CC BY
111
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія, медицина Visnik Dnipropetrovs’kogo universitetu. Seria Biologia, medicina Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, medicine
Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Med. 2014. 5(1), 3-б.
doi:10.15421/021401
ISSN 2310-4155 print ISSN 2312-7295 online
www.medicine.dp.ua
УДК 615.218.2.099:611-018.1-019
л • •• ••• • • •
Оцінка цитотоксичної дії антигістамінних препаратів лоратадину та дезлоратадину з використанням тест-об’єкта - сперміїв бугаїв
О.Б. Кузьмінов1, Д.Д. Остапів2, Т.А. Альохіна1
1 Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, Львів, Україна 2Інститут біології тварин НААН, Львів, Україна
Оцінено цитотоксичний вплив фармакологічних субстанцій для виробництва вітчизняних антигістамінних препаратів лоратадину та дезлоратадину. Як тест-об’єкт використано суспензію сперміїв бугая. Проби сперми ділили на контрольну (розріджену фосфатно-сольовим буфером) і дослідні з додаванням у фосфатно-сольовий буфер лоратадину у дозах 1/500 LD50 (12,3 мг), 1/100 LD50 (61,5 мг) та LD50 (6150 мг) і дезлоратадину 1/500 LD50 (1,25 мг), 1/100 LD50 (6,25 мг) та LD50 (625 мг). Визначали виживання сперміїв до припинення прямолінійного поступального руху у збереженій за температури +2.. .+5 °С спермі, дихальну активність (ex tempore) - полярографічно у термостатованій комірці (38,5 °С) об’ємом 1,0 мл з автоматичною реєстрацією перебігу процесу потенціометром; відновну активність - потенціометрично з використанням системи відкритих мікроелектродів, які вставляли в термостатовану полярографічну комірку. Виживання сперміїв у спермі за дії лоратадину нижче показників контролю на 10,0-30,0%, за дії дезлоратадину - на 5,3-52,7%. Дихальна та відновна активність сперми під вливом лоратадину знижуються відповідно на 20,5-61,5% і 80,0-98,0%, під впливом дезлоратадину відповідно на 16,2-80,7% і 12,0-60,0% порівняно з контролем.
Ключові слова: лоратадин; дезлоратадин; цитотоксичний вплив; спермії бугаїв
Evaluation of cytotoxic action of antihistamines - desloratadine and loratadine -using bulls spermatozoa as a test object
O. Kuzminov1, D. Ostapiv2, T. Alekhina1
1Danylo Halytskyy Lviv National Medical University, Lviv, Ukraine 2Institute of Animal Biology of NAAS, Lviv, Ukraine
Antihistamines with active ingredients of loratadine and desloratadine are produced by Ukrainian pharmaceutical industry. According to the law, ther are assessed for their potential danger to human health and the environment, including alternative test objects. Evaluation has been carried out with regard to cytotoxic effect of pharmacological substances (loratadine and desloratadine) using the bull sperm suspension as test objects, standardized and highly sensitive to toxic substances. Sperm was divided into the control sample (dissolved by phosphate-buffered saline) and the investigated sample. Loratadine was added to phosphate-buffered saline in doses of 1/500 LD50 (12.3 mg), 1/100 LD50 (61.5 mg) and LD50 (6150 mg). Desloratadine doses were 1/500 LD50 (1.25 mg), 1/100 LD50 (6.25 mg) and LD50 (625 mg). Survival of spermatozoa was defined until termination of rectilinear forward movement in sperm intacted at +2.+5 °C. Respiratory activity (ex tempore) was defined in 1.0 ml thermostated cell (temperature of 38.5 °C) by polarography with the automatic registration of process flow by potentiometer; restorative activity was defined potentiometrically, using the open microelectrodes that were inserted in thermostated polarographic cell. Survival of spermatozoa in the sperm under the impact of loratadine in doses of 1/500 LD50 and 1/100 LD50 is respectively 136.0 ± 26.2 hours and 144.0 ± 19.6 hours. Adding LD50 dose of loratadine reduced survival to 112.0 ± 26.2 hours, which is lower than the control (160.0 ± 26.1 hours), respectively, by 10.0-15.0 and 30.0%. Loratadine reduces the respiratory activity of sperm: in the dose of 1/500 LD50 by 20.5%, in the dose of 1/100 LD50 - by 43.6%, and that of 100 LD50 - by 61.5% compared to the control.
