CC BY
68
УДК 616.89:615.7:616-097
ЭФФЕКТЫ ДИАЗЕПАМА НА СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ОРГАНОВ ТРЕВОЖНЫХ САМЦОВ МЫШЕЙ
Михаил Владимирович ТЕНДИТНИК1, Анна Вениаминовна ШУРЛЫГИНА1,
Евгения Владимировна МЕЛЬНИКОВА1, Наталья Григорьевна ПАНТЕЛЕЕВА1,
Дмитрий Александрович СМАГИН2, Наталья Петровна БОНДАРЬ2,
Наталия Николаевна КУДРЯВЦЕВА2, Валерий Алексеевич ТРУФАКИН3
1НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4
Институт цитологии и генетики СО РАН
630090, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10
3НИИ физиологии СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4
Исследовали влияние анксиолитика диазепама на субпопуляционный состав лимфоцитов тимуса и селезенки у самцов мышей, находящихся в условиях хронического социального стресса, который приводит к развитию выраженного состояния тревоги и иммуносупрессии: снижение органного индекса тимуса, процента тимоцитов СБ4+8+, спленоцитов СБ4+8-, СБ4-8+, СБ 16/32+, СБ19+. Диазепам, оказывая анксиолитический эффект, повысил весовой индекс тимуса, процент СБ4+8+ тимоцитов, СБ4+8-, СБ4-8+, СБ16/32+ спленоцитов, активность сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов крови, что можно расценивать как позитивное влияние на параметры иммунного статуса.
Ключевые слова: социальный стресс, тревожность, диазепам, иммунодефицит, лимфоциты.
Очевидно, что многие заболевания, особенно онкологические, протекают на фоне негативного эмоционального стресса, выраженной тревоги и страха. В свою очередь эти же эмоциональные состояния сопровождаются развитием иммуносу-прессивных процессов, которые ухудшают течение многих болезней, в том числе приводят к развитию онкопатологии. Естественно, что это ведет к еще более выраженной тревоге, которая часто принимает патологический характер. Возникает вопрос: как и с помощью каких воздействий можно разорвать этот порочный круг, приводящий к быстрым и часто необратимым последствиям для человека? Стоит отметить, что взаимосвязь между этими двумя процессами — хронической тревогой и иммунодефицитными состояниями — целенаправленно не исследуется.
В наших экспериментах было показано, что хронический социальный стресс, вызванный повторным опытом социальных поражений в ежедневных межсамцовых конфронтациях, ведет к развитию высокого уровня тревожности у самцов мышей [1]. У таких животных было установлено
также снижение многих показателей клеточного и гуморального иммунитета [2—6]. Более того, у тревожных животных, которым трансплантировали клетки различных видов опухолей, число метастазов в легких было существенно больше, чем у контрольных животных, проживавших в группах со стабильными иерархическими отношениями [7, 8]. Широко используемый в клинике анксио-литик диазепам, который эффективно снижает состояние тревоги у животных и людей [9, 10], снизил скорость экспериментального метастазиро-вания у тревожных мышей [11]. Целью настоящего исследования было проверить предположение о том, что диазепам может позитивным образом влиять на показатели сниженного иммунитета у тревожных мышей.
Материал и методы
Эксперименты проводили на половозрелых самцах мышей линии С57БЬ/61 в возрасте 2,5—3 мес., массой тела 26—28 г, которых разводили в стандартных условиях вивария Института цитологии и генетики СО РАН, пищу (гранулы) и воду животные получали в неограниченном количестве при
Тендитник М.В. — к.б.н., н.с., e-mail: M.V.Tenditnik@physiol.ru Шурлыгина А.В. — д.м.н., проф., гл.н.с.
Мельникова Е.В. — н.с.
Пантелеева Н.Г. — н.с.
Смагин Д.А. — ст. лаб. исследователь Бондарь Н.П. — к.б.н., н.с.
Кудрявцева Н.Н. — д.б.н., зав. сектором Труфакин В.А. — академик РАМН, директор
световом режиме 12 х 12 часов. Количество животных в экспериментальных группах составляло от 6 до 12 особей.
Как и ранее, в наших экспериментах для получения тревожных животных с выраженным им-мунодефицитным состоянием использовали модель сенсорного контакта [12, 13], позволяющую исследовать эффекты хронического социального стресса, вызванного повторным опытом социальных поражений в ежедневных межсамцовых конфронтациях (20 дней) с сильным и агрессивным партнером.
