CC BY
95
УДК 615.015
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ
EUPHRASIA TATARICA FISCH. EX SPRENG. (SCROPHULARIACEAE)
Т.В. Бомбела, О.А. Кроткова, | В.М. Петриченко, В.Д. Белоногова,
ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия»
Бомбела Татьяна Владимировна - e-mail: tatyana.bombela@yandex.ru
Проведено фармакогностическое изучение Euphrasia tatarica Fisch. ex Spreng. - очанки татарской и обоснована возможность её использования в качестве производящего растения для включения в проект ФС «Трава Очанки». Определены макро- и микроскопические диагностические признаки, установлены числовые показатели для включения в нормативную документацию. Для количественного определения флавоноидов в траве E. tatarica предложен метод дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на цинарозид.
Ключевые слова: Euphrasia tatarica, фармакогностическое изучение, флавоноиды, цинарозид.
Pharmacognostic study of Euphrasia tatarica Fisch. ex Spreng. - Eyebright was carried out, and the possibility of its use as a producing plant for inclusion in the project «Eyebright Herb» was proved. Macroscopic, microscopic characters and numerical values for including in the normative documents were established. Method of differential spectrophotometry in equivalent of cynaroside was proposed for the investigation of quantitative composition of flavonoids in E. tatarica herb.
Key words: Euphrasia tatarica, pharmacognostic study, flavonoids, cynaroside.
Введение
Растения рода Очанка (Euphrasia L.) сем. Норичниковые (Scrophulariaceae Juss.) являются источником высокоактивных природных соединений и имеют длительное применение в народной медицине России и Сопредельных государств [1]. Трава очанки давно и эффективно применяется в научной медицине стран Западной Европы и является фармакопейным лекарственным средством в Польше и Германии [1, 2]. В России реализуется большое количество препаратов на её основе, зарегистрированных в качестве нутрицевти-ков, парафармацевтической продукции, косметических и гомеопатических средств [3, 4]. Несмотря на повышенный интерес к практическому использованию растений рода Очанка, в настоящее время ни один вид не имеет официального статуса в России.
Комплексные исследования, проводимые в Пермской государственной фармацевтической академии, позволили установить, что виды рода Очанка (E. brevipila Burn. & Gremli., E. x reuteri Wettst., E. parviflora Schag.) имеют близкий химический состава, обладают одинаковой фармакологической активностью, сочетающейся с низкой токсичностью, и разработать на их основе проект фармакопейной статьи «Трава очанки» [5]. Использование в качестве сырья других, широко распространенных на территории Уральского региона видов требует проведения дополнительных фармакогности-ческих исследований.
Целью настоящей работы является разработка показателей подлинности и доброкачественности ранее не исследованного вида Euphrasia tatarica Fisch. ex Spreng. - очанки татарской, и обоснование возможности его использования в качестве производящего растения.
Материал и методы
Материалом исследования явилась надземная часть с корнями очанки татарской, заготовленная в фазу цветения - начало плодоношения в 2003-2004 г. Образцы для анали-
за собрали на территории Пермского края: с. Скобелевка (образец 1), окрестности г. Чайковский (образец 2) и Кировской области: пос. Рудничный (образец 3), окрестности г. Кирова (образец 4).
Макро- и микроскопический анализ проводили по методике ГФ XI [6, 11]. Фотографии выполнены с помощью микроскопа «МоИс ОМ-111». Качественный состав флавоноидов изучали методом двумерной хроматографии на бумаге в системах н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2) в первом и 15% уксусная кислота во втором направлении. На хроматограмму наносили извлечение, полученное экстракцией сырья на водяной бане 50% спиртом этиловым в соотношении 1:10 в течение 20 мин. Для идентификации флаво-ноидных веществ хроматограммы просматривали в УФ свете до и после обработки парами аммиака, а также после проявления хромогенными реактивами - 5% спиртовым раствором хлорида алюминия, 2% спиртовым раствором цирконила нитрата. Значение 1^, рассчитанное для каждого вещества, является средним для 5-10 хроматограмм.
