CC BY
50
УДК 616-092.9.259-091.8:616.831-006.484
Экспериментально-морфологическая оценка чувствительности глиом головного мозга к а-интерферону
Семенова В.М., Лисяный Н.И., Любич Л.Д., Стайно Л.П.
Институт нейрохирургии им.акад. А.П. Ромоданова АМН Украины, г. Киев, Украина
При исследовании эффективности прямого действия а-интерферона (а-ИФН) на клетки глиом (n=62) in vitro установлена их разная чувствительность к цитокину в зависимости от его концентрации. Выявлено снижение чувствительности глиом к цитотоксическому действию а-ИФН по мере увеличения степени их злокачественности. Высокочувствительные к а-ИФН глиомы составляют 45% — среди доброкачественных астроцитом, 30 и 27,3% — среди астроцитом III и IV степени анаплазии. Наиболее низкая чувствительность опухолевых клеток к действию а-ИФН выявлена в 36,3% глиобластом, 25% анапластических астроцитом III степени злокачественности и 15% астроцитом II степени злокачественности.
Ключевые слова: а-интерферон, противоопухолевые свойства, цитотоксическое действие, апоптоз, глиомы головного мозга.
Одним из перспективных путей повышения эффективности комплексного лечения опухолей головного мозга является разработка методов использования препаратов интерферонов (ИФН). ИНФ (а, р, у) относятся к группе цитокинов, проявляющих противовирусное, антипролифе-ративное, иммуномодулирующее действие и др. Благодаря многообразию физиологических функций ИФН играют контрольно-регулирующую роль в поддержании гомеостаза [8]. Механизм противоопухолевого действия ИФН многосторонний, включает прямой цитолиз клеток опухоли, подавление их подвижности, угнетение ангиогенеза и экспрессии онкогенов в опухолях, а также активацию генов-супрессоров опухолевого роста. Кроме того, ИФН способны активировать гены, обладающие проапоптотическим действием, и регулировать дифференцировку клеток опухоли [5].
В общей онкологии препараты ИФН широко применяют в качестве дополнительной биотерапии и рассматривают как важный элемент оптимизации комплексного лечения больных с различными злокачественными опухолями [8]. В отличие от этого, данные о применении интерферонотерапии при опухолях мозга малочисленны, ее результаты неоднозначны [29].
В связи с этим в настоящее время продолжаются клинические исследования антипроли-феративной активности очищенных рекомби-нантных препаратов а-ИНФ и синтетического Р-ИФН в отношении опухолей мозга, в которых показано их угнетающее действие на рост злокачественных глиом [19, 28]. Изучены также возможности лечения глиом с помощью гена Р-ИФН, терапевтический эффект которого обусловлен участием в иммунном ответе натуральных киллеров [25, 27].
По данным японских авторов, у 35 больных, которым внутривенно вводили а-ИФН, изменился фенотип лимфоцитов периферической крови: через 24 ч уменьшалось количество лимфоцитов-супрессоров (СД4^еи8) и увеличивалось количество лимфоцитов-хелперов (СД4^еи8_). Однако трактовка этого феномена в работе не приведена [22].
Многократное (16 раз) введение 1х106 ед а-ИФН в ложе удаленных СО2-лазером глиоб-ластом у 35 больных не влияло на показатель их выживаемости по сравнению с таковым при использовании общепринятых методов лечения [24].
Недостаточная эффективность одной интер-феронотерапии у нейроонкологических больных обусловлена особенностями трансдукции антигенного сигнала в клетках глиом. Предполагают, что применение низкомолекулярного индуктора а-ИФН амиксина при опухолях мозга целесообразно только в составе комбинированного лечения больных с учетом исходного количества лимфоцитов в периферической крови, которое должно быть не менее 21% [7].
Представляют интерес результаты экспериментальных исследований антипролифера-тивной активности ИФН in vitro. На линейных и первичных культурах различных опухолей мозга установлено повреждающее действие Р-ИФН на клетки глиом в концентрации 30-3000 мкг/мл при их инкубации с цитокином в течение 2-6 сут [17].
Препараты а/р ИФН в культуре глиомы С-26 мышей в течение 1-4 сут вызывали инги-бицию ее роста вследствие накопления клеток опухоли в S-фазе клеточного цикла, что сопровождалось повышением экспрессии глиального кислого фибриллярного белка в 3 раза и, следо-
вательно, изменением фенотипа клеток опухоли в сторону их дифференцировки [23].
В культуре нейробластомы IMR 32 ИФН-a-2b в концентрации 600 МЕ/мл после инкубации в течение 24 ч ингибировал пролиферацию и индуцировал дифференцировку около 50% клеток, морфологические признаки которой увеличивались в течение 48 ч [13].
Таким образом, несмотря на то, что использование препаратов ИФН в клинической нейроонкологии недостаточно эффективно, в условиях in vitro отмечена чувствительность к ИФН некоторых экспериментальных глиом и опухолей мозга человека. Это обосновывает целесообразность дальнейшего изучения реакции клеток глиом на прямое антибластическое действие новых препаратов ИФН и поиск наиболее эффективной их концентрации.
