CC BY
37
Л. м. ДАНИЛЕНКО, м. В. ПОКРОВСКИЙ, И. А. ТАТАРЕНКОВА,
В. В. ЕЛАГИН О. И. БРАТЧИКОВ
фармакологическое прекондиционирование с ресвератролом при ишемических/реперфузионных повреждениях миокарда: роль оксида азота
Кафедра фармакологии ФГАОУВПО «БелГУ», медицинский институт, факультет лечебного дела и педиатрии, Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85; тел. (4722) 30-13-73; кафедра фармакологии, кафедра урологии ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России,
Россия, 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3; тел. (4712) 58-77-66. Е-mail: Danilenko_L@bsu.edu.ru
В статье изложены результаты исследований влияния дистантного прекондиционирования путем создания кратковременной ишемии конечностей и фармакологического прекондиционирования ресвератролом на размер зоны некроза миокарда и уровень тропонина I в сыворотке крови после ишемии-реперфузии. Установлено сопоставимое протективное действие как дистантного, так и фармакологического прекондиционирования. Обсуждаются возможные механизмы защитного действия фармакологического прекондиционирования при ишемии/ реперфузии. Прекондиционирование сердца ресвератролом обеспечивает кардиопротекцию, о чем свидетельствует снижение размера площади некротизированного миокарда. Кардиопротекция ресвератрола была полностью отменена как 1\1-нитро-1_-аргинин метиловым эфиром (L-NAME), так и аминогуанидином (AG), что показывает, что ресвератрол обеспечивает кардиопротекцию по типу ишемического прекондиционирования, через синтазы оксида азота (NOS) .
Ключевые слова: сердце, ишемия/реперфузия, прекондиционирование, ресвератрол.
L. M. DANILENKO, M. V. POKROVSKY, I. A. TATARENKOVA, V. V. ELAGIN, O. I. BRATCHKOV
PHARMACOLOGICAL PRECONDITIONING OF RESVERATROL IN ISCHEMIC / REHERFUSION INJURY: THE ROLE OF NITRIC OXIDE
Department of pharmacology FGAOU VPO «BSU», institute of medicine, department of pediatrics and medical business, Russia, 308015, Belgorod, str. Victory, 85; tel. (4722) 30-13-73; department of pharmacology, department of urology medical university of KSMU Russian ministry of health, Russia, 305041, Kursk, str. Marx, 3; tel. (4712) 58-77-66. Е-mail: Danilenko_L@bsu.edu.ru
The article presents the results of studies of the effect of distant preconditioning by creating short-term limb ischemia and pharmacologic preconditioning of resveratrol on the size of myocardial necrosis and the level of troponin I in serum after ischemia-reperfusion. Established a comparable protective effect as distant and pharmacological preconditioning. Possible mechanisms of the protective effect of pharmacological preconditioning during ischemia/reperfusion. Preconditioning of the heart by resveratrol provides cardioprotection, as evidenced by the reduction in the size of the area of myocardial necrosis. Cardioprotection resveratrol was completely abolished as N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), and aminoguanidine (AG), which show that resveratrol provides cardioprotection type of ischemic preconditioning by nitric oxide synthase (NOS).
Key words: hearts, ischemia/reperfusion, preconditioning, resveratrol.
Введение Помимо фармакологических кардиопротектор-В настоящее время в современной кардио- ных средств, альтернативных стратегий особое фармакологии продолжается поиск новых эф- внимание привлечено к феномену ишемического фективных методов защиты миокарда от ишеми- прекондиционирования (ИП) миокарда. Ишемического и реперфузионного повреждения, в том ческое прекондиционирование, опосредованное числе средств, позволяющих сохранить структуру одним или более короткими периодами ишемии и функции кардиомиоцитов в условиях ишемии. и реперфузии, считается наиболее мощным
кардиопротекторным подходом последних лет [9]. В отличие от фармакологических вмешательств, которые защищают ишемический миокард путем нейтрализации токсичных компонентов, прекондиционирование оказывает кардиопро-текцию через регуляцию эндогенных защитных механизмов, которые включают в себя несколько кардиопротективных ферментов и белков [25, 36]. Реализация кардиопротекции ишемического прекондиционирования опосредуется через два окна: раннее, или классическое, прекондиционирование продолжительностью до 3-4 ч и позднее ишемическое прекондиционирование продолжительностью от 1 до 3-4 дней [8]. Попытки увеличить «временное терапевтическое окно» пре-кондиционирования имеют ограниченный успех. Существует явная необходимость в разработке фармакологических подходов, способных обеспечить увеличение «временного терапевтического окна» кардиопротекции.