Для изучения эффекта диазепама на показатели иммунитета использовали способ введения, позволяющий исследовать протекторный эффект препаратов [14] при превентивном введении на фоне воздействия хронического социального стресса. Для этого с 7-го дня агонистических взаимодействий половине стрессированных животных начинали вводить внутрибрюшинно физиологический раствор, другой половине вводили диазепам (0,5 мг/кг, «РоИа ТагсИошш Б.А.», Польша) в течение двух недель на фоне продолжающихся конфронтаций. В качестве контроля были использованы интактные животные, рассаженные на 5 дней в индивидуальные клетки для снятия эффекта групповых взаимодействий.
С целью выяснения анксиолитического эффекта диазепама перед исследованием иммунных показателей было протестировано поведение стрессированных самцов методом оценки поведенческой активности мышей возле перегородки при реакции на партнера в соседнем отсеке. Снижение этой активности ассоциируется со многими показателями тревожности у мышей [15].
На следующий день после последней конфронтации у животных брали кровь, извлекали тимус и селезенку и готовили клеточную суспензию из полученных органов. Количество ядросодержащих клеток в суспензии подсчитывали в камере
Горяева. Процентное соотношение субпопуляций лимфоцитов определяли методом проточной ци-тофлуорометрии. В работе использовали моноклональные антитела («Pharmingen», США) к CD3, CD4, меченные флуоресцеином-5-изотиоцинатом и антитела к CD25, CD16/32, CD8, меченные фикоэритрином. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре «FACS Calibur» («Becton Dickinson», США), используя программное обеспечение «Cell Quest».
Активность дегидрогеназ лимфоцитов крови — сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и лактатде-гидрогеназы (ЛДГ) — определяли цитохимическим количественным методом с использованием п-нитротетрозолия фиолетового. Активность фермента оценивали по среднему количеству гранул формазана в 1 лимфоците. В каждом мазке подсчитывали гранулы в 40 клетках.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрического критерия Вилкоксона — Манна — Уитни (U-критерий).
Результаты
Как и ранее в аналогичном эксперименте [10], диазепам оказал выраженный анксиолитический эффект: поведенческая активность возле перегородки в реакции на партнера в соседнем отсеке у стрессированных мышей, которым хронически вводили диазепам для снятия тревожного состояния, оказалась существенно выше, чем у аналогичной группы самцов, которым вводили физиологический раствор (данные по поведению не приводятся).
По сравнению с интактными животными в тимусе стрессированных самцов мышей, получавших физиологический раствор на фоне продолжающихся конфронтаций, было обнаружено снижение органного индекса (р < 0,01) и процентного содержания незрелых Т-клеток с фенотипом CD4+8+ (р < 0,05) (табл. 1). В то же время у
Таблица 1
Субпопуляционный состав лимфоцитов тимуса экспериментальных мышей, % (M ± т)
Показатель Интактные мыши Стрессированные мыши
Физиологический раствор Диазепам
Индекс тимуса 1,54 + 0,11 0,86 ± 0,07++ 1,24 + 0,06**
CD4+8- 1,82 + 0,38 2,69 ± 0,31 2,15 + 0,15
CD4+8+ 88,16 + 2,89 80,52 ± 1,31+ 83,23 + 1,51
CD48+ 8,05 + 2,11 11,64 ± 0,54 11,44 + 1,18
CD16/32+ 73,00 + 2,13 77,72 ± 1,02 70,65 + 2,29**
CD25+ 8,18 + 0,83 10,88 ± 1,68 12,67 + 3,02
Примечание: + — отличие от соответствующего показателя интактных животных достоверно при р < 0,05, ** — отличие от соответствующего показателя стрессированных животных, которым вводился физиологический раствор, достоверно при р < 0,01.
Таблица 2
Субпопуляционный состав лимфоцитов селезенки экспериментальных мышей, % (М ± т)
Показатель Интактные мыши Стрессированные мыши
Физиологический раствор Диазепам
Индекс селезенки 3,86 ± 0,21 4,94 ± 0,73 4,38 ± 0,50
СБ4+8- 13,57 ± 0,65 9,71 ± 0,95+ 16,17 ± 1,68***
СБ48+ 14,05 ± 0,73 10,10 ± 1,07+ 16,62 ± 1,77**
СБ16/32+ 24,00 ± 1,47 14,27 ± 2,11++ 28,44 ± 3,33***
СБ19+ 64,30 ± 1,50 55,63 ± 1,93++ 60,65 ± 1,92
СБ19+25+ 1,94 ± 0,18 3,46 ± 0,24+++ 2,72 ± 0,48
СБ25+ 3,86 ± 0,25 5,53 ± 0,34++ 5,42 ± 0,51+
Примечание: здесь и на рисунке отличие от соответствующего показателя интактных животных достоверно:
+ — при р < 0,05, ++ — при р < 0,01, +++ — при р < 0,001; отличие от соответствующего показателя стрессирован-ных животных, которым вводился физиологический раствор, достоверно: ** — при р < 0,01, *** — при р < 0,001.