Целью работы явилось изучение влияния а-ИФН на клетки глиальных опухолей мозга различной степени злокачественности в клеточных культурах. ИФН-а (тип I, лейкоцитарный, антивирусный протеин с молекулярной массой 16-20 кД) имеет три субкласса — a, b, c. Наибольшее физиологическое и фармакологическое значение имеют ИФН-а-2а (содержащий в позиции 23 аминокислоту лизин) и ИФН-а-2Ь (содержащий в позиции 23 аминокислоту аргинин), которые получены в виде рекомбинантных препаратов. ИФН-а-2Ь у человека составляет 95% всех ИФН. В связи с этим в работе исследовано влияние препарата лаферона — рекомбинант-ного а-2Ь-ИФН человека [3].
Материалы и методы исследования. Чувствительность опухолей мозга (n=62) к воздействию препарата а-ИФН (лаферона — лекарственной формы рекомбинантного a-2b-ИФН человека, высокоочищенного препарата с удельной активностью 1-2х108 МЕ/мг белка) определяли в краткосрочных культурах клеток, приготовленных стандартным способом [2]. В таких культурах способность к росту не требуется, разрастание клеток стромы и клональный отбор отсутствуют, а результаты могут быть получены через 48 ч. Ограничением применения метода является небольшая продолжительность опыта, что исключает возможность длительного действия препарата — в течение одного или нескольких клеточных циклов.
При гистологическом исследовании биопсий-ного материала, в соответствии с принятой в институте гистобиологической классификацией опухолей центральной нервной системы [9], в 20 наблюдениях диагностирована астроцитома II степени злокачественности, в 20 — астроцитома III степени злокачественности, в 22 — глиоблас-тома IV степени злокачественности.
Культуры клеток опухолей инкубировали с лафероном в возрастающей концентрации 500 МЕ/мл, 103 МЕ/мл, 104 МЕ/мл, 105 МЕ/мл в течение 24 ч. Выбор такого спектра концентраций лаферона обоснован в аналогичных экспериментах на культурах опухолей различного гистогенеза [4, 11, 14, 15]. Цитотоксическую активность лаферона оценивали в стандартном тесте с трипановым синим с подсчетом количества жизнеспособных клеток. Чувствительность клеток опухоли к лаферону оценивали как отрицательную — при уменьшении количества живых клеток до 20%, слабую — при снижении на 21-40%, умеренную — на 41-60%, высокую — выше 60%. Изучен также эффект прямого действия лаферона на клетки опухоли глиом в эксплантационных культурах.
Для уточнения одного из возможных механизмов реализации цитотоксического эффекта лаферона на клетки глиом (n=6) исследовали апоптотические клетки после прединкубации клеток опухоли с а-ИФН (лафероном) в различной концентрации. С этой целью использован ДНК-тропный краситель Hoechst 33342 (Sigma), соединяющийся с ДНК в местах A-G-пар и выявляющий долю апоптотических клеток через 6-8 ч после получения ими апоптотичес-кого стимула. Для этого клетки опухоли отмывали в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) путем центрифугирования при скорости 1500 об./мин в течение 5 мин, инкубировали с красителем Hoechst 33342 (0,1 мкг/мл) в течение 30 мин при температуре 37°С, отмывали в ЗФР, суспендировали в 50% растворе глицерина, наносили на предметные стекла, накрывали покровными стеклами и запаивали. Препараты просматривали с использованием иммерсионной системы под микроскопом ЛЮМАМ (Россия) при увеличении 900. Количество Hoechst-положительных клеток подсчитывали на 100 клеток каждой пробы, результат выражали в процентах.
Результаты и их обсуждение. При гистологическом исследовании биопсийного материала отмечена характерная структура глиом в соответствии со степенью их злокачественности. В 2 наблюдениях особенностью анапластической астроцитомы III степени злокачественности было наличие участков олигодендроглиомы, в связи с чем диагностирована анапаластичес-кая олигодендроглиома. В одном наблюдении в материале, взятом после повторной операции, отмечены признаки лечебного патоморфоза после предшествовавшей антибластической терапии. В ткани одной глиобласты выявлены протяженные участки соединительнотканных разрастаний с признаками малигнизации, что
явилось обоснованием для гистологического диагноза "глиосаркома".
В соответствии с принятой нами количественной градацией чувствительности клеток глиом к лаферону по уровню цитотоксичности отмечена различная противоопухолевая активность препарата в суспензионных культурах анапластической астроцитомы II степени злокачественности. Так, после инкубации с лафе-роном в культурах клеток опухоли в 9 (45%) наблюдениях астроцитомы II степени злокачественности отмечено уменьшение количества жизнеспособных клеток на 57-90,3%. При этом в 5 наблюдениях такая реакция на лаферон не зависела от концентрации препарата, в 4
— количество жизнеспособных клеток уменьшалось дозозависимо.
В 6 (30%) наблюдениях прямое действие лаферона на клетки астроцитомы II степени злокачественности оказалось менее эффективным. Ни в одном из образцов количество жизнеспособных клеток не уменьшилось более чем на 60%, даже под влиянием наиболее высокой концентрации цитокина: в 2 пробах этот показатель дозозависимо увеличился от 19,2 до 45,1%, в 3 пробах — от 38,7 до 49,7%, в 1 пробе
— остался в пределах от 52 до 57,2%, независимо от концентрации цитокина. Таким образом, чувствительность к лаферону астроцитом этой группы оценена как умеренно выраженная.