Количественное определение флавоноидов в пересчете на цинарозид в извлечениях из травы и органов растений (1:80; 80% спирт этиловый; 20 мин.) проводили методом дифференциальной спектрофотометрии на приборе СФ -2000, в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 382 нм [7]. Товароведческий анализ осуществляли в соответствии с требованиями ГФ XI [6]. Статистическую обработку проводили по общепринятой методике [9, 10].
Результаты и их обсуждение
В результате макроскопического анализа определены внешние признаки сырья и пределы их изменчивости: оли-ственные стебли длиной до 24 см, слабоопушенные, ветвистые, с 2-10 боковыми побегами, иногда вторично ветвящимися. Корни 1,5-3 см длиной, тонкие, ветвистые. Листья супротивные, стеблевые, яйцевидные (длина 0,67+0,04 см, ширина 0,65+0,05 см) и прицветные широкояйцевидные
(длина 0,58+0,04 см, ширина 0,57+0,05 см), с 4-8 зубцами с каждой стороны, складчато-полосатые, с выдающимися с нижней стороны жилками. Соцветие кисть 3,5-8 см длиной; чашечка (длина 0,55+0,06 см) колокольчатая, четырехна-дрезанная, с зубцами сросшимися попарно. Венчик 0,6-0,7 см длиной двугубый, верхняя губа двулопастная с отогнутыми лопастями; нижняя - трехлопастная с выемчатыми лопастями. Тычинок четыре. Плод коробочка - обратнояйцевидной формы (длина 4,80+0,30 мм, ширина 1,95+0,20 мм), притупленная, выемчатая на верхушке (рис. 1).
В результате микроскопического анализа установлены следующие анатомо-диагностические признаки внутреннего строения E. tatarica:
лист на поперечном срезе дорсовентрального строения (рис. 2А). Клетки эпидермы на плоскостном препарате извилистые, длиной от 64 до 100 мкм, шириной от 40 до 72 мкм. Устьица располагаются с обеих сторон листа (амфистомати-ческий тип), окружены 2-4 околоустьичными клетками (аномоцитный тип) (рис. 2Б, В). По краю, жилкам и зубцам встречаются немногочисленные простые одноклеточные волоски, иногда они изогнутые (рис. 2Г). Железистые волоски, состоящие из короткой одноклеточной ножки и двухклеточной головки, располагаются преимущественно с верхней стороны листа по жилкам и по всей поверхности листовой пластинки (рис. 2Д).
Стебель в сечении округло-четырехгранный, беспучково-го строения, покрыт эпидермой (рис. 3А). Первичная кора слабо дифференцирована, состоит из 4-5 рядов клеток: экзодерма представлена пластинчатой колленхимой. Перицикл плохо заметен и состоит из клеток основной ткани. Флоэма вместе с перициклом и камбием составляет 45,8+4,48 мкм, или 7,4% к длине радиуса стебля. Основная масса ксилемы, 18-30 рядов клеток, представлена одревесневшим либриформом и составляет 35,1%, или 327,0+13,32 мкм. Средний диаметр сосудов древесины 20,4+1,48 мкм и составляет 2,2% к длине радиуса. Крупноклетная сердцевина занимает 45,7%. В центральной зоне стебля образуется полость.
Главный и боковые корни округлые на поперечном срезе, имеют вторичное строение (рис. 3Б). Покровная ткань -пробка в комплексе перидерма. Вторичная кора узкая, толщиной 86,6+4,82 мкм, или 14,1% к длине радиуса корня. Камбий выражен слабо. Элементы ксилемы расположены радиальными тяжами, разделены 2-3 рядами сердцевинных лучей. Первичная ксилема плохо различима. Слой клеток ксилемы составляет 539,2+29,03 мкм, или 87,8% к радиусу корня.