стрессированных самцов, получавших физиологический раствор, по сравнению с интактными мышами в селезенке было снижено процентное содержание зрелых Т-хелперов (СБ4+8-) (р < 0,05), зрелых Т-эффекторов (СБ4-8+) (р < 0,05), клеток с фенотипом СБ16/32+, значительная часть которых относится к популяции моноцитов/макрофагов, и NK-клеток (р < 0,01), В-клеток (СБ19+) (р < 0,01), но повышен процент активированных В-клеток (СБ19+25+) (р < 0,001) и общего содержания активированных спленоцитов СБ25+ (р < 0,01) (табл. 2). Активность СДГ и ЛДГ лимфоцитов крови стрессированных мышей оставалась на том же уровне, что и у интактных животных (рис.).
Хроническое введение диазепама самцам на фоне социального стресса привело к купированию многих изменений по сравнению со стрес-
Интактные мыши Стрессированные мыши
Рис. Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ)
лимфоцитов крови экспериментальных животных, гранул/лимфоцит
сированными животными, которым вводили физиологический раствор. Весовой индекс тимуса стрессированных мышей достоверно повысился и не отличался от показателя интактных самцов (р < 0,01), увеличилось процентное содержание клеток СБ16/32+ среди общего количества тимоцитов (р < 0,01) (табл. 1). В селезенке возросло процентное содержание зрелых Т-хелперов (СБ4+8) (р < 0,001), зрелых Т-эффекторов (сБ4-8+) (р < 0,01), клеток с фенотипом СБ16/32+ (р < 0,001) (табл. 2).
Под действием диазепама увеличилась активность СДГ лимфоцитов крови стрессированных мышей, по сравнению как с интактными животными, так и с животными, получавшими физиологический раствор (р < 0,001) (рис.).
Обсуждение
Ранее было показано, что хронический социальный стресс, вызванный повторным опытом социальных поражений, приводил к снижению иммунной реакции на Т-зависимый антиген — эритроциты барана [2, 3], перераспределению субпопуляций Т-лимфоцитов СБ8+ с их накоплением в костном мозге [4], а также к снижению числа Т-клеток СБ3+, СБ4+, СБ8+, СБ3+25+ в тимусе и спленоцитов СБ3+, СБ8+ в селезенке [5, 6]. В данном эксперименте у стрессированных самцов по отношению к интактному контролю были уменьшены весовой индекс тимуса и процентное содержание незрелых Т-клеток СБ4+8+. В селезенке стрессированных мышей было обнаружено значительное снижение процентного содержания лимфоцитов с фенотипами СБ4+8-, СБ48+, СБ16/32+, СБ19+ и увеличено относительное количество лимфоцитов с фенотипами СБ19+25+ и СБ25+. Возможно, что эти изменения обусловлены сдвигом нейрохимического баланса в мозге в сторону преобладания активности серотонерги-
ческой системы, выявленной у стрессированных животных [16], так как показано, что ее активация сопровождается супрессией Т-клеточного звена иммунитета [17]. Таким образом, полученные данные в дополнение к установленным фактам демонстрируют, что социальный стресс приводит к значительному дисбалансу в иммунной системе с признаками развития иммунодефицитного состояния.
Хроническое введение диазепама на фоне продолжающихся конфронтаций привело к нормализации органного индекса тимуса и восстановлению процентного соотношения незрелых Т-клеток с фенотипом CD4+8+, число которых в данной группе уже не отличалось от значения интактно-го контроля. Введение диазепама предотвратило снижение в селезенке числа лимфоцитов с фенотипами CD4+8-, CD48+, CD16/32+, CD19+. Повышение активности СДГ лимфоцитов крови и процентного содержания спленоцитов с фенотипом CD25+ можно расценивать как признаки активации клеток иммунной системы. Тот факт, что эти показатели после введения диазепама превысили значения интактного контроля, можно объяснить «эффектом отдачи» после супрессии, наблюдавшейся в группе стрессированных мышей.