В 3 (15%) наблюдениях цитотоксичность клеток опухоли после инкубации с лафероном составляла от 19 до 38,5%. Лишь в одной пробе этот показатель составил 44% после воздействия максимальной концентрации лаферона (105 МЕ/мл). Эти астроци-томы отнесены к группе слабо чувствительных к лаферону.
В 2 (10%) наблюдениях цитотоксичность была еще более низкой — 13,6-18,2%, что с наибольшей вероятностью характеризует эти опухоли как устойчивые к прямому воздействию лаферона.
Высокая чувствительность к лаферону в суспензионных культурах отмечена в 6 (30%) наблюдениях анапластической астроцитомы III степени злокачественности. В 2 из них после инкубации с цитокином количество жизнеспособных клеток эффективно снижалось на 69,8-75%, независимо от его концентрации; в 4 — этот показатель пропорционально увеличивался по мере повышения концентрации лаферона. Наиболее высокая цитотоксичность (84,7-94%) достигнута после воздействия лафе-рона в высокой концентрации (104-105 МЕ/мл). При более низкой концентрации цитокина (102103 МЕ/мл) степень снижения количества жизнеспособных клеток была меньше (57,9-79,5%). Таким образом, эти опухоли характеризуются
высокой чувствительностью к прямому воздействию лаферона в суспензионных культурах.
В 8 (40%) наблюдениях клеточные культуры астроцитомы III степени злокачественности в цитотоксическом тесте были менее чувствительны к воздействию лаферона: после инкубации с лафероном в высокой концентрации (105-104 МЕ/мл) количество живых клеток уменьшалась на 45-56%, в одном наблюдении — на 60%. С уменьшением концентрации цито-кина этот показатель отчетливо снижался с 38,4 до 22%.
Клетки 5 (25%) образцов анапластической астроцитомы в культурах оказались слабо чувствительными к прямому воздействию лафе-рона при отсутствии четкой дозозависимости противоопухолевого эффекта. Максимальное уменьшение количества жизнеспособных клеток после инкубации с лафероном в наибольшей концентрации составило 29,7-39,1%. В одном наблюдении клетки астроцитомы оказались устойчивыми к прямому воздействию цито-кина.
При аналогичном анализе группы из 22 глиобластом в 27,2% наблюдений отмечена высокая, в 27,2% — умеренная, в 36,3% — слабая чувствительность к прямому воздействию лаферона.
При этом в большинстве наблюдений выявлено дозозависимое увеличение цитотоксичес-кого действия цитокина на клетки опухоли. Резистентными к действию лаферона были 2 (9%) глиобластомы.
В одном наблюдении чувствительность клеток опухоли к лаферону в цитотоксическом тесте удалось сравнить на материале первой и повторной операций. При первичном тестировании клетки глиобластомы были высокочувствительными к действию лаферона: цитотоксичность увеличивалась дозозависимо и достигла 92,8% — при максимальной концентрации лаферона (105 МЕ/мл). При повторном тестировании через 1 год обнаружено крайне незначительное уменьшение количества живых клеток (2,5-6,2%) независимо от концентрации лаферона, что свидетельствовало о резком снижении чувствительности клеток опухоли к противоопухолевому действию этого цитокина в процессе продолженного роста.
Распределение глиом различной степени злокачественности в зависимости от их чувствительности к прямому действию а-ИФН в суспензионных культурах представлено в табл. 1.
Во всех группах преобладали опухоли с высокой и умеренной чувствительностью к прямому действию а-ИФН. Наиболее чувствительными были астроцитомы II и III степени злокачественности (70-75%), наименее — глиоб-
Таблица 1. Распределение глиом по степени чувствительности к а-ИФН
Гистоструктура, степень злокачественности Число наблюдении Число наблюдении при степени чувствительности к а-ИФН
высокоИ +++ умеренной ++ слабоИ + отрицательной —
абс. % абс. % абс. % абс. %
Астроцитома, II 20 9 45 6 30 3 15 2 10
Астроцитома, III 20 6 30 8 40 5 25 1 5
Глиобластома,IV 22 6 27,3 6 27,3 8 36,3 2 9
Глиома 62 21 33,9 20 32,2 16 25,8 5 16,1
ластомы (54,6%). Глиобластомы наиболее часто были чувствительными к прямому воздействию а-ИФН. При этом отмечены различия индивидуальной чувствительности большинства глиом к той или иной концентрации лаферона. Однако пропорциональность повышения цито-токсичности лаферона была непостоянной и не зависела от степени анаплазии опухоли.
Результаты определения количества доли апоптотических клеток в культурах глиом после воздействия лаферона представлены в табл. 2. После инкубации в течение 24 ч этот цитокин оказывал проапоптотическое влияние на клетки глиом in vitro. При этом значимый эффект наблюдали уже после воздействия лаферона в концентрации 102 МЕ/мл; при повышении концентрации цитокина эффект был примерно таким же, что обусловлено насыщением потенциальных мест связывания молекул цитокина с соответствующими рецепторами на поверхности клеток опухоли.