В последнее время многочисленные экспериментальные исследования посвящены изучению кардиопротекторных свойств ресвератрола (3, 5, 4'-тригидрокси-транс-стильбен), который является природным фенольным соединением, содержащимся в кожуре винограда и вине [10, 30].
Известна его гиполипидемическая, антиокси-дантная, эстрогенная, антиагрегационная активность, есть результаты по кардиопротективной активности в опытах in vitro.
Имеются результаты по эффективности ре-свератрола для защиты почек, сердца и мозга от ишемического/реперфузионного повреждения [1, 10, 16, 30]. В клетках почек ресвератрол оказывает свое защитное действие через активацию синтеза оксида азота (NO) [16].
Поскольку ресвератрол может защитить различные ткани от ишемических повреждений, мы предположили, что он может функционировать в качестве фармакологического агента преконди-ционирования через No. Периоды полувыведений ресвератрола значительно выше, чем других, в том числе гуморальных агентов прекондициони-рования (аденозин, брадикинин, опиоиды), следовательно, «временное терапевтическое окно» должно быть существенно шире.
Чтобы проверить данную гипотезу, мы поставили цель изучить механизм кардиопротекции ресвератрола по типу ишемического прекондици-онирования.
Материалы и методы
Изучение выживаемости ишемизированного миокарда было проведено на 66 лабораторных кроликах массой 2-2,5 кг. Влияние ресвератрола на размер зоны некроза изучали на модели коро-нароокклюзионного инфаркта миокарда. Инфаркт миокарда воспроизводился на наркотизирован-
ных животных (хлоралгидрат 300 мг/кг), находящихся на управляемом дыхании, путем перевязки нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне нижнего края ушка левого предсердия (60 мин) с последующей реперфузией (90 мин). Поперечные срезы миокарда производили через каждые 0,8 см, начиная с уровня 0,8 см ниже места наложенной лигатуры. Срезы миокарда помещали в емкость, содержащую фосфатный буфер (рН 7,4) и 1 мг/мл трифенилтетразолия хлорид для образования красного формазана [2, 3, 4, 5]. Подсчет площадей интактного и некротизирован-ного миокарда левого желудочка производили на каждом из четырех срезов с помощью попик-сельного анализа в программе «Adobe Photoshop 9.0». Уровень Troponin I (TnI) определяли на им-мунофлуоресцентном приборе «Triage MeterPro» («Biosite», США).
Ишемическое прекондиционирование осуществляли путем 5-минутного прекращения кровотока в лигированной коронарной артерии за 30 мин до тотальной ишемии миокарда. Дистантное ишемическое прекондиционирование осуществляли путем наложения жгута на верхнюю треть бедра на 10 мин с последующей 20-минутной ре-перфузией и воспроизведением модели инфаркта на 60 минут.
Фармакологическое прекондиционирование осуществляли с помощью внутривенного введение в маргинальную вену уха кролика ресверат-рола (Sigma) в дозе 2 мг/кг.
С целью подтверждения гипотезы о реализации эффектов прекондиционирования через активацию системы синтеза оксида азота и КАТФ-ка-налы животным вводили L-NAME в дозе 25 мг/кг (блокатор индуцибельной (iNOS) и эндотелиаль-ной (eNOS) NO-синтетазы), глибенкламид (блокатор КАТФ-каналы) в дозе 0,4 мг/кг, аминогуанидин (блокатор индуцибельной (iNOS) NO-синтазы в дозе 100 мг/кг [6, 7].
