CC BY
225
Фармакология, генополиморфизм и клонирование генов NAT у человека и животных-моделей
В.Н.Каркнщснко, В.В. Мартынов
Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва
Ключевые слова: N-ацетилтрансфераза, метаболизм лекарств, ксенобиотиков, фармакология, онкология, животные-модели.
Одним из самых ранних механизмов адаптации является реакция ацетилирования, необходимая для функционирования цикла Кребса, синтеза стероидов и жирных кислот, в процессах метаболизма или биотрансформации ксенобиотиков, включающих лекарственные препараты, бытовые и промышленные яды. Реакция ацетилирования осуществляется ферментом N-ацетилтрансфера-зой и коферментом А. В организме человека интенсивность ацетилирования находится под контролем p-адренорецепторов, пантотеновой кислоты, пиридоксина, тиамина и липоевой кислоты и зависит от функционального состояния внутренних органов и печени, в которых содержится N-ацетилтрансфераза. Всего выделено 2 изофермента: N-ацетилтрансфераза 1 (NATI) и N-ацетилтрансфераза 2 (NAT2). NAT2 - белок, состоящий из 290 аминокислотных остатков, с молекулярной массой 33 кДа и локализующийся в цитоплазме клеток. Ген его находится в 8 хромосоме, локусе8р23.1 -р21.3.
Оба изофермента генетически полиморфны, то есть имеют несколько аллелей. Присутствие того или иного аллеля в генотипе влияет на скорость метаболизма лекарственных средств и может быть причиной различных нежелательных эффектов. Поэтому, аллельный состав генов NAT необходимо учитывать при проведении доклинических испытаний новых препаратов на живот-ных-моделях.
У человека основным ферментом ацетилирования ряда лекарственных препаратов в частности изониазида и сульфаниламидов, является NAT2, а NATI ацетилирует ариламины. К лекарствам, подвергающимся ацетилированию NAT2 относятся сердечно-сосудистые средства (прокаинамид, гид-ралазин), сульфаниламиды (сульфасалазин, суль-фаметоксозол, сульфадиазин, сульфацетамид), ингибиторы стероидогенеза (аминошутетимид), противотуберкулезные препараты (изониазид, ПАСК), бензодиазепины (нитразепам), а также кофеин, ПАБК и другие [ 1 ].
Генетический полиморфизм одно из важных свойств NAT2, описан в 1960 г. Evans и им же выделены «медленные» и «быстрые» ацетиляторы изониазида [2]. «Медленные» ацетиляторы являются гомозиготами по «медленной» аллели NAT2, а «быстрые» метаболизаторы являются гомозиготами или гетерозиготами по «быстрой» аллели NAT2 [4].
Оценены мРНК, уровни экспрессии протеина и стабильность протеина [3]. Не было найдено различий в экспрессии наблюдаемых NAT2*4 и NAT2*5B. Однако, NAT2 5В и NAT2 5D, но не NAT2 6D и NAT2 14G экспрессии протеина были существенно ниже, чем NAT2 4. В противоположность, NAT2 6D были легче (3.4 раз) и NAT2 14G был существенно (29 раз) менее стабилен, чем NAT2 4. Эти результаты предполагают, что 341Т С (Ilel 14 Thr) общий для кластера NAT2*5 достаточен для редукции в экспрессии протеина NAT2, но, что механизм для медленного ацетилятора фенотипа отличается для аллелей NAT2, которые не содержат 341Т С, она содержится в кластерах NAT2*6 и NAT2* 14. Различия в механизмах для медленной ацетиляции фенотипа у людей связаны с множественной медленной ацетиляцией фенотипов [3].
Генетические вариации в NAT2 показывают предрасположенность людей к раку, индуцированному окружающей средой. Около 50% большинства не-азиатского населения являются фенотипом с медленной ацетиляцией, они чаще испытывают воздействие токсических веществ из многих ароматических аминов и лекарств. Медленные ацетиляторы также показывают предрасположенность к раку мочевого пузыря от канцерогенов ароматических аминов. Показано, что самый медленный аце-тиляторный фенотип имеет наивысшую заболеваемость раком мочевого пузыря.
