C., Feller G., Gerday C. Psychrophilic microorgamisms.: challenges for life // EMBO Rep. - 2006. - Vol.7. - P. 385-389.
12. Лях C., Абызов С.С. Некоторые особенности микрофлоры Антарктики в связи со спецификой экстремальных условий существования // Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1976. - №2. - C. 252-262.
13. Kocur M;Martinec T. The taxonomic status of Sporosarcina ureae (Beijerinck) Orla-Jensen// Int Bull Bacteriol Nomencl Taxon.-1963.-V. 13.-P. 201-209.
14. Yu Y, Xin YH, Liu HC, Chen B, Sheng J, Chi ZM, Zhou PJ, Zhang DC. Sporosarcina antarctica sp. nov., a psychrophilic bacterium isolated from the Antarctic//Int J Syst Evol Microbiol. 2008 Sep; 58(Pt 9): 2114-7.
15. Collins M. D., l M. Dorsch,’ and E. Stackebrandt’ Transfer of Pimelobacter tumescens to Terrabacter gen. nov. as Terrabacter tumescens comb. nov. and of Pimelobacter jensenii to Nocardioides as Nocardioides jensenii comb. nov.//”Int. J.Syst. Bacteriol. 1989. 39: 1-
6.
16. Боронина Л.Г., Кукушкина М.П., Крутова К.В., Блинова С.М. Род Chryseobacterium (Flavobacterium): клиническое значение, идентификация. Чувствительность к антибиотикам // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2003.-Т. 5. -С 243-250.
Андреева И.С., 2Мазуркова НА., 3Мокрушина О.С., 4Пучкова ЛИ, 5Закабунин А.И.
l, 2,3,4,5кандидат биологических наук, 3аспирант, ФБУН государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», п. Кольцово Новосибирской обл., Россия;5Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г.
Новосибирск, Россия
ШТАММЫ BACILLUS THURINGIENSIS, СЕКРЕТИРУЮЩИЕ МЕТАБОЛИТЫ, ПОДАВЛЯЮЩИЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ВИРУСА ГРИППА ЧЕЛОВЕКА A/AICHI/2/68 (H3N2) И ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ A/CHICKEN/KURGAN/05/2005
Аннотация
Исследована возможность подавления размножения вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) на культуре ткани MDQK водорастворимыми метаболитами штаммов Bacillus thuringiensis. Проведенные исследования показали, что наряду с отсутствующей или незначительной токсичностью исследуемые опытные образцы препаратов показали высокую активность против вирусов гриппа, что делает перспективным дальнейшую их разработку в целях борьбы с вирусами гриппа человека и птиц.
Ключевые слова: вирусы гриппа, Bacillus thuringiensis, водорастворимые метаболиты, противовирусная активность.
'Andreeva I.S., 2Mazurkova N.A., 3Mokrushina O.S., 4Puchkova L.I., 5Zakabunin A.I.
1 2,3,4,5Ph D in biology , 3Postgraduate stuent, FBRI State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”, Koltsovo, Novosibirsk region, Russia; 5Institute of Chemical Biology and Functional Medicine SB RAS, Novosibirsk, Russia BACILLUS THURINGIENSIS STRAINS SECRETING METABOLITES INHIBIT THE REPLICATION OF HUMAN
INFLUENZA VIRUS A/AICHI/2/68 (H3N2) AND AVIAN INFLUENZA VIRUS A/CHICKEN/KURGAN/05/2005
Abstract
The possibility of inhibiting the replication of human influenza virus A/Aichi/2/68 (H3N2) and avian influenza virus A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) on MDCK tissue culture by water-soluble metabolites of Bacillus thuringiensis strains was studied. The performed investigations showed that along lacking or insignificant toxicity the studied pilot samples of the preparations demonstrated high activity against influenza viruses, which makes promising theirfurther development for control of human and avian influenza viruses.
Keywords: influenza viruses, Bacillus thuringiensis, water-soluble metabolites, antiviral activity.
Одна из новых стратегий разработки противовирусных препаратов состоит в выделении активных соединений из продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. Большой интерес исследователи проявляют к экологически безопасным штаммам бактерий рода Bacillus, продуцирующих большой спектр биологически активных веществ. Получены данные по активности штамма В. pumilus «Пашков» в отношении вируса полиомиелита I типа, вирусов ECHO 3 и ECHO6, вирусов Коксаки [1], по противовирусной активности штамма B. thuringiensis VNPB 17-3, продуцирующего белковый токсин, обладающий активностью против вируса табачной мозаики [2]. В настоящей работе исследованы противовирусные свойства штаммов Bacillus thuringiensis (Bt) относительно вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1).
Материалы и методы.
Приготовление образцов для испытания. Для тестирования на противовирусную активность были отобраны штаммы Bt, отличающиеся морфологией, биохимическими свойствами, антимикробной активностью, особенностями кристаллообразования: штаммы Bt ssp. kurstaki АК-5 (ffiabc), колл. № В-1276; Bt ssp. finitimus АК-3 (Н2), колл. № В-1274; штамм Bt АК-1, колл. № В-1272 и штамм Bt АК-2, колл. № В-1273, депонированные в «Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»». Посевной материал получали при выращивании штаммов Bt на жидкой или агаризованой среде LВ (“Difco”, США). Контроль морфологии клеток и наличие параспоральных включений оценивали с помощью микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss, Germany) используя фазово-контрастную микроскопию.
С использованием культуры исследуемого штамма, наработанного на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 30°С, готовили суспензии клеток с концентрацией 1*107 кл/мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы со средой LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки (КТ 104, Россия) при температуре 30°С. Для приготовления препарата полученную культуральную жидкость штамма (КЖ) центрифугировали при 6000 об./мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтры и хранили до использования при температуре минус 20 С.
Определение токсичности и противовирусной активности препаратов. Для тестирования токсичности и противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученную из «Коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»». В асептических условиях суспензию с известной концентрацией клеток MDCK разводили средой RPMI-1640 до концентрации 1*105 кл./мл и по 100 мкл вносили в лунки 96-луночных планшетов. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре 37°C, 5% СО2 и 100% влажности на 2-3 суток до образования монослоя. Препараты разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками MDCK и ставили в
70