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, вул. Пекарська, 69, Львів, 79010, Україна. Lviv National Medical University of Danylo Halytskyy, Pekarska str., 69, Lviv, 79019, Ukraine.
Tel.: +38-032-260-09-06. E-mail: toxcentr@rambler.ru
Інститут біології тварин НААН, вул. Василя Стуса, 38, Львів, 79034, Україна.
Institute of Animal Biology of NAAS, V. Stusa str., 38, Lviv, 79019, Ukraine.
Tel.: +38-032-270-23-89, E-mail: inenbiol@mail.lviv.ua
Restorative sperm activity under the impact of the loratadine reduced by 84.0% (dose of 1/500 LD50), 98.0% (dose of 1/100 LD50), 80.0% (dose LD50) compared to controls. The survival of spermatozoa in the sperm under desloratadine action in the dose of 1/500 LD50 is 144.0 і 19.б hours (10.0% reduction compared with the control - 152.0 і 23.б hours), in the dose of 1/100 LD50 - 13б.0 і 2б.1 hours (15.0% reduction), in the dose of LD50 - 72.0 і 19.б hours (30.0% reduction). The intensity of oxygen consumption by sperm reduced by 1б.2% when adding desloratadine in the dose of 1/500 LD50, by 38.8% in the dose of 1/100 LD50 and by 80.7% - in the dose of LD50, compared with the control. Inhibition of respiratory activity is accompanied by decreasing in the transport of protons and electrons from spermatozoa into the extracellular medium, that manifests decreasing of reconstructive activity when the dose of desloratadine is 1/500 LD50 (by 12.0%), 1/100 LD50 (by 40.0%) and LD50 (by б0,0%) compared with the control.
Keywords: loratadine; desloratadine; cytotoxic effect; bull sperm
Вступ
Антигістамінні препарати з діючими речовинами ло-ратадин і дезлоратадин займають одну з провідних позицій за обсягом споживання на українському фармацевтичному ринку. Широке використання вказаних препаратів зумовлене їх властивостями (гальмування виходу утворених і заново синтезованих медіаторів на рівні клітини (Genovese et al., 1997)) і доведеною ефективністю у випадку лікування алергічного риніту та кропивниці, відсутністю негативного впливу на репродуктивну функцію (McIntyre et al., 2003), стійкістю лікарських форм (Karen et al., 2013). Виявлено також позитивний вплив лоратадину як модифікатора радіаційної відповіді під час лікування раку (Soule et al., 2010). Дія лоратадину та дезлоратадину на метаболізм клітин опосередкована низькою здатністю до взаємодії з мембранозв’ язаним фосфорильованим глікопротеїном (170 кДа; P-GP) порівняно з іншими антигістамінними препаратами (Wang Erjia et al., 2003).
Серед зарубіжних виробників на українському фармацевтичному ринку представлені препарати виробництва США, Великобританії, Індії, Угорщини, Швейцарії, Канади (Zaychenko et al., 2012). Випуск генеричних версій розпочато на ПАТ «Лекхім-Харків» (м. Харків), ПАТ «Фармак» (м. Київ), ПАТ «Київмедпрепарат» (м. Київ), ПАT «Фармацевтична фірма “Дарниця”» (м. Київ). Промислове виробництво зумовлює проведення токсикологічної оцінки впливу фармакологічних субстанцій лоратадину та дезлоратадину на працівників з обґрунтуванням допустимого рівня вмісту препаратів в об’єктах довкілля.
За правилами нового Європейського законодавства, яке набуло чинності у 2007 році, до переліку обов’язкових методів оцінки потенційної небезпечності хімічних речовин для здоров’я людини та навколишнього середовища повинні бути включені методи оцінки токсичності на альтернативних тест-об’єктах (Dmytrukha, 20i3; Enayetallah et al., 2013).
Поширені альтернативні методи досліджень із використанням рухливості статевих клітин як тест-об’ єкта (Almova and Begieva, 2012; Nemkova et al., 2013).
Високою чутливістю до токсичних речовин володіє суспензія сперміїв бугая, яка широко використовується у практиці штучного запліднення і є стандартизованою. Переваги даного методу дозволили поширити його в медицині та ветеринарії під час токсикологічних дослі-дженнь (Muzyka et al., 2011).
Мета статті - з’ ясувати наявність цитотоксичної дії лоратадину та дезлоратадину за тривалістю виживання сперміїв та інтенсивністю окисних процесів у спермі бугаїв.
