CC BY
21
Орипнальна стаття = Original article = Оригинальная статья
DOI: https://doi.org/10.25305/unj.113909
Ефектившсть пластики дефекту периферичного нерва з використанням тканинно-шженерних провщниюв рiзних типiв за даними електронейромюграфм: експериментальне дослiдження
Цимбалюк В.1.1'2, Петр1в Т.1.1, Медведев В.В.2, Татарчук М.М.1, Драгунцова Н.Г.3, Васильев Р.Г.45
1 Вщдш вщновлювальноТ та фун-кцюнальноТ нейрохiрурп'', вщди лення вщновлювальноТ нейрохiрур-гп з рентген операцшною, 1нститут нейрохiрурп'' iM. акад. А.П. Ромода-нова НАМН УкраТни, КиТв, УкраТна
2 Кафедра нейрохiрурп'', Нацю-нальний медичний унiверситет iменi О.О. Богомольця, КиТв, УкраТна
3 Вщдш експериментальноТ ней-рохiрургiT та клЫчноТ фармакологи, лабораторiя експериментальноТ нейрохiрургiT, 1нститут нейрохiрур-riT iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН УкраТни, КиТв, УкраТна
4 Лабораторiя цитогенетики, 1нсти-тут генетичноТ та регенеративно!' медицини НАМН УкраТни, КиТв, УкраТна
5 Медична компашя ilaya®, Бю-технолопчна лабораторiя ilaya. regeneration, КиТв, УкраТна
Над1йшла до редакцп 04.11.2017. Прийнята до публ1кацп 21.11.17.
Адреса для листування:
Петр'1в Тарас 1горович, вддлення вщновлювально/ нейрох1рургп, 1нститут нейрох1рургп, вул. Платона Майбороди, 32, Ки/в, Укра/на, 04050, e-mail: petrivtaras@gmail. com
Мета. Вивчити в експеримент вплив мультипотентних стовбурових кл^ин - похщних нервового гребеня (МСК-ПНГ) на вщновлення функцп периферичного нерва (ПН) за даними електронейромюграфм (ЕНМГ). Матер1али i методи. Експериментальш тварини: 6mi безпороднi щурЬ самцi вiком 5,5 Mic, маса тта (250±50) г, вiварiй 1нституту нейрохiрургiT n = 52); групи: група 1 — переачення ciдничого нерва (СН) невротомiя (створення дефекту довжиною 1см) та негайна аутопластика (n=14); група
2 — невротомiя та негайна пластика з використанням колагеновот трубки, заповненот фiбрином (n=15); група 3 — невротомiя та негайна пластика
3 використанням колагеновот трубки, заповненот фiбриновим гелем з вмютом МСК-ПНГ (n=16); група 4 — несправжньо опероваш тварини (n=7). Визначення показниюв еНМг шляхом прямот cтимуляцiйноT ЕНМГ на 4-му та 8-му тижнях експерименту.
Результати. Наприюнц 4-го тижня спостереження у грут 1 ампл^уда М-вщпов^ (Амв) задньоТ паретичноТ кшщвки (ЗПК) статистично значущо (р=0,018) поступалась такш задньоТ iнтактноT кiнцiвки (З1К) - вiдповiдно (3,3±0,5) та (16,5±2,3) мВ. У групах 2 i 3 в цi строки вщзначали статистично значуще (р=0,018) переважання Амв З1К - в iнтактнiй юнщвщ в групi 2 - (16,5±2,3) та (0,9±0,2) мВ, в грут 3 - (14,7±2,2) та (2,3±0,2) мВ. Через 8 тиж спостереження виявляли статистично значуще переважання Авм ЗПК у тварин групи 1 - (4,1±0,7) мВ лише порiвняно з показником в грут 2 - (1,4±0,3) мВ (р=0,007).
Висновки. МСК-ПНГ справляють позитивний вплив на регенера^ю ПН внаcлiдок cтимуляцiT проростання бшьшо'т' кiлькоcтi нервових волокон, шж при iмплантацiT колагенового матрикса без МСК-ПНГ, що опосередковано вiдображали показники ЕНМГ.
Ключовi слова: травма периферичного нерва; аутонейропластика; тканинна ¡нженер/я; колагеновий матрикс; мультипотентнi стовбуровi кл':тини-пох':дн': нервового гребеня; експеримент.
Укра'шський нейрохiрургiчний журнал. 2017;(4):60-6.
