CC BY
1196
Экология и биология паразитов
УДК 619:616.995.1-084
ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ АЗИДА НАТРИЯ В КАЧЕСТВЕ КОНСЕРВАНТА И ДЕЗИНФЕКТАНТА ПОЧВ УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ
С.П. АШИХМИН1 кандидат медицинских наук Л.И. ДОМРАЧЕВА2, О.Б. ЖДАНОВА1 доктора биологических наук
Л.В. КОНДАКОВА2 кандидат биологических наук Л.Р. МУТОШВИЛИ2, Л.Б. ПОПОВ2 соискатели
1 Кировская государственная медицинская академия, e-mail: nics-vsaa@mail. ru 2Лаборатория биомониторинга научного центра Уральского отдела РАН
Изучена возможность применения азида натрия в 0,3 и 0,5%-ной концентрации в качестве консерванта для фиксации биологического материала. Органы сохраняют цвет, консистенцию, форму и макроструктуру в течение 360 сут фиксации. 63 % яиц Toxocara ca-nis погибали в течение 2 сут в 0,3-0,5%-ном растворе азида натрия. Указывается на возможность применения азида натрия для дезинвазии почвы, контамини-рованной яйцами гельминтов.
Ключевые слова: азид натрия, консервант, биоматериал, фиксация, дезинвазия, яйца Toxocara canis.
В настоящее время в паразитологии, помимо сохранения самих гельминтов в качестве музейных препаратов, необходимо сохранять различные ткани, изъятые из трупов животных и человека как для проведения дальнейших исследований, так и для демонстрации изменений в пораженных паразитами органах в учебном процессе [6,7].
Ранее предложены различные способы фиксации органов, основанные на бальзамировании сулемой, мышьяком, хлористым цинком, глицерином, карболовой кислотой и, наконец, формалином, который быстро завоевал известность и получил всеобщее признание.
Применяемые в настоящее время растворы для фиксации в своем составе имеют формалин в различных концентрациях, который обладает сильной бактерицидной способностью, дубящим эффектом, относительной дешевизной, удобством хранения и транспортировки. Наряду с перечисленными преимуществами формалин имеет и ряд недостатков:
- угнетает обмен веществ, в первую очередь витамина С, и инактивиру-ет ферменты в органах и тканях человека, работающего с данным раствором;
- летуч, имеет резкий запах, пары которого вызывают раздражение слизистых оболочек, сухость при непосредственном контакте с ним;
- обладает мутагенным свойством, токсичен;
- биологические объекты, зафиксированные формалином, теряют подвижность и эластичность, меняют прижизненную окраску из-за перехода гемоглобина крови в метгемоглобин;
- при длительном хранении в растворе, содержащем один формалин, органы покрываются плесенью.
Формальдегид относится к веществам с остронаправленным механизмом действия, а также к высоко опасным аллергенам и веществам раздражающего действия, опасным для репродуктивной системы человека (СанПиН 2.2.0.555-96. Класс опасности - 2, ПДК - 0,5 мг/м3) [2].
В связи с этим целью нашей работы было изучение нового препарата азида натрия в качестве консерванта органов и средства дезинвазии.
Материалы и методы
Изучение реакций со стороны органов и тканей после фиксации их в растворе азида натрия проводили после убоя экспериментально и естественно инвазированных животных разных видов. Фиксировали трупный секционный материал органов человека и животных, в которых обнаружены паразиты, не позднее суток после наступления смерти.
При консервации использовали физиологический раствор с 0,1; 0,3 и 0,5%-ным содержанием азидных производных.
Анатомические препараты органов для длительного использования готовили по следующей схеме. Кусочки органов или целые органы после промывания под проточной холодной водой помещали в физиологический раствор с 0,1%-ным содержанием азидных производных. Органы тщательно промывали через питающую артерию раствором глицерина в соотношении 1:1000 в объеме 1 : 5 - 10 по отношению к объему органа и затем раствором азида натрия. Органы фиксировали в растворе азида натрия в течение 7-10 сут.
При оценке демонстративности препарата (органа) учитывали изменения консистенции, прочности и цвет тканей, сохранность структуры и рост микроорганизмов в консерванте.
0,3%-ный раствор азида натрия применяли без биопрепарата и на фоне применения суспензии цианобактерии Nostoc paludosum. Каждый фон в свою очередь был разделен на три части, в одной - азид вносили в почву до посева травы, во второй - не вносили, в третьей - вносили после посева семян и хорошего развития травянистого покрова. Участки имели площадь 1 м2. Расход раствора азида натрия во всех вариантах составлял 0,8 л/м2. В период опыта борьбу с сорняками не проводили. Поэтому оценивали влияние азида как на однодольные растения (злаки), так и двудольные (сорняки).