Ранее проведенные исследования показали, что преобладающей группой биологически активных веществ рода Euphrasia являются флавоноиды [8]. Учитывая значение фла-воноидов для хемосистематики и терапевтическую ценность данных веществ, оценку доброкачественности сырья травы очанки предложено проводить по их содержанию.
Хроматографические исследования показали, что флаво-ноидный комплекс травы E. tatarica представлен 13 веществами (таблица 1). Вещество 6 (Rf 0,32/0,16) по флюоресценции в УФ свете и значению Rf в сравнении со стандартным образцом идентифицировано как цинарозид.
Изменчивость компонентного состава флавоноидов изучали у образцов, заготовленных в различных регионах
РИС. 1.
Морфологическое строение Е. ЬаЬап'са: А - верхний стеблевой лист; Б - прицветный лист; В - нижний стеблевой лист;
Г- венчик; Д - чашечка; Е - плод.
РИС. 2.
Анатомическое строение листа Е. ЬаЬап'са: А - поперечный срез листа (ув. х400); Б - верхняя эпидерма (ув. х400); В - нижняя эпидерма (ув. х400); Г - простой одноклеточный волосок (ув. х400); Д - железистый волосок (ув. Х1000).
РИС. 3.
Анатомическое строение осевых органов Е. ЬаЬап'са:
А - поперечный срез стебля (ув. Х100); Б - поперечный срез корня (ув. Х100).
России. Из полученных результатов следует, что компонентный состав флавоноидов колеблется от десяти до тринадцати веществ. Наиболее типичными для этого вида являются семь веществ (1, 6, 7, 8, 9, 10, 11), которые встречаются во всех образцах. Значение ^ этих веществ возможно использовать в аналитических целях.
Анализ органов Е. tatarica показал, что максимальное количество флавоноидов содержится в стеблях (от шести до одиннадцати), а минимальное в корнях (от двух до четырех). Флавоноидные соединения 3, 4, 7 накапливаются чаще всего в корнях и стеблях, 8, 11 и 13 в генеративных органах. Цинарозид присутствует во всех органах исследованных образцов.
Полученные данные свидетельствуют о том, что у Е. tatarica наблюдается вариабельность компонентного состава в пределах флавоноидного пула, установленного для данного вида. Наиболее разнообразный состав (13 веществ) обнаружен у образца, собранного в Кировской области.
Флавоноидный комплекс образцов, произрастающих в Пермском крае, представлен 10-12 веществами. Изменчивость состава флавоноидов, вероятнее всего, связана с особенностями биохимических процессов у паразитирующих видов [13].
ТАБЛИЦА 1.
Компонентный состав и хроматографическая характеристика флавоноидных веществ в различных образцах Е. ЬаЬап'са
| № вещества | Значение Rf Образец 1 Образец 2 Образец 3
БУВ,4:01:02 1Л 1 о о а в (V р т и н & О и \© ф т с к .0 н и и и н ф в ц .0 о с ГС са (Ь р т и н & о и \© ф т с к .0 н и и и н ф в ц .0 о с а в (Ь р т и н & о и \© ф т с к .0 н и и и н ф в ц .0 о с
1 0,19 0,29 + + + + + + + + + + + + + +
2 0,23 0,75 + + + + + + + +
3 0,24 0,37 + + + + + + +
4 0,32 0,52 + + + + + + +
5 0,29 0,68 + + + + + + +
6* 0,32 0,16 + + + + + + + + + + + + + + + + + +
7 0,32 0,48 + + + + + + + + +
8 0,42 0,3 + + + + + + + + + + + + + +
9 0,41 0,2 + + + + + + + + + + + + +
10 0,55 0,32 + + + + + + + + + + + + + +
11 0,58 0,56 + + + + + + + + + + + + + + +
12 0,11 0,45 + + + + + + + + +
13 0,07 0,08 + + + +
Примечание: значения Rf стандартного образца цинарозида в системах: БУВ, 4:1:2 - 0,32; СН3СООН,15 % - 0,17.
ТАБЛИЦА 2.
