CC BY
227
КАЧЕСТВО И БЕЗОПАСНОСТЬ
I ■
Экспресс-анализ Сахаров
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
М.И.Соколов, Н.Д.Верзилина, О.Б.Рудаков, В.И.Толоконников, А.П.Никульшин, К.К.Полянский
Воронежский государственный аграрный университет им. К.Д. Глинки Воронежская государственная технологическая академия
При проведении опытов по селекции в растениеводстве и при переработке сельхозсырья возникает необходимость определения в растениях содержания различных сахаров. Один из наиболее эффективных методов решения этой задачи - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [1].
Нами испытаны возможности экспрессного определения углеводов в рас-
Рис. 1. Хроматограмма 2-й фракции экстракта стевиозида: А - суперпозиция трех пиков, разделенная с применением компьютерных технологий (1 - глюкоза, 2 - сахароза); 3 - фракция стевиозидов
тительных экстрактах с помощью ВЭЖХ с рефрактометрическим детектированием (хроматограф 1_Р-250, Чехия) на колонке 300x4,8 мм, заполненной сорбентом Нуклеосил ЫИ2, зернением 10 мкм. В качестве элюента использовали деионизированную воду.
Как правило, ВЭЖХ углеводов на аминопропильной фазе проводят с использованием смесей ацетонитрил -вода. Применение чистой воды имеет свои преимущества и недостатки. Преимущества в том, что существенно сокращается время анализа, подвижная фаза становится нетоксичной, существенно уменьшается стоимость анализа. За эти явные преимущества приходится расплачиваться некоторым ухудшением селективности разделения. Время удерживания моносахаридов становится практически одинаковым. Вместе с тем сохраняется возможность разделения моно- и дисаха-ридов и олигосахаридов (рис. 1 и 2). Ниже представлены размеры их молекул, рассчитанные по программе С1"1ет01"Нсе 2002 [2].
Размеры молекул сахаров
Рис. 2. Хроматограмма водного экстракта из сахарной свеклы: 1 - глюкоза; 2 - сахароза
Вещество D , нм max'
L (+) рабиноза 0,54
L ( + ) рамноза 0,65
Глюкоза 0,66
Маннит 0,69
Сахароза 0,98
Мальтоза 1,00
Стевиозид 2,10
В выбранных условиях ВЭЖХ последовательность удерживания углеводов определяется молекулярной массой и степенью гидроксилирования молекулы. Чем больше число гидроксильных групп, тем с большим числом аминогрупп на модифицированной поверхности сорбента взаимодействует анализируемый углевод.
Одна из важных проблем анализа экстрактов углеводов - пробоподго-
товка образцов для ввода в жидкостный хроматограф. Наряду с низшими углеводами в экстракты попадают растворимые полисахариды, которые следует предварительно отделять, так как они прочно сорбируются на колонке и быстро приводят ее в негодность. Так, введение пяти плохо отфильтрованных проб в хроматограф вызывает рост давления на входе колонки с 3,5 до 7,5 МПа. В нашей практике после прямого введения примерно ста проб растворов сахаров давление на входе в колонку выросло в пять раз и колонка перестала делить компоненты пробы.
Из приведенных примеров видно, как важно исследуемый объект освободить от твердых частиц, малорастворимых и растворимых высокомолекулярных примесей. Оптимально достичь этой цели можно путем твердофазной экстракции. Как следует из данных [3], фильтры Шотта не применимы для этих целей. С их помощью можно отфильтровать только грубые взвеси. Бумажные фильтры имеют также достаточно большой размер пор [4].
Наиболее подходящий метод подготовки пробы - твердофазная экстракция. Для проведения твердофазной экстракции используют шприцы (патроны), дно которых заполнено слоем сорбента. Для удаления полисахаридов пригоден сорбент с такой же привитой фазой (тот или иной силикагель с привитой фазой NH2). Сорбент в патроне для твердофазной экстракции смачивают смесью ацетонитрил - вода (80:20), затем водой. После чего вводят образец. На 6 мл сорбента - 1 мл пробы. Затем патрон промывают водой. Важно, чтобы олигосахариды не проскакивали, а оставались на сорбенте в патроне. При смывании исходят из расчета 1 мл воды на 2-4 мл сорбента. Для ускорения твердофазной экстракции используют вакуум, так как сорбент в патроне имеет мелкое зернение. Патрон вставляют в колбу Бунзена и подключают к вакуумному насосу. Можно применять специальные приспособления, так называемые «мэнифалды» (от англ. vacuum manifolds), в которые одновременно можно вставлять большое количество патронов для извлечения проб. Скорость элюирования - 1-2 мл/мин. Полезно на 1 мин задерживать элюент в патроне перед элюированием.