При сравнительном анализе динамики количества жизнеспособных клеток глиом и апоптотических Hoechst-положительных клеток в зависимости от концентрации лаферона в индивидуальных наблюдениях обнаружены различные соотношения этих показателей. Так, в глиобластомах при наибольшей степени уменьшения живых клеток (на 67,5%) после воздействия лаферона (103 МЕ/мл) количество апоптотических клеток было максимальным (68,7%). Однако количество апоптотических
клеток оказалось значительным и после воздействия лаферона в меньшей концентрации (1 МЕ/мл, 10 МЕ/мл, 102 МЕ/мл) — соответственно 62,2, 75, 57,7%.
Аналогичная динамика показателей цито-токсичности лаферона отмечена и при злокачественной глиоме: после воздействия на клетки опухоли лаферона в высокой концентрации (103—105 МЕ/мл) количество апоптотических клеток составило 68,1-93,9% при уменьшении количества жизнеспособных клеток на 55,6-74,5%.
Таким образом, при определении чувствительности злокачественных глиом к лаферону в суспензионных культурах установлен определенный параллелизм повышения эффекта повреждаемости клеток опухоли в ответ на прямое воздействие лаферона, индуцирующего их гибель по механизму апоптоза.
В культурах анапластической астроцитомы III степени злокачественности также наблюдали отчетливую тенденцию к дозозависимому эффекту цитотоксичности клеток опухоли после воздействия а-ИФН (лаферона). При этом оба показателя в большинстве проб имели близкие значения. Такая же тенденция отмечена при тестировании клеток астроцитомы II степени злокачественности.
Усредненно количество апоптотических клеток в суспензионных культурах глиом после инкубации в течение 24 ч с лафероном в различной концентрации представлено в табл. 2.
Таблица 2. Количество Hoechst-пoлoжитeльных клеток в суспензионных культурах клеток опухоли после инкубации с лафероном в различной концентрации
Опухоль, степень злокачественности Количество клеток после инкубации с интерфероном в концентрации, МЕ/мл
в контроле 1 10 102 103 104 105
Астроцитома, II 80,0 83,4 70,2 92,0 60,9 94,5 77,8
Олигодендроглиома, II-III 8,2 14,5 — 17,8 — 31,6 —
Анапластическая астроцитома, II-III 40,2 53,9 40,4 80,9 57,0 61,4 —
Анапластическая астроцитома, III 10,0 41,6 45,7 88,0 76,3 58,1 —
Анапластическая глиома, III-IV 57,0 57,2 67,6 65,0 68,1 93,9 88,9
Глиобластома, IV 73,9 62,2 75,0 57,7 68,7 57,7 —
Усредненные данные (M±m) 44,9±28,3 52,2±20,8 59,8±13,9 66,9±25,1 66,2±6,7 64,9±24,2 83,4±5,6
и J
s s
О ¡£
i №un ig UEJuit itf мЕлап Ю' иншп 1С мкип 1р' ынмл
концентрация паферона
Рис.1. Влияние 24-часовой инкубации с лафероном на клетки анапластической глиомы человека in vitro
На рис. 1 показана динамика количества апоп-тотических клеток в культуре анапластической астроцитомы III степени злокачественности.
Таким образом, полученные результаты дают основание предположить, что лаферон может оказывать проапоптотический эффект на клетки глиом, при этом количество апоптотических клеток при воздействии лаферона в концентрации 104—105 МЕ/мл увеличивается на 30%.
Реакция опухолей мозга на воздействие а-ИФН в эксплантационных культурах.
Исследование противоопухолевой активности а-ИФН в эксплантационных культурах глиом дает возможность изучить влияние цито-кина на архитектонику зоны роста культур в целом и характер индуцированных изменений структуры клеток опухоли.
При сопоставлении реакции клеток глиом на прямое действие а-ИФН в эксплантаци-онных культурах и цитотоксическом тесте обнаружены сходные результаты. Оказалось, что глиомы, слабо чувствительные к а-ИФН в краткосрочных суспензионных культурах, так же слабо реагируют на его воздействие и в эксплантационных культурах. Так, в зоне роста культур глиобластомы а-ИФН индуцировал необратимое повреждение 20% клеток. В суспензионных культурах этой же опухоли показатель цитотоксичности составлял 15,2-27,4%, независимо от концентрации цитокина. В то же время в глиомах, чувствительных к повышающейся концентрации а-ИФН в цитотоксическом тесте, отмечен нарастающий дозозависимый эффект цитодеструкции и в эксплантационных культурах: поле инкубации в течение 24 ч этих культур с лафероном в разных концентрациях отмечены дискомплексация и разрежение зоны роста, разрывы пластов клеток, дозозависимое снижение плотности клеток, а также некроби-отические изменения клеток опухоли, прикрепленных к подложке (рис. 2).
В гистологических препаратах таких культур определяли различные типы дистрофических и некробиотических изменений в клетках опухоли, элиминацию пролиферирующей фракции клеток (отсутствие митозов), а также появление фигур апоптоза. При этом отмечена устойчивость к воздействию а-ИФН высокодиф-ференцированной фракции клеток опухоли — длинноотростчатых опухолевых астроцитов. В цитотоксическом тесте чувствительность клеток этой глиомы к лаферону оценена как умеренная, поскольку количество жизнеспособных клеток уменьшалось дозозависимо от 34,6 до 53,1%. Подобная тенденция выявлена и в остальных наблюдениях параллельного тестирования чувствительности глиом к лаферону в суспензионных и эксплантационных культурах.