Методика закладки газона заключалась в следующем. Опытный участок газона был размещен на антропогенно нарушенных почвах, в центре города Кирова, рядом с деревьями, домами, вблизи от асфальтированных дорог с интенсивным движением транспорта. Во время опыта выполняли все агротехнические требования, необходимые для создания качественного газонного покрытия, в том числе: почва перекапывалась на глубину до 25 см с одновременным удалением корней и корневищ многолетних сорняков. Параллельно с опытного участка удаляли крупные камни, почву тщательно выравнивали граблями и осуществляли разметку опыта. Ширина дорожек между делянками составляла 0,2 м.
После подготовки участка сразу же обработали соответствующие вариантов раствором азида натрия (до посева семян газонной травосмеси). Все остальные варианты были политы водой.
Посев семян проводили через 7-10 сут. Семена газонной травосмеси марки «Спорт» заделывали в почву граблями на глубину 1 см, а после этого уплотняли верхний почвенный слой для лучшего контакта семян с почвой. Норма высева семян согласно рекомендациям - 1 кг на 30 м2. После заделки семян провели обработку соответствующих вариантов растворами биопрепаратов. Вариант без биопрепаратов поливали соответствующим количеством воды.
Через 3 недели после посева, когда высота всходов достигла 10 см, провели опрыскивание опытных делянок 0,5% раствором азида натрия.
Общую численность сапрофитных микроорганизмов определяли с помощью метода люминесцентной микроскопии. Численность водорослей и цианобактерий определяли методом прямого счета (Штина, 1959) в модификации Домрачевой (2006). Отобранный массив растирается или непосредственно и ступке пли протирается через чайное сито. Для водорослей и цианобактерий данный способ диспергирования с почвенных частиц столь же эффективен, как для бактерий обработка почвенных образцов на ультразвуковом диспергаторе.
Почвенную суспензию с водорослями после растирания без потерь переносят в мерный цилиндр на 100 мл и доливают дистиллированной водой до метки. Мерный цилиндр закрывают резиновой пробкой, суспензию встряхивают 1-2 мин., производят отбор суспензии микропипеткой объемом 0,1 мл приблизительно на уровне 50 мл (на середине водного столба). Почвенную суспензию наносят на тщательно обезжиренное предметное стекло (0,01 мл на препарат) и равномерно микробиологической петлей распределяют на площади 4 см2 (квадрат 2x2 см) по трафарету из бумаги, подложенному под стекло. Из одной пробы, т. е. варианта опыта, готовят девять мазков на трех предметных стеклах. Степень разведения может меняться в зависимости от обилия водорослей в исходном образце. Чем меньше разведение, тем выше точность полученных результатов. Используемое разведение 1 : 10 - минимальное для всех известных случаев количественного учета водорослей. При традиционном способе практикуется разведение в 30-40 раз. Это количество клеток содержится в 0,01 мл суспензии, которую наносили на препарат, и, значит, в 1 мл данной суспензии концентрация клеток в 100 раз больше.
Результаты и обсуждение
Установлено, что при использовании азида натрия в концентрации 0,3 и 0,5 % в физиологическом растворе в качестве консерванта все испытуемые органы сохраняют прижизненный цвет, консистенцию, форму, прочность макроскопической структуры в течение всего срока фиксации (табл. 1).
Органы, фиксированные в 10%-ном растворе формалина, приобретают выраженную плотную консистенцию, неприятный запах и грязно-бурый цвет в результате перехода гемоглобина крови в метгемоглобин уже через 6 ч от начала фиксации. Отмечено заметное уменьшение размеров органов уже на 14-е сутки от начала опыта. Такой дубящий эффект, по-видимому, связан с изменением структуры белка.
1. Сохранность макроструктуры биологического материала в растворах ази-
Показа- Концентрация раствора азида натрия (%) 10%-ный
тель 0,05 0,1 0,3 0,5 р-р формалина
Структура Нормальная Нормаль- Нормаль- Нормальная Уменьшение
органа ная ная размеров
Цвет Изменен незначительно Изменен незначительно Обычный Обычный Грязно-бурый
Конси- Нормальная Нормаль- Нормаль- Нормальная Очень плот-
стенция ная ная ная
Антибак. Недоста- Достаточ- Сильно Сильно вы- Сильно вы-
действие точно но выражено ражено ражено
Форма Сохранена Сохранена Сохранена Сохранена Изменена
органов
Российский паразитологический журнал, 2010, № 2
Из анализа данных таблицы можно сделать заключение об оптимальной процентной концентрации растворов азида натрия для целей фиксации биологического материала. В частности, 0,05 и 0,1%-ные растворы не полностью обеспечивают удовлетворительную сохранность цвета органов, как было описано ранее, хотя другие учитываемые параметры не изменялись.