В настоящее время методы твердофазной экстракции для концентрирования и адсорбционной очистки пробы с целью ее дальнейшего хромато-графического анализа получили широкое распространение в подготовке проб из биообъектов [5]. На рис. 1 и 2 представлены хроматограммы экст-
QUALITY AND SAFETY
ракта углеводов из стевии и для сопоставления - из сахарной свеклы.
Экстракцию сахаров из стевии осуществляли следующим образом: в центрифужные пробирки помещали измельченную растительную массу в количестве 1 г; экстракцию проводили 70%-ным этанолом; первую экстракцию проводили 4 ч с периодическим перемешиванием стеклянной палочкой содержимого центрифужной пробирки, затем центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин; вторую - четвертую экстракцию также осуществляли 70%-ным этанолом при периодическом перемешивании осадка в растворителе с последующим центрифугированием при тех же условиях.
Объединенную насадочную жидкость очищали на колонке, заполненной ионообменными смолами.
Пробу сахаров из свеклы готовили по методике [6]. Хроматограммы регистрировали при расходе подвижной фазы 0,3 мл/мин, объем пробы 20 мкл (рис. 2).
Актуальность разработки таких методик определяется тем, что дорогие природные подсластители (стевиози-ды) фальсифицируются дешевыми синтетическими подсластителями - ас-
партамом или сахарином, необходим контроль за степенью извлечения сте-виозидов из исходного сырья. Применение чистой воды в целом повышает технико-эксплуатационные характеристики метода хроматографического контроля. В настоящее время производят колонки, в которых за счет тщательной прививки модифицирующих групп колонки с аминофазой поверхность сорбента лучше смачивается водой, что позволяет использовать при хроматог-рафировании только воду без потери селективности разделения [4].
Таким образом, нами разработана и испытана на модельных и реальных пробах упрощенная экспресс-методика контроля моно-, дисахаридов и их производных в экстрактах из растительного сырья.
ЛИТЕРАТУРА
1. Рудаков О.Б, Родионова И.С., Бочарова О.И. Современное состояние количественного контроля углеводов в пищевых продуктах методами высокоэффективной жидкостной хроматографии // Хранение и переработка сельхозпродукции. 1999. № 2. С. 52-56.
2. Рудаков О.Б., Соколов М.И., Болдырев С.Ю., Шестаков А.С. Гель-проникающая хроматография смесей оли-го-, ди- и моносахаридов//Известия вузов. Пищевая технология. 1999. № 5-6. С. 92-94.
3. Воскресенский В.И. Техника лабораторных работ. - М.: Химия, 1969.
4. Мусакин А.П., Рагинский Ф.Ю., Суглобова К.Д. Оборудование химических лабораторий. - Л.: Химия, 1978.
5. Сычев К.С., Даванков В.А. Материалы и методы пробоподготов-ки в хроматографии: твердофазное концентрирование и адсорбционная очистка / Сорбционные и хрома-тографические процессы. - Воронеж: ВорГУ, 2004, т. 4, вып. 1, с. 5-28.
6. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Яроси Н.П., Перуанский Ю.В., Луков-никова Г.А., Иконникова М.И. Методы биохимического исследования растений. - Л.: Агроиздат, 1987.
7. Рудаков О.Б., Востров И.А., Федоров С.Ф., Филиппов А.А., Селеменев В.Ф., Приданцев А.А. Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии. - Воронеж: Водолей, 2004.
Комплектация исследовательских лабораторий и лабораторий контроля качества
Тест-наборы и реактивы для анализа воды Расходные материалы для хроматографии и других физико-химических методов анализа Аналитические приборы Лабораторная посуда и вспомогательные приборы (рН-метры, весы, термостаты, печи, мешалки и др.) Реактивы для биохимических и микробиологических исследований, питательные среды Пищевые добавки и эфирные масла
115230, Москва,Каширское ш., д. 9, корп. 3
Тел.: (095) 728-4192, 777-8495, факс: (095) 742-8341 E-mail: mail@chimmed.ru http://www.chimmed.ru