Таким образом, различия индивидуальной чувствительности клеток глиом к прямому воздействию а-ИФН в различных концентрациях моделируются как в цитотоксическом тесте на суспензионных культурах, так и в более длительных эксплантационных культурах. Исследования антибластического воздействия а-ИФН на клетки эксплантационных культур глиом позволяют наблюдать структурную реакцию клеток опухоли, что существенно дополняет результаты тестирования его активности в цитотоксическом тесте на краткосрочных клеточных культурах.
Заключение. Результаты проведенных исследований показали широкий диапазон противоопухолевого влияния а-ИФН на клетки глиом различной степени злокачественности.
При суммарной оценке распределения глиом различной степени злокачественности в соответствии с их градацией по динамике уменьшения количества жизнеспособных клеток после инкубации с лафероном установлено, что среди астроцитом (П—Ш степени злокачественности) преобладают опухоли с высокой и умеренной
в
ВЯЙнН НИ9Ш
Щш
■Из
ж
ш
Рис.2. Эффект прямого воздействия а-ИФН на эксплантационную культуру анапластической астро-цитомы III степени анаплазии a — контрольная живая культура. Плотноклеточная зона роста эксплантата с признаками полиморфизма клеток. Ув. х100. б — разрежение и дискомплекса-ция зоны роста после инкубации с а-ИФН в концентрации 102 МЕ/мл. Ув. х100.
в — уменьшение плотности клеток в зоне роста культуры после инкубации с а-ИФН в концентрации 103 МЕ/мл. Ув. х100.
г — сохранение небольшого количества клеток опухоли в культуре после инкубации с а-ИФН в концентрации 104 МЕ/мл. Ув. х100.
Динамика структурных изменений в зоне роста культуры астроци-томы после инкубации с а-ИФН в течение 24 ч в возрастающей концентрации свидетельствует о нарастающем уменьшении количества сохраненных опухолевых клеток вследствие элиминации части из них из-за гибели и деск-вамации.
чувствительностью к цитокину. Среди глиоблас-том (IV степени злокачественности) количество высокочувствительных опухолей не превышает 27,3%.
В образцах глиом с умеренно выраженной чувствительностью в ответ на прямое воздействие а-ИФН наиболее чувствительными оказались анапластические астроцитомы III степени злокачественности (40%). Кроме того, доля опухолей со слабой чувствительностью к а-ИФН несколько выше, чем среди астроцитом II степени злокачественности и глиобластом.
В образцах глиом с наиболее низкой чувствительностью наибольшая доля глиобластом (36,3%), наименьшая — астроцитом II степени злокачественности (15%).
Таким образом, установлена обратная зависимость между степенью злокачественности глиом и их чувствительностью к противоопухолевому воздействию лаферона. Можно предположить, что процесс озлокачествления клеток глиом сопровождается частичной утратой их рецепторов к а-ИФН, а следовательно, снижением их чувствительности к цитокину.
При рассмотрении эффекта дозозависимости противоопухолевого действия а-ИФН на клетки опухолей установлено, что только в 15 наблюдениях выявлена прямо пропорциональная зависимость количества жизнеспособных клеток по мере повышения концентрации цитокина. В большинстве наблюдений такая закономерность не прослеживается или слабо выражена. Отмечены незначительные колебания цитотоксич-ности независимо от концентрации лаферона. Это можно объяснить насыщением рецепторных зон связывания а-ИФН с экспрессированными к нему рецепторами при воздействии первоначально эффективной концентрации цитокина, которая может быть различной для разных опухолей. Поэтому дальнейшее повышение концентрации лаферона существенно не влияет на показатели цитотоксичности. С одной стороны, это может свидетельствовать о гетерогенности клеточного состава в разных пробах одной и той же опухоли, с другой, отражать различия в содержании рецепторов к а-ИФН на клетках различных опухолей. Это положение обосновывает необходимость предварительного инди-
видуального подбора эффективной концентрации лаферона с использованием стандартного цитотоксического теста в каждом конкретном наблюдении.
В трактовке механизмов противоопухолевого действия а-ИФН на клетки глиом решающее значение имеют результаты определения количества проапоптотических клеток с использованием специфического красителя Hoechst, который соединяется с ДНК в местах А-G пар и выявляет апоптотические клетки уже через 6-8 ч после того, как они получили апоптоти-ческий стимул. При сопоставлении динамики количества Hoechst-положительных клеток и уменьшения уровня жизнеспособных клеток в образцах одной и той же опухоли установлены однонаправленные дозозависимые изменения — параллельное увеличение этих показателей после воздействия на клетки лаферона.
Исходя из этого, инкубация в течение 24 ч с лафероном оказывает проапоптотическое влияние на клетки глиомы in vitro. Обсуждая возможные механизмы такого влияния а-ИФН, необходимо обратить внимание на несколько аспектов проблемы.
Считают, что канцерогенез — многоступенчатый процесс накопления мутаций и других генетических изменений, обусловливающих нарушения ключевых клеточных функций, таких как регуляция пролиферации и диф-ференцировки, естественную гибель клеток (апоптоз), морфогенетические реакции клетки, неэффективное функционирование факторов специфического и неспецифического противоопухолевого иммунитета [10].
Предполагают, что рост опухоли является следствием дисбаланса между пролиферацией клеток и их программированной смертью. Одним из механизмов нарушения апоптоза в клетках опухоли являются мутации в генах, контролирующих этот процесс [1].