0,3 и 0,5%-ные растворы азида натрия намного эффективнее сохраняют все наблюдаемые признаки органов на протяжении сроков фиксации (60, 180 и 360 сут).
Помимо формалина для фиксации применяют другие средства.
Спирт этиловый легко проникает в ткани, фиксирует и консервирует их с меньшим уплотнением и обесцвечиванием, чем формалин, однако он относится к дорогостоящим консервантам и сохраняет цвет недостаточно долго.
Метиловый алкоголь (10-70 %) сильно обесцвечивает и сморщивает ткани, едок и токсичен.
Глицерин не является бактерицидным средством и не имеет консервирующих качеств, но увеличивает способность других химических веществ убивать бактерии и является хорошим носителем химических веществ, сохраняет влагу в тканях.
Глутаральдегид применяется в виде 2,5%-ного раствора, обладает бактерицидным и дубящим действием, антисептическими и дезинфицирующими свойствами, способен удалять жидкость из тканей при химической реакции с белками органа.
Тимол, хлористый цинк и сулема (1%-ный раствор) обладают бактерицидными свойствами, но придают неестественный цвет тканям, токсичны.
Карболовая кислота, или фенол (до 1 %), имеет слабое бактерицидное и дубящее действие на ткани, токсична.
Уксуснокислый калий (натрий) в форме 3-10%-ного раствора умеренно токсичен, обладает слабым бактерицидным свойством и гигроскопическим действием на ткани.
Перекись водорода в форме 5%-ного раствора обесцвечивает ткани, токсична, вызывает ожоги, обладает сильным бактерицидным свойством.
10%-ный раствор уксусной кислоты восстанавливает естественный цвет ткани, имеет сильное бактерицидное свойство.
Ацетон (до 50%-ной концентрации) обладает умеренным бактерицидным действием, токсичен, сморщивает ткани.
Хлорамин (5 %) не сморщивает ткани, не обладает запахом, но плохо сохраняет ткань в летнее время.
Соли тяжелых металлов вызывают коагуляцию белков клетки.
Тромболитик Complucad полностью исключает применение формалина, превосходит по своему действию его 10%-ный раствор, повышает качество биологического материала, является экологически чистым продуктом, но чрезвычайно дорогостоящий консервант и не может быть использован на данном этапе в паразитологических музеях.
Таким образом, органы в физиологическом растворе с азидными производными сохраняют прижизненную окраску, форму и консистенцию, а ткань легкого не утрачивает своей воздушности на протяжении указанных сроков фиксации, в связи с чем данный раствор можно применять в паразитологиче-ских музеях для сохранения пораженных гельминтами органов.
Помимо консервации формалин широко применяют для дезинфекции. Учитывая его высокую токсичность, нами предпринята попытка заменить формалин раствором азида натрия для уничтожения в почве яиц гельминтов. Комплексное изучение биологических свойств почвы, в том числе их загрязнения патогенными бактериями и паразитами, имеет особое значение в условиях концентрации людей и животных на ограниченных территориях. До недавнего времени паразитологи особое внимание уделяли паразитозам сель__27
Российский паразитологический журнал, 2010, № 2
скохозяйственных животных, не учитывая увлечение населения страны содержанием собак и кошек и выделение огромного количества экскрементов мелкими плотоядными, которые часто содержат яйца гельминтов, в том числе вызывающие тяжелые заболевания человека. В этой связи необходимо уделять особое внимание дегельминтизации почвы, в первую очередь, в местах выгула собак. Наиболее опасным в эпидемиологическом плане является ток-сокароз [1, 3, 4]. Яйца токсокар сохраняются в почве жизнеспособными в течение нескольких лет. Большинство дезинфектантов на них не действуют, а в 0,3%-ном растворе формалина они остаются жизнеспособными свыше 10 лет. В связи с этим нами испытан азид натрия в 0,3 и 0,5%-ных концентрациях. В этот раствор вносили яйца токсокар и наблюдали за их развитием. Отмечена гибель 30 % яиц в первые сутки и 63 % во вторые сутки инкубирования в растворе азида натрия.