Первоначальные исследования показали, что низкий ацетиляторный фенотип соответствовал снижению или отсутствию N-ацетилтрасферазы печени. Комбинация полиморфизма 341Т С/481C Т и полиморфизма 590G А в коде NAT2 приводят к уменьшению экспрессии рекомбинантного протеина NAT2 человека в клетках COS-1. Более того, исследования показали полиморфизм 590G А и 857G А в кодировке области NAT2 были связаны с уменьшением экспрессии протеина NAT2 в печени человека и снижению экспрессии рекомбинантного протеина NAT2 в клетках яичников у китайских хомяков. Изучения рекомбинантной экспрессии в прокариотической системе, однако, не показали снижения в протеине N АТ2, связанные с медленными ацетиляторными аллелями. Таким образом, молекулярный механизм опашка на медленные аце-тиляторные фенотипы остаются не полностью понятными.
Изучение связи генотипов NAT2 с раком выявлены три новые аллели NAT2. Новые аллели NAT2
вместе с наиболее общими быстрыми (NAT2*4) и медленными (NAT2*5B) ацетиляторами аллелей NAT2 были охарактеризованы рекомбинантной экспрессией в дрожжах (Schizosaccharomyces pombe), а у человека относятся к медленному аце-тиляторному фенотипу.
Имеются данные о том, что фенотип «быстрого» ацетилирования встречается чаще у светлоглазых и светловолосых людей. Есть также данные о снижении распространенности «медленных» аце-тиляторов с Севера на Юг и, что частота рака мочевого пузыря в 2-3 раза больше чем у «быстрых» ацетиляторов. Среди «быстрых» ацетиляторов в 1,8 раз чаще встречается колоноректальный рак и это по-видимому можно объяснить тем, что у них более интенсивный процесс биоактивации потенциальных канцерогенов - ариламинов при их аце-тилировании. Среди представителей европеоидной расы распространенность «медленных» ацетиляторов составляет около 50%, а среди монголоидов до 15%. В настоящее время идентифицированы около 15 мутантных аллелей гена NAT2, приводящие к «медленному» ацетилированию.
Тип ацетилирования определяется как фено-типированием, так и генотипированием NAT2, а в качестве маркерных субстратов широко используются дапсон и сульфадимезин. Если отношение концентрации моноацетилдапсона к концентрации дапсона в плазме через 6 часов после введения менее 0,35 - это характерно для «медленных» ацетиляторов, а если более 0,35 - для «быстрых». При использовании сульфадимезина, наличие его менее 25% в плазме через 6 часов после введении и менее 70% в моче, собранной через 5-6 часов после введения характерно для «медленного» ацетилирования.
В Научном центре биомедицинских технологий ведется работа по изучению полиморфизма, в том числе генов NAT и связи этого полиморфизма с функцией ацетилирования у мини-свиней и мышей различных инбредных линий. При помощи праймеров, распознающих консервативные участки в генах NAT, нами были амплифицирова-ны, и впоследствии клонированы фрагменты геномной ДНК мышей линий DBA2 и BALB/c и мини-свиней светлогорской популяции, Сравнение нуклеотидных последовательностей этих фрагментов с уже известными последовательностями генов NAT1 и NAT2 показало, что полученные фрагменты принадлежат генам семейства NAT у исследованных животных. При этом, в случае мини-свиней полученный ген оказался геном NAT1, а в случае мышей геном NAT2. Гомология гена мини-свиньи с генами NAT1 у других представителей класса млекопитающих составила 89%, причем 87% для кошки (Felis catus), 87% для коровы (Bos taurus), 86% для шимпанзе (Pan troglodytes), 86% для макаки (Масаса mulatta), 78% для человека (Homo sapiens) и 78% для мыши (Mus musculus) и крысы (Rattus norvegicus).
Амплифицировать ген NAT2 у свиньи нам пока не удалось.
Что касается генов NAT2, полученных нами у двух инбредных линий лабораторных мышей, то эти два клона оказались абсолютно идентичны как между собой, так и по сравнению с сиквенсами этого гена у других линий мышей, найденными нами в генетическом банке. Эти результаты свидетельствуют о высокой генетической однородности мышей различных инбредных линий по гену NAT2. Гомология генов NAT2 мыши и человека составила 80%. Известны и мутантные аллели гена NAT2 у человека, приводящие к медленному ацетилированию. Эти аллели содержат следующие нуклеотидные замены: 191G-» А, 282С-»Т, 341Т-*-С, 481С-*Т, 590G-*A, 803A->G и 857G->A. В полученных нами сиквенсах генов NAT2 у мышей в этих положениях находятся следующие нуклеотиды: 191G, 282Т, 341Т, 481Т, 590G, и 803G, нуклеотид 857 не был апмлифицирован. Нетрудно заметить, что у мышей в указанных позициях находятся либо нуклеотиды соответствующие «нормальному» аллелю человека (191,341,590), либо нуклеотиды, аналогичные замещающим нуклеотидам в мутантных человеческих аллелях (282, 481, 803). Из этого можно сделать вывод о консерватизме как «нормальных», так и замещающих нуклеотидов в этих позициях. Однако пока не известно, являются ли эти положения и замены в них функциональными у мыши также как у человека.