Efficiency of peripheral nerve gaps restoration by different types of tissue engineering constructs according to electromyography: experimental study
Vitaliy I. Tsymbaliuk12, Taras I. Petriv1, Volodymyr V. Medvediev2, Mikhail M. Tatarchuk1, Natalya G. Draguntsova3, Roman G. Vasyliev4,5
1 Restorative Neurosurgery Department, Romodanov Neurosurgery Institute, Kyiv, Ukraine
2 Department of Neurosurgery, Bogomoletz National Medical University, Kyiv, Ukraine
3 Division of Experimental Neurosurgery and Clinical Pharmacology, Laboratory of Experimental Neurosurgery, Kyiv, Ukraine
4 Laboratory of Cytogenetics, Institute of Genetic and Regenerative Medicine,Kyiv, Ukraine
5 Biotechnology Laboratory ilaya. regeneration, Medical Company ilaya ®, Kyiv, Ukraine
Received, November 04, 2017. Accepted, November 21, 2017.
Address for correspondence:
Taras I. Petriv, Restorative Neurosurgery Department, Romodanov Neurosurgery Institute, 32 Platona Mayborody St., Kyiv, Ukraine, 04050, e-mail: petrivtatas@ gmail.com
Objective. To investigate the effect of neural crest-derived multipotent stem cells (NC-MSCs) on the restoration of the peripheral nerve function according to the EMG.
Materials and methods. Experimental animals: white outbreed male rats (5.5 months, 250±50 g, vivarium Romodanov Neurosurgery Institute n=52); groups: group 1 - nerve transection (with a 1 cm gap) and immediate autoplasty (n=14); group 2 - nerve transection and immediate plastic with collagen tube filled with fibrin gel (n=15); group 3 - nerve transection and immediate plastic with collagen tube filled with fibrin gel containing NC-MSCs (n=16); group 4 - sham operated animals (n=7). The key EMG parameters were determined using direct stimulation EMG at the 4th and 8th weeks of the experiment.
Results. As at the end of the 4th week of observation in group 1, the amplitude of the M-response of the experimental limb was significantly (p=0.018) inferior to the value of the intact limb (3.3±0.5 mV versus 16.5±2.3 mV). In groups 2 and 3, statistically significant (p=0.018) values of the intact limb were observed for the amplitude of the M-response (group 2 - 16.5±2.3 mV versus 0.9±0.2 mV, group 3 - 14.7±2.2 mV versus 2.3±0.2 mV, p=0.018) and the conduction velocity (group 2 - 22.3±1.6 m/s versus 7.9±2.1 m/s (p=0.018; Mann - Whitney U test); group 3 - 19.3±2.5 m/s versus 12.7±0.4 m/s (p=0.049; Mann - Whitney U test). The value of the amplitude of the M-response in group 2 (0.9±0.2 mV) was significantly lower than that of group 1 (3.3±0.5 mV; p=0.006), group 3 (2.3±0, 2 mV; p=0.002) and group 4 (16.6±1.4 mV; p=0.006). As at the 8th week of observation, there was a significant advantage of the M-response amplitude of the experimental limb
© Цимбалюк В.1., Петрiв Т.1., Медведев В.В., Татарчук М.М., Драгунцова Н.Г., Васильев Р.Г., 2017
of animals in group 1 (4.1±0.7 mV) only above the value in group 2 (1.4±0.3 mV; p=0.007).
Conclusions. NC-MSCs has a positive effect on the regeneration of PN due to stimulation of growth a greater number of nerve fibers than with implantation of a collagen matrix without NC-MSCs, which indirectly reflects key EMG indicators.
Keywords: peripheral nerve injury; autoneuroplasty; tissue engineering; collagen matrix; neural crest derived multipotent stem cells; electromyography.
Ukrainian Neurosurgical Journal. 2017;(4):60-6.
Эффективность пластики дефекта периферического нервас применением ткане-инженерных проводников разных типов по данным электронейромиографии: экспериментальное исследование
Цымбалюк В.1.12, Петрив Т.1.1, Медведев В.В2, Татарчук М.М.1, Драгунцова Н.Г3Васильев Р.Н'-
1 Отдел восстановительной и функциональной нейрохирургии, отделение восстановительной нейрохирургии с рентгеноперацыонной, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины, Киев, Украина
2 Кафедра нейрохирургии, Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца; Киев, Украина
3 Отдел экспериментальной нейрохирургии и клинической фармакологии, лаборатория экспериментальной нейрохирургии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины, Киев, Украина
4 Лаборатория цитогенетики, Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины, Киев, Украина
5 Медицинская компания «ilaya®», Биотехнологическая лаборатория «ilaya.regeneration», Киев, Украина
Поступила в редакцию 04.11.2017. Принята к публикации 21.11.2017.