Апоптоз представляет активный процесс, требующий экспрессии ряда специфичных генов, которые запускают сигнальный каскад реакций с участием протеинкиназ, протеаз и эндонуклеаз. Внутриклеточные пути передачи дифференцирующих, пролиферативных, про- и антиапоптотических сигналов взаимосвязаны, тесно переплетаются и взаимоперекрещиваются. Внутриклеточные сигнальные каскады передачи дифференцирующего сигнала, путь передачи пролиферативного сигнала, включающий протеинкиназу С и каскад МАР-проте-инкиназ, путь, зависимый от протеинкиназы В, Jun-киназный и р38-МАРК-киназный пути берут начало от общего звена — протеинкиназы, ассоциированной с рецептором фактора роста. Однако эти пути соприкасаются также и на уровне определенных составляющих их звеньев и взаиморегулируются [6].
ИФН взаимодействуют с клетками-мишенями посредством мембранных рецепторов (ИФН-а Р, ИФН-Р Р, ИФН-у Р). Связывание рецептора ИФН ведет к индукции синтеза протеинкиназы, которая фосфорилирует один из инициирующих факторов трансляции. Фос-форилированный фактор не может обеспечить образование инициирующего комплекса. Происходит либо избирательное подавление трансляции матриц, либо специфическое выключение трансляции в клетках. Под влиянием а-ИФН нарушается транскрипция более 30 ядерных белков, а также ингибирование синтеза РНК и протеинов, необходимых для синтеза ДНК, что способствует замедлению клеточного цикла с переходом клетки опухоли в фазу покоя, чем обусловлено влияние а-ИФН на пролиферацию злокачественных клеток. Влияние а-ИФН на дифференцировку клеток заключается в стимулировании созревания недифференцированных клеток опухоли, при этом восстанавливается сдерживающий контроль за процессами пролиферации, существующий в здоровом организме [3, 8]. Кроме того, в обработанных ИФН клетках индуцируется синтез 2'—5'-аденилатсинтетазы — ключевого фермента антивирусной активности, синтезирующего 2'—5'олигоадениловую кислоту [20], которая способствует активации латентных нуклеаз, разрушающих свободные иРНК, вследствие чего блокируются стадия инициации трансляции и разрушение иРНК [8].
а-ИФН быстро и эффективно индуцировал апоптоз в клетках ряда линий (Н9, И—266) злокачественных лимфоидных опухолей и останавливал рост клеток линии Daudi [18]. Важно подчеркнуть, что апоптоз, вызванный а-ИФН, возникал в любой фазе клеточного цикла. При этом влияние а-ИФН на белки Вс1—2, Вах и р53 не выявлено.
Полагают, что а-ИФН может ингибировать некоторые онкогены (с-тус, с^гс, cHa-ras) и таким образом участвовать в механизмах, контролирующих процессы малигнизации и прогрессирования новообразований [3].
С другой стороны, ИФН не является прямым индуктором апоптоза, но может модулировать апоптоз, вызванный в клетках опухоли индукторами различной природы: а-ИФН усиливает действие цитотоксических агентов (фактора некроза опухолей, винбластина) на клетки различных опухолевых линий (И—937, Нер—2, К—562, ЬЬ, ММ—4 и др.). По данным морфологического и молекулярно-биологического анализа, в основе этого эффекта лежит способность ИФН усиливать апоптоз: именно в его присутствии усиливается олигонуклеосомальная фрагментация ядерной ДНК и увеличивается количество апоптотических клеток. Проапоптотический эффект ИФН зависит от особенностей клеток опухоли: в одних ситуациях достаточно предобработки клеток ИФН, в других — требуется
постоянное присутствие цитокина вместе с индуктором апоптоза. Обнаруженный феномен раскрывает новую грань в механизме противоопухолевого действия ИФН [12].
Обсуждая механизмы противоопухолевых свойств ИНФ, некоторые авторы полагают, что при прямом действии этого цитокина антипро-лиферативный эффект обусловлен снижением биосинтеза триптофана и полиамина, а также индуцированием в опухоли выработки белков цитоплазмы, обладающих антипролифератив-ным эффектом (2-3 синтетаза, протеинкиназа С) [16]. Кроме того, имеют значение дифференцирующее влияние ИФН на клетки опухоли, удлинение всех фаз клеточного цикла (период удвоения массы опухоли увеличивается в 2-3 раза), модуляция экспрессии онкогенов (c-myc, ras, c-fos), а также прямой цитотоксический эффект. Непрямой противоопухолевый эффект ИФН реализуется путем: усиления экспрессии молекул ГКГС обоих классов, опухольассоции-рованных антигенов, Fсy- рецепторов и молекул ICAM-1 на клетках опухоли; повышения цито-токсичности естественных клеток-киллеров и макрофагов; повышения антителозависимой цитотоксичности, а также ингибирования анги-огенеза в опухоли.
На культурах клеток экспериментальной глиомы мыши С-26, которые подвергали воздействию а/Р-ИФН в течение 1-4 сут, установлено торможение их роста вследствие накопления в S-фазе клеточного цикла. Это сопровождалось усилением экспрессии глиального кислого фибриллярного белка в 3 раза, то есть изменением фенотипа клеток опухоли в сторону дифференцировки [23]. На модели глиомы 261 мыши показано, что после внутримышечной инъекции плазмидной ДНК, кодирующей а-ИФН мыши, отмечали значительное уменьшение объема опухоли и увеличение показателя выживаемости животных [21].