Метрологическая характеристика методики количественного определения суммы флавоноидов в траве Е. ЬаЬап'са
f x S ^/о * (Р,0 Дх е, %
9 5,242 0,297 95 2,26 0,213 ± 4,1
ТАБЛИЦА 3.
Содержание суммы флавоноидов в различных образцах травы Е. іаіап'са
№ п/п Место сбора образца Содержание флавоноидов в пересчете на абсолютно сухое сырье и цинарозид, %
1 Пермский край, с. Скобелевка, суходольный луг 5,76±0,21
2 Пермский край, г. Чайковский, суходольный луг 6,48±0,22
3 Кировская область, пос. Рудничный, окраина леса 5,24±0,21
4 г. Киров, окрестности, суходольный луг 6,61±0,23
Для количественного определения суммы флавоноидов
изучены спектральные характеристики спиртового извлечения из травы Е. tatarica и ГСО цинарозида (рис. 4). Спектр спиртового извлечения Е. tatarica имеет один максимум (328 нм), который незначительно смещается при добавлении в испытуемый раствор алюминия хлористого и натрия ацетата и обусловлен, вероятно, присутствием в изучаемом экстракте гидроксикоричных и ацилхинных кислот [12]. Дифференциальная кривая поглощения извлечения из травы Е. tatarica имеет всего один максимум 382 нм и перекрывается с длинноволновой полосой ГСО цинарозида в присутствии алюминия хлорида и натрия ацетата. Так как интервал между максимумами дифференциального спектра
о
1.0
300 400 X
РИС. 4.
УФ - спектры растворов ГСО цинарозида и спиртовых извлечений из травы Е. ЬаЬап'са: Обозначения: 1 - раствор ГСО цинарозида;
2 - раствор ГСО цинарозида с добавлением алюминия хлорида и натрия ацетата; 3 - дифференциальный спектр ГСО цинарозида с добавлением алюминия хлорида и натрия ацетата;
4 - спиртовое извлечение Е. ЬаЬап'са; 5 - спиртовое извлечение Е. ЬаЬап'са с добавлением алюминия хлорида и натрия ацетата;
6 - дифференциальный спектр комплекса флавоноидов Е. ЬаЬап'са с добавлением алюминия хлорида и натрия ацетата.
корни стебли листья цветки плоды
РИС. 5.
Содержание суммы флавоноидов в органах Е. ЬаЬап'са (образец 3).
поглощения и длинноволновой полосы поглощения стандартного образца не превышает половины полуширины полосы поглощения стандартного образца, то погрешность измерения будет незначительной [14]. Это дает возможность использовать \=382 нм в качестве аналитической.
Метрологическая характеристика рассчитана на основании анализа травы Е. tatarica (образец 3) в десяти независимых повторностях. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют, что ошибка единичного определения суммы флавоноидов в траве Е. tatarica с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,1% (таблица 2).
С использованием адаптированной методики образцы Е. tatarica проанализированы на содержание флавоноидов в сырье и органах (таблица 3, рис. 5). Как следует из полученных данных, содержание флавоноидов в образцах из различных мест произрастания имеет близкое значение и варьирует в пределах от 5,24 до 6,61%. По органам флавоноиды локализованы следующим образом: максимальное количество накапливается в генеративных органах - цветках (от 8,5 до 10,9%), а минимальное в корнях (от 1,1 до 1,96%).
ТАБЛИЦА 4.
Товароведческие показатели травы Е. ЬаЬап'са
постоянным компонентом является цинарозид, его значение Rf возможно использовать в аналитических целях. Вариабельность компонентного состава Е. tatarica находится в пределах флавоноидного пула, установленного для данного вида.
4. Обоснована возможность использования для травы Е. tatarica, методики количественного определения флавоноидов, методом дифференциальной спектрофотометрии, в пересчете на цинарозид. Относительная ошибка среднего результата с достоверной вероятностью 95% находится в пределах 4,1%.