Матеріал і методи досліджень
Лоратадин - етиловий ефір-4-(8-хлор-5,б-дигідро-ПН-бензо-^^циклогепта-^Д-Цтридин-П-шден)-!-піперидинкарбонової кислоти. Синоніми - Веро-Лоратадин, Кларитин, Ломелан, Лоратин, Кларотадин. CAS № 79794-75-5. Емпірична формула - С^Н^^Ю^ молекулярна маса - 382,9. За зовнішнім виглядом це порошок білого кольору, помірно розчинний у воді, дуже мало розчинний у гексані, практично нерозчинний у спирті та хлороформі. Температура плавлення +131...+137 “С. Вміст основної речовини - 98,5-101,0% у перерахунку на суху речовину. Агрегатний стан у повітрі - аерозоль дезінтеграції. Виробник субстанції «Farmachem SA Chem Limited», Індія. Середньосмерте-льна доза (LD50) для білих щурів становить б 150 мг/кг.
Дезлоратадин - 8-хлор-б,11-дигідро-11-(4-пшериди-нілиден)-5Н-бензо^^циклогєш^іД-Ь]піридин. Синоніми - Делот, Кларамакс, Кларинекс, Ларинекс, Лоратек, Лордестин, НеоКларитин, Едем, Еридез, Еріус, Еслотин. CAS № 100б43-71-8. Емпірична формула - С^^lN^ молекулярна маса - 310,8. За зовнішнім виглядом це порошок від білого до кремового кольору, помірно розчинний у воді, розчинний в етиловому та метиловому спирті, диметилсульфоксиді, хлороформі. Температура плавлення +155...+160 “С. Вміст основної речовини -98,0-102,0% у перерахунку на суху речовину. Агрегатний стан у повітрі: аерозоль дезінтеграції. Виробник субстанції - «Cadila Healthcare LTD», Індія. LD50 для білих щурів - б25 мг/кг.
Для досліджень використовували свіжоотримані еякуляти бугаїв таких фізіологічних характеристик: об’ єм 4-5 мл, концентрація сперміїв 0,7-0,9 х 109 клітин/мл, кількість живих статевих клітин - 70-85%. Для оцінювання та характеристики дії фармакологічних субстанцій проби сперми ділили на контрольну, розріджену фосфатно-сольовим буфером (ФСБ; NaCl - 0,8 г, KCl - 0,02 г, Na2HPO4 - 0,11 г, KH2PO4 - 0,02 г, MgCl2 - 0,01 г, Н2О -до 100 мл) та дослідні, із додаванням у ФСБ лоратадину у дозах 1/500 LD50 (12,3 мг), 1/100 LD50 (61,5 мг) та LD50 (6150 мг) і дезлоратадину - 1/500 LD50 (1,25 мг), 1/100 LD50 (б,25 мг) та LD50 (б25 мг). Визначали виживання сперміїв (год) до припинення прямолінійного поступального руху у збереженій за температури +2.+5 “С спермі, дихальну активність (ex tempore) - полярографічно (нг-атом О/0,1мл сперми (С) х хв) у термостатованій комірці (температура 38,5 “С) об’ємом 1,0 мл з автоматичною реєстрацією перебігу процесу потенціометром; відновну активність - потенціометрично (mV/0,1 мл С х хв) із використанням системи відкритих мікроелектродів, які вставляли у термостатовану полярографічну комірку
(БЫоЙз й аі., 1980). Різницю між вибірками вважали статистично вірогідною за Р < 0,05 (РІокМшкіу, 1970).
Результати та їх обговорення
Виживання сперміїв у спермі за дії лоратадину в дозах 1/500 ЬБ50 та 1/100 ЬБ50 майже однакове (136,0— 144,0 год), а у разі додавання лоратадину в дозі ЬБ50 -мінімальне (112,0 ± 26,2 год), що нижче показників контролю, відповідно, на 10,0-15,0% та 30,0% (табл. 1).
Кореляційне відношення для виживання сперміїв за наростаючих доз лоратадину слабке (п2 = 0,141). Лората-
станщї зменшують відновну активність сперми. При цьому лоратадин у дозі 1/500 ЬБ50 знижує величину показника на 84,0%, у дозі 1/100 ЬБ50 - на 98,0% (Р < 0,05), а у разі додавання лоратадину на рівні ЬБ50 зниження становило 80,0% порівняно з контролем. Кореляційне відношення для відновної активності сперми за наростаючих доз лоратадину середньої сили (п2 = 0,581).