В культуре клеток нейробластомы IMR 32 показано, что ИФН-а2Ь (лаферон) в концентрации 600 МЕ/мл тормозил пролиферацию и индуцировал дифференцировку 50% клеток (при инкубации в течение 24 ч) [13].
В наших исследованиях по выявлению апоптотических клеток значимый повреждающий эффект наблюдали уже при концентрации лаферона 102 МЕ/мл. Лаферон в более высокой дозе оказывал примерно такой же эффект, что, по-видимому, обусловлено насыщением потенциальных мест связывания молекул цитокина с соответствующими рецепторами на клетках опухоли и конкурентной ингибицией связывания а-ИФН с рецепторами при его высокой концентрации, поскольку связывание меченых а-ИФН и Р-ИФН с клетками глиомы EFC-2 конкурентно ингибировалось при увеличении концентрации обоих цитокинов [26].
Выводы. 1. Прямое воздействие а-ИФН на клетки первичных глиом в суспензионных культурах in vitro оказывает различный противоопухолевый эффект — цитотоксическое повреждение, торможение пролиферации и усиление апоптоза.
2. Доля высокочувствительных к цитотокси-ческому действию лаферона глиом составляет: среди доброкачественных астроцитом — 45%, астроцитом III степени злокачественности и глиобластом — соответственно 30 и 27,3%.
3. Наиболее низкая чувствительность клеток опухоли к действию лаферона отмечена в 36,3% глибластом, 25% — анапластических астро-цитом III степени злокачественности и 15% астроцитом II степени злокачественности, что свидетельствует о снижении чувствительности глиом к а-ИФН с нарастанием их малигнизации, а также о наличии резистентных к действию ИНФ дифференцированных астроцитом II степени злокачественности.
4. Дозозависимая гибель клеток глиом после прямого воздействия лаферона установлена только в 24% наблюдений.
5. Различные реакции клеток глиом разной степени злокачественности на прямое воздействие а-ИФН обосновывают целесообразность тестирования биоптатов глиом на определение их индивидуальной чувствительности к этому цитокину для последующей разработки рациональных схем терапии у каждого конкретного больного.
Список литературы
1. Акимов А.А., Иванов С.Д., Хансон К.П. Апоптоз и лучевая терапия злокачественных новообразований // Вопр. онкологии. — 2003. — Т.49, №3.
— С.261-269.
2. Вилсон Э. Тесты на цитотоксичность и жизнеспособность // Культура животных клеток. Методы / Под. ред. Р. Фрешни. — М.: Мир, 1989.
— С.256-302.
3. Возианов А.Ф., Бутенко А.К., Зак К.П. Цитокины. Биологические и противоопухолевые свойства.
— К.: Наук. думка, 1998. — 317 с.
4. Воронцова А.Л. Роль интерферона в притивоопу-холевой резистентности // Эксперим. онкология.
— 1989. — Т.11, №6. — С.49-54.
5. Воронцова А.Л., Кудрявец Ю.И. Интерферон как важный элемент оптимизации лечения онкологических больных // Онкология. — 2000. — Т.2, №1-2. — С.16-20.
6. Галицкий В.А. Канцерогенез и механизмы внутриклеточной передачи сигналов // Вопр. онкологии. — 2003. — Т.49, №3. — С.278-293.
7. Гнедкова И.А. Проблемы иммунотерапии глиом головного мозга // Укр. нейрохiрург. журн. — 2002.
— №2. — С.57-65.
8. Ершов Ф.И. Медицинская значимость интерфе-ронов и их индукторов // Вестн. РАМН. — 2004.
— № 2. — С.9-13.
9. Зозуля Ю.А., Верхоглядова Т.П., Шамаев М.И., Малышева Т.А. К вопросу о классификации опухолей нервной системы // Укр. мед. часопис.
— 2000. — №3-4. — С.5-8.
10. Копнин Б.П. Механизмы действия онкогенов и опухолевых супрессоров. — РОО: Мир науки и культуры, 2002. — ISSN 1684-9876.
11. Кудрявець Ю.1. 1нтерферон та фактор некрозу пухлин як модифшатори метастазування злоя-юсних новоутворень: Автореф. дис. ... д-ра бюл. наук. — К., 1999. — 36 с.
12. Кудрявцев Б.И. Интерферон-альфа способствует индукции апоптотической гибели опухолевых клеток под действием различных факторов: Тез докл. 2-го съезда онкологов стран СНГ (Киев, 23-26 мая, 2000 г.) // Эксперим. онкология. — 2000.
— №22. — С.42.
13. Магура И.С., Мацука Г.Х., Романова О.М. и др. Индукция морфологической дифференцировки и модуляции транспорта ионов натрия реком-бинантным интерфероном-а-2Ь (лаферон) в клетках нейробластомы человека // Материалы междунар. науч. конф. (Гродно, 28-29 сент., 2000 г.). — Гродно, 2000. — Ч.2. — С.14-17.
14. Мкртчян Л.Н. Антипролиферативная активность различных препаратов а-интерферона in vitro // Журн. эксперим. и клин.медицины. — 1984. — Т.24, №1. — С.36-41.