5. В ходе товароведческого анализа установлены нормы числовых показателей: содержание флавоноидов не менее 5%; экстрактивных веществ, извлекаемых 40% спиртом, не менее 40%; влажность не более 10%; золы общей не более 10%; золы нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной не более 10%; органической примеси не более 3%; минеральной примеси не более 1%.
Работа выполнена при финансовой поддержке Губернатора Пермского края и Министерства образования Пермского края. ЦД
Числовые показатели Содержание, % Установленная норма, %
Влажность 6,47+0,201 не более 10%
Зола общая 7,66+2,605 не более 10%
Зола, нерастворимая в 10% растворе НС1 0,075+0,0373 не более 1%
Органическая примесь 1,05+0,44В не более 3%
Минеральная примесь 0,12+0,062 не более 1%
Экстрактивные вещества Экстрагент: Вода 32, 56+1,56В не более 35%
Спирт этиловый 40% 34,26+3,7В1 не более 40%
Спирт этиловый 70% 30,6В+2,11В не более 35%
Спирт этиловый 90% 25,В7+3,440 не более 30%
В ходе товароведческого анализа установлены показатели, характеризующие доброкачественность сырья Е. tatarica (таблица 4). На основании полученных результатов установлены нормы числовых показателей, предложенные для включения в нормативную документацию.
Выводы
1. Проведено морфолого-анатомическое исследование ранее не исследованного вида Е. tataricа и определены диагностические признаки, позволяющие быстро и надежно идентифицировать сырье.
2. Выявленные макро- и микроскопические признаки могут быть рекомендованы для включения в раздел «Внешние признаки» и «Микроскопия».
3. В ходе фитохимического анализа установлено, что фла-воноидный комплекс Е. tatarica представлен 13 веществами,
ЛИТЕРАТУРА
1. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование: Семейства Caprifoliaceae - Plantaginaceae. Л.: Наука, 1990. 328 с.
2. Deutschen Arzneimittel-Codex, Stuttgart, 1997, А - 192.
3. Регистр лекарственных средств России РЛС Аптекарь. Вып. 9. М.: РЛС -
2007.
4. Михайлов И.В. Справочник по гомеопатии. М.: Изд. Дом МСП, 2000. 272 с.
5. Сухинина Т.В. Фармакогностическое изучение растений рода очанка Дис. ... канд. фарм. наук. Пермь. 2002. 200 с.
6. Государственная фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. 11-е изд., доп. М.: Медицина, 1989. 399 с.
7. Петриченко В.М., Сухинина Т.В., Фурса Н.С. Спектрофотометрический метод определения содержания флавоноидов в Euphrasia brevipila Burn. et Gremli. Раст. ресурсы. 2002. Т. 38. Вып. 2. С. 104-109.
8. Сухинина Т.В., Петриченко В.М., Белоногова В.Д., Шестакова Т.С. Флавоноиды рода Euphrasia L. Перспективы развития естественных наук в высшей школе: Материалы междунар. науч. конф., посвящ. 80-летию образования ЕНИ при ПГУ (18-22 сентября 2001 г.). Пермь. 2001. Т. 1. С. 206-210.
9. Зайцев Н.Г. Математическая статистика в экспериментальной ботанике. М.: Наука, 1984. 424 с.
10. Шмидт В.М. Математические методы в ботанике. Л.: Наука, 1984. 287 с.
11. Долгова А.А., Ладыгина Е.Я. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии. М.: Медицина, 1977. 275 с.
12. Бандюкова В.А. Фенолокислоты растений их эфиры и гликозиды. Химия природ. соединений. 1983. № 2. С. 271-275.
13. Бейлин И.Г. Паразитизм и эпифитотиология. М.: Наука, 1986. 351 с.
14. Ловцева Е.А. Совершенствование способов контроля качества лекарственных средств производных пурина N - гликозидной структуры: Автореф.
. канд. дис.фармац. наук. Пятигорск. 1993. 18 с.