За дії наростаючих доз дезлоратадину (1/500 ЬБ50, 1/100 ЬБ50 і ЬБ50) величина фізіологічного показника знижується, відповідно, на 5,3, 10,6 і 52,7% (табл. 2). При цьому різниця між величинами контролю та за дози дезлоратадину ЬБ50 статистично вірогідна (Р < 0,05). Вплив наростаючих доз дезлоратадину на виживання
дин знижує дихальну активність сперми, ггроте сила сперміїв середній по силі (п2 = 0,400).
впливу на досліджуваний показник мала (п = 0,255).
Однак наростаючі дози вказаної фармакологічної суб-
Таблиця 1
Виживання сперміїв та інтенсивність окисних процесів у спермі бугаїв за дії лоратадину (п = 3; М ± т)
Показники
Виживання сперміїв, год Споживання кисню, нг-атом О/(0,1 мл С х хв) Відновна активність, mV/(0,1 мл С х хв)
Умови інкубування сперми Контроль (ФСБ) ФСБ + 1/500 ЬБ50 ФСБ + 1/100 ЬБ50 160,0 ± 26,1 136,0 ± 26,2 144,0 ± 19,6
3,9 і 1,34 3,1 і 0,87 2,2 і 0,74
2,5 і 0,82 0,4 і 0,26 0,05 і 0,01*
Примітка: * - різниця статистично вірогідна порівняно з контролем за Р < 0,05.
ФСБ + LD50 112,0 і 26,2
1,5 і 0,48 0,5 і 0,39
Кореляційне відношення, П2 0,141
0,255
0,581
Таблиця 2
Виживання сперміїв та інтенсивність окисних процесів у спермі бугаїв за дії дезлоратадину (п = 3; М ± т)
Кореляційне
Умови інкубування сперми Контроль (ФСБ) ФСБ + 1/500 ЬБ50 ФСБ + 1/100 ЬБ50 152,0 ± 23,6 144,0 ± 19,6 136,0 ± 26,1
Показники
Виживання сперміїв, год Споживання кисню, нг-атом О/(0,1 мл С х хв)
Відновна активність, шУ/(0,1 мл С х хв)
Примітка: * - різниця статистично вірогідна порівняно з контролем за Р < 0,05, ** - за Р < 0,01.
3,1 і 0,47 2,5 і 0,47
2,б і 0,бб 2,2 і 0,36
1,9 і 0,61 1,5 і 0,10
ФСБ + LD50 72,0 і 19,б*
0,6 і 0,25** 1,0 і 0,39
відношення, П 0,400
0,513
0,4бб
Більшими змінами характеризуються величини дихальної та відновної активностей сперми за впливу вказаної фармакологічної субстанції. Інтенсивність споживання кисню спермою за умови додавання дезлоратадину знижується на 16,2% за дози препарату 1/500 ЬБ50, на 38,8% - за дози препарату 1/100 ЬБ50 і на 80,7% порівняно з контролем за дози ЬБ50 (Р < 0,05). Гальмування дихальної активності супроводжується зменшенням транспорту протонів та електронів зі сперміїв у позаклітинне середовище, що проявляється зниженням відновної активності за дози дезлоратадину 1/500 ЬБ50 на 12,0%, за дози дезлоратадину 1/100 ЬБ50 - на 40,0% і за умови додавання препарату в дозі ЬБ50 - на 60,0%, порівняно з контролем. Вплив наростаючих доз дезлора-тадину на дихальну та відновну активність сперми середній за силою (відповідно, п2 = 0,513 і 0,466).
Таким чином, досліджені фармакологічні субстанції у спермі проявляють цитотоксичний вплив, який характеризується пониженою інтенсивністю окисних процесів, імовірно, зниженим функціонуванням ланцюга дихання мітохондрій і ресинтезом АТФ, що зумовлює втрату рухливості та зменшення тривалості виживання сперміїв.
Висновки
Цитотоксична дія лоратадину та дезлоратадину залежить від дози та характеризується порушенням окисних процесів сперми, що проявляється зменшеним споживанням кисню та пониженою відновною активністю. Обґрунтовуючи допустимий рівень вмісту препаратів у повітрі робочої зони, необхідно провести дослідження їх гонадотоксичного впливу на лабораторних тваринах.