Результаты исследования и их обсуждение
Наложение лигатуры на нисходящую ветвь левой коронарной артерии в контрольной группе приводило к развитию некроза миокарда левого желудочка, размер которого составил 27,3±1,2%. Применение ДИП, фармакологического прекондиционирования путем внутрибрюшинного введения ресвератрола привело к достоверному уменьшению площади некротизированного миокарда и составило 9,4±0,5%, 15,2±0,8% соответственно. Блокада еNOS и iNOS на фоне моделирования ишемии/реперфузии, применения ресвератрола, ДИП привела к нивелированию противоишеми-ческих эффектов. Величина зоны некроза в группе животных, получавших L-NAME и ресвератрол, составила 24,1±1,3%, получавших L-NAME и ДИП -25,3±0,8%, аминогуанидин и ресвератрол -
Влияние ресвератрола (2 мг/кг) в/в и дистантного ишемического прекондиционирования на размер зоны некроза и уровнь тропонина I при острой коронароокклюзии (60 мин) с последующей реперфузией (90 мин) у наркотизированных кроликов m; в % от массы левого желудочка; п=6)
Группа % некроза Уровень тропонина I, нг/мл
Контроль (инфаркт миокарда ) 27,3±1,2 16,26±1,9
КО/реперфузия + дистантное прекондиционирование 9,4±0,5* 4,9±1,3*
КО/реперфузия + ресвератрол (2 мг/кг) 15,2±0,8* 5,24±1,1*
КО/реперфузия + дистантное прекондиционирование + ресвератрол (2 мг/кг) 9,4±0,5* 4,9±1,3*
КО/реперфузия + L-NAME + дистантное прекондиционирование 23,5±1,2 14,15±1,2
КО/реперфузия + L-NAME + ресвератрол (2 мг/кг) 24,1±1,3 17,11±1,2
КО/реперфузия + аминогуанидин (100 мг/кг) + дистантное прекондиционирование 22,8±2,0 14,11±1,2
КО/реперфузия + аминогуанидин (100 мг/кг) + ресвератрол (2 мг/кг) 26,6±1,9 15,45±1,2
КО/реперфузия + глибенкламид (0,4 мг/кг) + дистантное прекондиционирование 24,2±1,5 16,34±1,8
КО/реперфузия + глибенкламид (0,4 мг/кг) + ресвератрол (2 мг/кг) 28,5±1,3 16,95±1,8
Примечание: КО/реперфузия - коронароокклюзия нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне ушка (60 мин) с последующей реперфузией ( 90 мин); ИП - ишемическое прекондиционирование (5 мин); ДИП - дистантное ишемическое прекондиционирование (10 мин) верхней трети бедра;
*р < 0,05 - в сравнении с контролем; # р < 0,05 - в сравнении с серией без фармакологического анализатора.
26,6±1,9%, аминогуанидин и ДИП - 22,8±2,0%. При блокаде АТФ-зависимых калиевых каналов величина зоны некроза в группе животных, получавших глибенкламид и ресвератрол, - 28,5±1,3%, глибенкламид и ДИП - 24,2±1,5%. Уровень тропонина, как и предполагалось, изменяется с размером площади некроза миокарда левого желудочка (таблица).
Исходя из результатов экспериментов, дистантное ишемическое прекондиционирование, фармакологическое прекондиционирование и ресвератрол обладают в равной степени выраженным кардиопротекторным действием.
Кратковременная ишемия миокарда инициирует каскад определенных биохимических процессов в кардиомиоцитах. Эти процессы направлены на защиту миокарда от повреждений, связанных с его ишемизацией. Благодаря этому короткому, но эффективному «курсу закаливания» миокард становится подготовленным к последующей ишемии, в связи с чем он гораздо более успешно защищается от агрессивных факторов, обусловленных ухудшением питания и оксигенации сердца. Этот физиологический феномен, названный ишеми-ческим прекондиционированием, был открыт не так давно, но уже привлек к себе внимание множества ученых. В случае острой ишемии этот механизм может предотвратить развитие инфаркта
миокарда, а если последний все же происходит, ишемическое прекондиционирование обеспечивает меньшие размеры инфаркта, уменьшает вероятность появления аритмии, предохраняет от значительных нарушений функций миокарда левого желудочка, а также уменьшает повреждения миокарда, связанные с реперфузией [10]. К механизмам реализации кардиопротективного действия ресвератрола [6] можно отнести: анти-оксидантный, противовоспалительный, повышающий активность ферментов NOS, стимулирующих ангиогенез. Но один из самых обсуждаемых механизмов - это эффект, опосредованный через прекондиционирование. Каким образом ишемия может сыграть прекондиционирующее, то есть «подготавливающее», действие? Во время кратковременного ишемического эпизода кардиомио-циты начинают выделять аденозин и брадикинин, что, в свою очередь, вызывает активацию универсального внутриклеточного мессенджера — про-теинкиназы С. Под ее действием АТФ-зависимые калиевые каналы гладкомышечных клеток сосудов и кардиомиоцитов, закрытые в норме, открываются. За счет этого происходит защитное укорочение сердечных потенциалов действия. Такой эффект имеет энергосберегающее значение, и при возникновении в ближайшее время повторной ишемии миокарда отмечаются снижение его
метаболической активности, уменьшение скорости распада АТФ, замедление гликогенолиза и снижение скорости нарастания внутриклеточного ацидоза. Благодаря всему этому миокард лучше переносит ишемию, в том числе более длительную и выраженную.