Таким образом, азид натрия можно рекомендовать для дегельминтизации почвы в местах скопления фекалий собак и кошек [3-5]. Однако возникает необходимость проверки безопасности препарата для газонных растений и полезной почвенной микрофлоры. Поэтому применению данного препарата в качестве дезинфеканта в определенной концентрации должна предшествовать его оценка безопасности для окружающей среды. С этой целью были проведены опыты на микроделянках площадью 1 м2, выделенных на типичном уличном газоне в центре г. Кирова. Спустя несколько часов после обработки наблюдали сильный гербицидный эффект. Растения повяли, происходило сильное закручивание листьев, через несколько суток отмечали полное усыхание и отмирание надземной части. Через 2 нед газонная трава частично отросла, хотя площадь покрытия почвы в этом варианте даже к моменту снятия опыта (через 2 мес) не превышала 50 %, а урожай сухой массы надземной части и корней был существенно ниже, чем в контроле. Противоположный эффект оказал азид натрия на численность различных физиологических групп микроорганизмов, определенную путем посева на элективные питательные среды. Под влиянием азида натрия происходила стимуляция размножения всех исследованных групп микроорганизмов. Скорее всего, наблюдаемый стимулирующий эффект обусловлен не прямым действием азида натрия, а опосредован через поступление в почву массы погибших растений после опрыскивания газона. Вероятно, увеличение запасов доступного органического вещества и стимулировало деятельность микроорганизмов, в первую очередь, бактерий-аммонификаторов и грибов, обладающих гидролитическими ферментами, что привело к накоплению в почве минеральных форм азота, и последующему активному размножению олигонитрофилов.
Азид натрия оказал влияние и на такие показатели грибных популяций, как длина мицелия и соотношение в структуре популяций микромицетов с окрашенным (меланизированным) и бесцветным мицелием. Особенно показателен факт резкого возрастания в структуре микромицетов меланизированных форм, что в современной научной литературе однозначно трактуется как показатель загрязнения среды, накопления в ней поллютантов различной химической природы. При исследовании фототрофного микробного комплекса, включающего водоросли и цианобактерии, было установлено возрастание видового обилия и численности клеток микрофототрофов под влиянием азида натрия.
Применение азида натрия в концентрации 0,5 % нельзя считать безопасным для флоры высших растений, хотя почвенные микробоценозы угнетения не испытывают, наоборот, наблюдается стимуляция размножения различных групп микроорганизмов: бактерий-аммонификаторов, микромицетов, водорослей и цианобактерий. Одним из путей, снимающих стрессовое воздействие азида натрия на высшие растения, может быть предварительная обработка почвы данным препаратом до посева семян.
Таким образом, применение азида натрия возможно в качестве консерванта биологических препаратов и дезинфектанта почв на урбанизированных территориях в местах скопления фекалий.
Литература
1. Авдюхина Т.И., Лысенко А.Я., Федоренко Т.Н. и др. Сероэпидемиоло-гия токсокароза и токсоплазмоза в смешанных очагах. Пикацизм и серопо-раженность детей // Мед. паразитол. - 1987. - № 3. - С. 39-41.
2. Багай Л.И. Химия и технология инициирующих веществ. - М., 1975. -С.158.
3. Жданова О.Б. Токсокароз домашних и диких плотоядных в Кировской области // Матер. докл. науч. конф. «Современные проблемы ветеринарной медицины». - Киров, 2004. - С. 34-37.
4. Назарова С.Г., Жданова О.Б. Зараженность токсокарозом собак и клеточных песцов разных возрастных групп // Матер. 1-й междунар. науч. конф. «Современные вопросы ветеринарной медицины и биологии». - Уфа, 2005.- С. 226-227.
5. Чебышев Н.В. Субмикроскопическое изучение печени мышей и поросят, зараженных аскаридозом // Сб. науч. трудов 1ММИ: Ультраструктурные аспекты морфогенеза в норме и при патологии.- М.,-1976.-С. 318-322.
6. Чебышев Н.В. Гистологическое, гистохимическое и электронно-микроскопическое изучение легких мышей, зараженных аскариозом // Сб. науч. тр. 1ММИ «Актуальные вопросы современной паразитологии». - М., 1975. -С.111-113.
7. Чебышев Н.В., Гринева Г.Г. Гистологическое, гистохимическое и электронно-микроскопическое изучение печени экспериментальных животных, зараженных аскариозом // Сб. науч. тр. «Актуальные вопросы Тропической медицины». - М., 1976. - С. 220-222.
Ecological aspects of application of azid sodium as preservative and disinfectant of soil of the urbanized territories
S.P. Ashihmin, L.I. Domracheva, O.B. Zhdanov, L.V. Kondakova, L.R. Mutoshvili, L.B. Popov
The opportunity of application of sodium azid in 0,3 and 0,5 % concentration as preservative for fixing biological material is investigated. The organs keep color, consistence, form and macrostructure during 360 days fixings. 63 % of Toxocara canis eggs perished during 2 days in 0,3-0,5 % solution of sodium azid. It is underlined an opportunity of application of sodium azid for disinfection of the ground contaminated by helminths eggs.
Keywords: sodium azid, preservative, biomaterial, fixing, disinfection, Toxocara canis eggs.
Российский паразитологический журнал, 2010, № 2