Бібліографічні посилання
Almova, A.A., Begieva, M.B., 2012. Opredelenie toksicheskogo deystviya polimernykh materialov na osnove N,N-diallilaminokislot [Definition of toxic action of polymeric materialson the basis of N,N-dasllyamino acids]. Fundamen-tal’nye Issledovaniya 9, 539-541(in Russian).
Dmytrukha, N.N., 2013. Kultura kletok kak in vitro model v toksikologicheskikh issledovaniyakh [Cell culture as in vitro model in toxicology studies]. Medix. Anti-Aging. 3, 50-55 (in Russian).
Enayetallah, A.E., Puppala, D., Ziemek, D., Fischer, J.E., Kantesaria, S., Pletcher, M.T., 2013. Assessing the translat-
ability of in vivo cardiotoxicity mechanisms to in vitro models using causal reasoning. BMC Pharmacol. Toxicol. 14, 46-58.
Genovese, A., Patella, V., De Crescenzo, G., De Paulis, A., Spadaro, G., Marone, G., 1997. Loratadine and desethoxyl-carbonyl-loratadine inhibit the immunological release of mediators from human fceri+cells. Clin. Exp. Allergy 27(5), 559-567.
Karen, H.D., Patel, D.M., Jasakiya, A.R., Patel, C.N., 2013. Development of oral strip for loratadine and in vitro evaluation. Int. J. Pharm. Pharmacol. 2(8), 125-130.
McIntyre, B.S., Vancutsem, P.M., Treinen, K.A., Morrissey, R.E., 2003. Effects of perinatal loratadine exposure on male rat reproductive organ development. Reprod. Toxicol. 17(6), 691-697.
Muzyka, V.P., Atamanjuk, I.S., Chajkovs’ka, O.I., Panych, O.P., Sergijenko, O.I., Ostapiv, D.D., Jaremchuk, I.M., Kuzmina, N.V., Ostapiv, R.D., 2011. Do ocinjuvannja toksychnoi’ dii’ polimernyh vyrobiv z vykorystannjam test-ob’jektu-spermii’v bugai’v [Evaluation of toxic effects of polymer products using the test object bull spermatozoa]. Naukovo-Tehnichnyj Bjuleten’ Instytutu Biologii’ Tvaryn i DNDKI Vetprepartiv ta Kormovyh Dobavok 12(3), 414-420 (in Ukrainian).
Nemkova, I.N., Guskova, T.A., Syubaev, R.D., Engalycheva, G.N., Vasiliev, A.N., 2013. Issledovanie in vitro tsitotoksi-cheskogo deystviya nesteroidnykh protivovospalitel’nykh sredstv, ispol’zuemykh v sostave kombinirovannykh
lekarstvennykh preparatov [In vitro studi on cytotoxic effect of non-steroidal anti-inflammatory agents used in the composition of combined medicinal preparations]. Toksiko-logicheskiy Vestnik 5, 13-16 (in Russian).
Plokhinskiy, N.A., 1970. Biometriya [Biometry]. MSU, Moscow (in Russian).
Shtolts, K.F., Mosolova, I.M., Dronova, L.A., 1980. Am-perometricheskoe opredelenie ferrotsianida v prisutstvii subkletochnykh struktur [Amperometric definition of ferro-cyanide in the presence of subcellular structures]. Bi-okhimicheskie Metody. Nauka, Moscow, 147-150 (in Russian).
Soule, B.P., Simone, N.L., DeGraff, W.G., Choudhuri, R., Cook, J.A., 2010. Loratadine dysregulates cell cycle progression and enhances the effect of radiation in human tumor cell lines. Radiat. Oncol. 5(8), 1-12.
Wang, E., Casciano, C.N., Clement, R.P., Johnson, W.W., 2003. Evaluation of the interaction of loratadine and desloratadine with P-glycoprotein. DMD 29(8), 1080-1083.
Zaychenko, G.V., Yakovleva, L.V., Bryukhanova, T.O., Kolos, O.M., 2012. Suchasni protyalergichni preparaty: Kliniko-farmakologichni ta farmakoekonomichni osoblyvosti [Modern antiallergic drugs: Clinical and pharmacological and pharmacoeconomical characteristics]. Ukrai’ns’kyj Me-dychnyj Chasopys 6, 134-136 (in Ukrainian).
Надійшла до редколегії 10.02.2014