Ацетиляционный полиморфизм связан не только с различными устойчивостями к токсичности лекарств, но и раковыми заболеваниями, связанными с ароматическими и гетероцикличными аминами. N-ацетиляция является катализом двух цитозольных N-ацетилтрансфераз (NATI и NAT2), которые обезвреживают многие карциногенные ароматические амины. NATI и NA17 также активируют N-гидроксилметаболиты ароматических и гетеро-цикличных аминных карциногенов до составляющих, которые влияют на ДНК и инициируют рак. Классический N-ацетиляционный полиморфизм регулируется локусом NAT2, который сегрегирует индивидуумов в быстрые, средние и медленные ацетиляторные фенотипы. Некоторые эпидемиологические исследования на людях связаны с медленными и быстрыми ацетиляторными фенотипами с повышением чувствительности в мочевом пузыре и колоректальным раком, соответственно. Ацетилационный полиморфизм был охарактеризован в трех типах грызунов и у мини-свиней для проверки связи между ацетилятором фенотипа NAT2 и восприимчивостью к ракам, вызванным ароматическими и гетероцикличными аминами в различных целевых органах опухоли. Были клонированы и последовательно представлены NATI и NAT2 из быстрых и медленных ацетиляторных мышей, сирийского хомяка и крысы. Рекомбинанты NATI и NAT2 энзимов раскодированы, коды этих генов характеризовали их каталитическую активность по
активации (О-ацетиляция) и деактивации (N-ацетиляция) ароматических и гетероцикличных аминных карциногенов. Ацетиляторный полиморфизм у мини-свиней, мышей, сирийского хомячка и крысы может быть описан как модель ацетиляционного полиморфизма человека.
Тем не менее необходимы дополнительные исследования полиморфизма генов семейства NAT у лабораторных животных и проведение фенотипирования тех особей, у которых будут выявлены различиия в нуклеотидных последовательностях генов NAT.
Литература
1. Кукес В.Г. Метаболизм лекарственных средств: клинико-фармакологические аспекты. -М., 2004.
2. Evans D.A.P.; Manley К.А.; McKusick, V.A. Genetic control of isoniazid metabolism in man. // Brit. Med.J.2:485-491, I960.
3. LeffM.A., FetlandAJ., DollM.A., Hein D. W. Novel Human N-Acetyltransferase 2 Alleles That lifer in Mechanism for Slow acetylator phenotype. II J. of Biolog. Chemistry Vol. 274, No. 49, pp. 34519-34522, 1999.
4. Sunahara S.; Urano V; Ogawa M. Genetical and geographic studies on isoniazid inactination. II Science 134:1530-1531,1964.
Pharmacology, genopolymorphism and of cloning NAT-gene in people and animals-models V.N. Karkischenko, V.V. Martynov
Research Center of Biomedical Technologies of RAMS, Moscow
Key words: N-acetyltransferase, drug metabolism, xenobiotics, pharmacology, oncology.
Using conservative DNA segments we amplified and cloned the genomic DNA segments of mices (strains DBA2 & BALB/c) and mini-pigs-(Y) (svetlogorskaya strain). By comparison to the known sequences of NAT1-& NAT2- genes the analysed segments were identified as belonging to the NAT-genes group. The examined gene was found to be specifically NAT1 -genome for mini-pigs and NAT2-genome for mices.
The homology of mini-pigs’ gene with NATl-genes of other mammalians was up to: 89% for cat (Felis catus); 87% for cow (Bos taurus) and chimpanzee (Pan troglodytes); 86% for macaque (Macaca mulatta) and human (Homo sapiens); 78% for mouse (Mus musculus) and rat (Rattus norvegicus).