Таким образом, исследование показало, что применение препарата, корригирующего психоэмоциональное состояние и оказывающего выраженный анксиолитический эффект, предотвращая, таким образом, развитие выраженного состояния тревоги, предупреждает развитие клеточного дисбаланса в иммунной системе. Ранее было показано, что введение диазепама уменьшает число метастазов в легкие при инокуляции тревожным животным карциномы Льюиса [11]. Это становится понятным с учетом результатов настоящего исследования, показавших, что введение диазепама стрессированным животным предотвращает снижение у них количества клеток, участвующих в противоопухолевом иммунитете — с фенотипом CD16/32+ и Т-эффекторов (CD48+) [18]. Являются ли эти процессы взаимосвязанными, или действие диазепама имеет различные механизмы воздействия на показатели иммунитета и онкологический процесс, предстоит выявить в эксперименте. Однако становится очевидной необходимость разработки комплексных методов коррекции иммунопатологических состояний и онкологических заболеваний, сопровождающихся повышенной тревожностью, с включением антидепрессивных и анксиолитиче-ских препаратов. При этом следует подчеркнуть, что эффективность каждого препарата предстоит выявлять в эксперименте.
Благодарности
Исследование проведено при поддержке фонда «Фундаментальные науки — медицине», грант 21.28.
Список литературы
1. Avgustinovich D.F., Gorbach O.V., Kudryavtseva N.N. Comparative analysis of anxiety-like behavior in partition and plus-maze tests after agonistic interactions in mice // Physiol. Behav. 1997. 1. 37—43.
2. Devoino L.V., Al’perina E.L., Kudryavtseva N.N., Popova N.K. Immune responses in male mice with aggressive and submissive behavior patterns: strain differences // Brain Behav. Immun. 1993. 7. 91—96.
3. Альперина Е.Л., Павина Т.А. Изменения в иммунной реактивности мышей линии C57BL/6 после социальных взаимодействий // Бюл. экспер. биол. мед. 1996. (11). 541—543.
Al’perina E.L., Pavina T.A. Changes in immunological reactivity of C57Bl/6 mice after the zooso-cial conflict // Byul. eksper. biol. med. 1996. (11). 541-543.
4. Идова Г.В., Павина Т.А., Альперина Е.Л. и др. Влияние субмиссивного и агрессивного типов поведения на изменение числа Т-лимфоцитов CD4+ и CD8+ в костном мозге // Иммунология. 2000. (1). 24-26.
Idova G.V., Pavina T.A., Al’perina E.L. et al. Influence of submissive and aggressive types of behavior on the change of bone marrow T-lymphocyte CD4+ and CD8+ number // Immunologiya. 2000. (1). 24-26.
5. Грязева Н.И., Шурлыгина А.В., Вербицкая Л.В. и др. Изменение некоторых показателей иммунного статуса мышей под влиянием хронического социального конфликта // Рос. физиол. журн. 1999. (8). 1035-1042.
Gryazeva N.I., Shurlygina A.V., Verbitskaya L.V. et al. Changes in various parameters of the mouse immune status under the influence of chronic social conflict // Ros. fiziol. zhurn. 1999. (8). 1035-1042.
6. Тендитник М.В., Шурлыгина А.В., Мельникова Е.В. и др. Изменение субпопуляционного состава лимфоцитов иммунокомпетентных органов мышей под влиянием хронического социального стресса // Рос. физиол. журн. 2004. (12). 15221529.
Tenditnik M.V., Shurlygina A.V., Mel’nikova E.V. et al. Effect of chronic psychoemotional stress on subpopulation spectrum of T-lymphocytes in immunocompetent organs in male mice // Ros. fiziol. zhurn. 2004. (12). 1522-1529.
7. Каледин В.И., Тендитник М.В., Николин В.П. и др. Влияние психоэмоционального состояния на рост и метастазирование опухоли Льюиса у мышей // Докл. биол. наук. 2006. 406. 57-59.
Kaledin V.I., Tenditnik M.V., Nikolin V.P. et al. Effect of psychoemotional state on growth and metastasis of Lewis tumor in mice // Dokl. biol. nauk. 2006. 406. 57-59.
8. Kudryavtseva N.N., Tenditnik M.V., Nikolin V.P. et al. The influence of psychoemotional status on metastasis of Lewis lung carcinoma and hepatocarcino-
ma-29 in mice of C57BL/6J and CBA/Lac strains // Exp. Oncol. 2007. (1). 35-38.
9. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 2008. 1216 с.
Mashkovskiy M.D. Medical product. M., 2008. 1216 p.
10. Коваленко И.Л., Кудрявцева Н.Н. Тревожность как фактор развития симптомов аутистического спектра: экспериментальное исследование // Журн. высш. нервн. деят. (в печати).
Kovalenko I.L., Kudryavtseva N.N. Anxiety as a factor in the development of autistic symptoms: An experimental study // Zhurn. vyssh. nervn. deyat. (in press).
11. Kaledin V.I., Ilnitskaya S.I., Nikolin V.P. et al. Limiting effect of diazepam on Lewis Lung carcinoma metastasis in anxious male mice // Exp. Oncol. 2009.
(1). 62-64.
12. Kudryavtseva N.N. The sensory contact model for the study of aggressive and submissive behaviors in male mice // Aggress. Behav. 1991. (5). 285-291.
13. Kudryavtseva N.N., Bakshtanovskaya I.V., Koryakina L.A. Social model of depression in mice of
C57BL/6J strain // Pharmacol. Biochem. Behav. 1991. 38. 315-320.
14. Kudryavtseva N.N., Avgustinovich D.F., Bondar N.P. et al. An experimental approach for the study of psychotropic drug effects under simulated clinical conditions // Curr. Drug Metab. 2008. (4). 352-360.
15. Kudryavtseva N.N. Experience of defeat decreases the behavioral reactivity to conspecifics in the partition test // Behav. Proces. 1994. 32. 297-304.
16. Кудрявцева Н.Н., Бакштановская И.В. Нейрохимический контроль агрессии и подчинения // Журн. высш. нервн. деят. 1991. (5). 459-466.
Kudryavtseva N.N., Bakshtanovskaya I.V. The neurochemical control of aggression and submission // Zhurn. vyssh. nervn. deyat. 1991. (5). 459-466.
17. Pellegrino T.C, Bayer B.M. Role of central 5-HT(2) receptors in fluoxetine-induced decreases in T lymphocyte activity // Brain Behav. Immun. 2002.
(2). 87-103.
18. Фрейдлин И.С., Тотолян A.A. Клетки иммунной системы. СПб, 2001. 390 с.
Freydlin I.S., Totolyan A.A. Cells of immune system. SPb, 2001. 390 p.
DIAZEPAM EFFECT ON SUBPOPULATION SPECTRUM OF IMMUNOCOMPETENT ORGANS LYMPHOCYTES IN ANXIOUS MALE MICE
Michail Vladimirovich TENDITNIK1, Anna Veniaminovna SHURLYGINA1,
Evgenia Vladimirovna MEL’NIKOVA1, Nataliya Grigorjevna PANTELEEVA1,
Dmitriy Aleksandrovich SMAGIN2, Nataliya Petrovna BONDAR’2,
Nataliya Nikolaevna KUDRYAVTSEVA2, Valeriy Alekseevich TRUFAKIN3
1Institute of Clinical and Experimental Lymphology SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov st., 4
2Institute of Cytology and Genetics SB RAS 630090, Novosibirsk, Lavrent’ev av., 10
3Institute of Physiology SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov st., 4
The effect of chronic diazepam treatment on subpopulations of lymphocytes of the thymus and spleen in male mice being under condition of chronic social stress, which leads to pronounced anxiety and immune suppression development: decrease in thymus organ index, percentage of thymocytes CD4+8+, splenocytes CD4+8-, CD4-8+, CD 16/32+, CD19+, has been investigated. Diazepam, providing an anxiolytic effect, increased a thymus weight index, percentage ratio of CD4+8+ thymocytes, CD4+8-, CD4-8+, CD16/32+ splenocytes, succinate dehydrogenase activity. It can be considered as its positive effect on the immune status parameters.
Key words: social stress, anxiety, diazepam, immunodeficiency, lymphocyte.
Tenditnik M.V. — candidate of biological sciences, researcher, e-mail: M.V.Tenditnik@physiol.ru
Shurlygina A.V. — doctor of medical sciences, professor, senior researcher
Mel’nikova E.V. — researcher
Panteleeva N.G. — researcher
Smagin D.A. — senior laboratory researcher
Bondar ’ N.P. — candidate of biological sciences, researcher
Kudryavtseva N.N. — doctor of biological sciences, head of sector
Trufakin V.A. — academician of RAMS, director