15. Николаева Т.Г. Действие интерферона на распределение по фазам клеточного цикла культивируемых опухолевых клеток человека // Эксперим. онкология. — 1984. — Т.5, №4. — С.52-55.
16. Орлова Р.В. Клиническое использование интерфе-ронов в онкологии // Материалы междунар. науч.-практ. конф. "Цитокины. Воспаление. Иммунитет".
— СПб, 2002. — Т.1, №2. — С.163-164.
17. Cook A.W. Human brain tumor-derived cell lines: growth rate reduced by human fibroblast interferon // Science. — 1983. — V.219, N4586. — P.881-883.
18. Erickson S., Sangfelt O., Castro J. et al. Induction of apoptosis and inhibition of cell growth are independent responses to interferon-а: Abstr. Int. Conf. "Life and Death Cell" (Fribourg, 17-18 Sept., 1998. // Anticancer Res. — 1998. — V.18, N6a. — P.4528-4529.
19. Fine H.A., Wen P.Y., Robertson M. et al. A phase I trial of a new recombinant human beta-interferon (BG9015) for the treatment of patients with recurrent gliomas // Clin. Cancer Res. — 1997. — V.3, N3.
— P.381-387.
20. Floyd-Smith G., Wang Q., Sen G.C. Transcriptional induction of the p69 isoform of 2',5'-oligoadenylate synthethase by interferon-beta and interferon-gamma involves three regulatory elements and interferon-stimulated gene factor 3 // Exp. Cell. Res.
— 1999. — V.24691. — P.138-147.
21. Horton H.M., Anderson D., Hernandes P. et al. A gene therapy for cancer using intramuscular injection of plasmid DNA encoding interferon alpha // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. — V.96, N4.
— P.1553-1558.
22. Katakura R., Yoshimoyo T. Epidemiology and statistical analysis of gliomas. Treatment of gliomas.
— Tokyo: Springer-Verlag, 1988. — P.2-20.
23. Naidu K.A., Wiranovska M., Phuphanich S., Prockop L. Modulation of glioma cell growth and 5-
lipoxygenase expression by interferon // Anticancer Res. — 1996. — V.16, N6. — P.3475-3482.
24. Nakamura H., Shitara H., Wada T. Local adoptive immunotherapy for malignant brain tumor // 9th Intern. Congr. Neurol. Surg. — New Dehli, India, 1989.
— P.23.
25. Mizuno M., Yoshida J. Effect of human interferon beta gene transfer upon human glioma, transplanted into nude mouse brain, involves induced natural killer cells // Cancer Immunol. Immunother. — 1998.
— V.47, N4. — P.227-232.
26. Rosenblum M.G., Yung W.K., Kelleher P.J. et al. Growth inhibitory effects of interferon-beta but not interferon-alpha on human glioma cells: correlation of receptor binding, 2',5'-oligoadenylate synthetase and protein kinase activity // J. Interferon Res.
— 1990. — V.10, N2. — P.141-151.
27. Yagi K., Ohishi N., Hamada A. et al. Basic study on gene therapy of human malignant glioma by use of the cationic multilamellar liposome-entrapped human interferon beta gene // Hum. Gene. Ther.
— 1999. — V.10, N12. — P.1975-1982.
28. Wiranowska M., Tresser N., Saporta S. The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro // Anticancer Res. — 1998.
— V.18, N5A. — P.3331-3338.
29. Zou J.P., Morford L.A., Chougnet C. et al. Current perspectives in immunotherapy // Amer. Thorac. Surg. — 1999. — V.162. — P.28-33.
Експериментально-морфолоНчна оцшка чутливост1 глшм головного мозку до а-штерферону Семенова В.М., Лкяний М.1., Любич Л.Д., Стайно Л.П. Шд час досл1дження ефективност прямо! дп а-штерферону (а-1ФН) на клггини глюм (n=62) in vitro встановлено !х рiзну чутливють до цитокшу залежно ввд його концентрацп. Виявлене зниження чутливост глюм до цитотоксично! дп а-1ФН у мiру збшьшення ступеня !х злояюсноста. Високочутливi до а-1ФН глюми становлять 45% серед доброяюсних астроцитом, 30 i 27,3% — серед астроцитом III i IV ступеня анаплазп. Найбшьш низька чутливють пухлинних клггин до дп а-1ФН виявлена у 36,3% глюбластом, 25% анапластичних астроцитом III ступеня злояюсност та 15% астроцитом
II ступеня злояшсноста.
Experimental-morphological evaluation of the brain glioma's sensitivity to the а-interferon Semyonova V.M., Lysyany N.I., Lyubych L.D., Stayno L.P.
This study revealed different sensitivity of brain glioma cells (n=62) to the а-interferon (а-IFN) straight action in vitro depending on cytokine's concentration. The glioma's sensitivity to the cytotoxic а-IFN action was reduced according to the growth of the tumor malignancy level. 45% of the benign astrocytomas, 30% of III anaplastic degree astrocytomas and 27,3% of IV anaplastic degree astrocytomas demonstrated the high sensitivity to а-IFN. Minimal tumor cells sensitivity to the а-IFN antitumor action was observed in 36,3% of glioblastomas, 25% of
III anaplastic degree astrocytomas and 15% II anaplastic degree astrocytomas.