Как видно из нашего исследования, АТФ-зави-симые калиевые каналы являются важным эффек-торным звеном в реализации цитопротекторного действия как дистантного прекондиционирования, так и ресвератрола. Оксид азота играет важную роль в реализации кардиопротекторных эффектов рекомбинантного ресвератрола. И в том, и в другом случае его исинтез осуществляется за счет активации индуцибельной ЫО-синтазы, однако в механизме цитопротекции большое значение имеет эндотелиальная ЫО-синтаза, выполняющая, по всей вероятности, триггерную роль. Доказанная способность ресвератрола активировать протеин-киназы [2] позволяет предположить их триггерную роль в процессе реализации эффектов фармакологического прекондиционирования. Вышеизложенное подтверждает наше предположение о том, что ресвератрол является триггером ишеми-ческого прекондиционирования и может вызывать фармакологическое прекондиционирование, а реализация естественных механизмов защиты от ишемии осуществляется за счет активации АТФ-зависимых калиевых каналов и биосинтеза оксида азота, фармакологических миметиков преконди-ционирования, индуцирующих воспроизводимый и стабильный кардиопротективный ответ и в то же время лишенных серьезных побочных эффектов.
Таким образом:
1. Проведение дистантного ишемического прекондиционирования, введение ресвератрола достоверно относительно контрольной группы животных уменьшало распространенность зоны некроза миокарда левого желудочка.
2. АТФ-зависимые калиевые каналы являются эффекторным звеном в механизме цитопро-текторного действия как дистантного ишемического прекондиционирования, ресвератрола на модели коронароокклюзионного инфаркта миокарда.
3. Блокада эндотелиальной и индуцибельной ЫО-синтазы нивелирует цитопротекторный эф-
фект рекомбинантного ресвератрола на модели коронароокклюзионного инфаркта миокарда, доказывает роль оксида азота в реализации эффектов прекондиционирования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Даниленко Л. М., Покровский М. В., Новиков О. О. Противовоспалительные эффекты дистантного ишемического прекондиционирования в сочетании с рекомбинантным эритропоэтином // Научные ведомости БелГУ. Сер. «Медицина. Фармация». - 2011. - № 4, вып. 13/2. - С. 49-53.
2. Даниленко Л. М., Покровский М. В., Новиков О. О. Триг-герный механизм противоишемического действия эритропоэ-тина и ресвератрола // Научные ведомости БелГУ. Сер. «Медицина. Фармация». - 2012. - № 10, вып. 18/2. - С. 138-142.
3. Колесник И. М., Покровский М. В., Гудырев О. С. Дистантное и фармакологическое прекондиционирование - новые возможности стимуляции неоваскулогенеза // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - № 6. - С. 56-58.
4. Коркушко О. В., Лишневская В. Ю. Эндотелиальная дисфункция // Кровооб^ та гемостаз. - 2003. - № 2. - С. 4-15.
5. Покровский М. В., Кочкаров В. И., Покровская Т. Г. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте // Кубанский научный медицинский вестник. - 2006. - № 10. - С. 72-77.
6. Agnes А., Parratt J. R. A common mechanism in the protective effects of preconditioning, cardiac pacing and physical exercise against ischemia and reperfusion-induced arrhythmias // Exp. clin. cardiol. - 2005. - Vol. 10. № 3. - P. 200-205.
7. Donnely R., Millar-Craig M. W. Cardiac troponins: IT upgrade for the heart // Lancet. - 1998. - Vol. 351. № 9102. -P. 537-539.
8. Constans J., Conri С. Circulating markers of endothelial function in cardiovascular disease// Clin. chim. acta. - 2006. -Vol. 368. № 1-2. - P. 33-47.
9. Lim S. Y., Davidson S. M., Hausenloy D. J. et al. Preconditioning and postconditioning: the essential role of the mitochondrial permeability transition pore // Cardiovasc res. -2007. - Vol. 75. № 3. - P. 530-535.
10. Oldenburg О., Qin Q., Krieg T. et al. Bradykinin induces mitochondrial ROS generation via NO, cGMP, PKG, and mitoKATP channel opening and leads to cardioprotection // Am. j. physiol. heart circ. physiol. - 2004. - Vol. 286. № 1. -P. 468-476.
Поступила 05.10.2015