Адрес для переписки:
Петрив Тарас Игоревич, отделение восстановительной нейрохирургии, Институт нейрохирургии, ул. Платона Майбороды, 32, Киев, Украина, 04050, e-mail: petrivtaras@gmail.com
Цель. Изучить влияние МСК-ПНГ на восстановление функции периферического нерва по данным ЕНМГ.
Материалы и методы. Экспериментальные животные: Белые беспородные крысы-самцы, возраст 5,5 мес, масса тела (250±50) г, виварий Института нейрохирургии (п=52); группы: группа 1 - пересечение седалищного нерва, невротомия (длина дефекта 1 см) и немедленная аутопластика (п=14); группа 2 - невротомия и немедленная пластика с применением коллагеновой трубки, заполненной фибрином (п=15); группа 3 - невротомия и немедленная пластика с применением коллагеновой трубки, заполненной фибриновым гелем с содержанием МСК-ПНГ (п=16); группа 4 - ложно оперированные животные (п=7). Определение показателей ЭНМГ путем прямой стимуляционной ЭНМГ на 4-й и 8-й неделях эксперимента.
Результаты. По состоянию на конец 4-й недели наблюдения в группе 1 амплитуда М-ответа паретичной конечности статистически значимо (р=0,018) уступала таковой в интактной конечности - (3,3±0,5) и (16,5±2,3) мВ. В группах 2 и 3 отмечено статистически значимое (р=0,018) преимущество амплитуды М-ответа в интактной конечности, в группе 2 - (16,5±2,3) и (0,9±0,2) мВ; в группе 3 - (14,7±2,2) и (2,3±0,2) мВ (р = 0,018), а также скорости проведения возбуждения, в группе 2 - (22,3±1,6) и (7,9±2,1) м/с (р=0,018; и-тест Мана-Уитни); в группе 3 - (19,3±2,5) и (12,7±0,4) м/с; (р=0,049; и-тест Мана-Уитни). Черех 8 нед наблюдения отмечали статистически значимое преимущество амплитуды М-ответа паретичной конечности животных группы 1 - (4,1±0,7) мВ только по сравнению с показателем в группе 2 - (1,4±0,3) мВ (р=0,007). Выводы. МСК-ПНГ оказывают положительное влияние на регенерацию ПН вследствие стимуляции прорастания большего количества нервных волокон, чем при имплантации коллагенового матрикса без МСК-пНг, что отражают показатели ЭНМГ.
Ключевые слова: травма периферического нерва; аутонейропластика; тканевая инженерия; коллагеновый матрикс; мультипотентные стволовые клетки-производные нервного гребня; электронейромиография; эксперимент.
Украинский нейрохирургический журнал. 2017;(4):60-6.
Вступ. Травма опорно-рухового апарату, нав^ь незначна, може супроводжуватися ушкодженням ПН та спричинити часткову чи повну втрату функци юншвок. Юльюсть таких постраждалих кожного року збтьшуеться у зв'язку з збтьшенням частоти тех-ногенних травм та складних поеднаних ушкоджень опорно-рухового апарату [1]. Бурхлива урбашзашя зумовлюе збшьшення загального нейротравматизму у середньому на 2% за рк [2].
В УкраТш кожного року травма виникае у 2,5-3 тис. потерптих, з них у 60-75% встановлюють ш-валщшсть [3]. У структурi травм опорно-рухового апарату, ушкодження ПН становить вщ 1,5 до 6%, з
них 90% — верхньоТ юншвки [4]. Пщ час вшськових дш цей показник становить 12%, травму ПН спос-тер^ають у 2,8-5% потерптих при пол^равм^ в^ таких пашен^в у середньому вщ 18 до 44 роюв, що свщчить про значну соцiально-економiчну значущють проблеми [5].
Протягом останшх роюв досягнув значш устхи у вщновленш ПН, зокрема, завдяки впровадженню мiкрохiрургiчноТ техшки, операцшного м^роскопа, електростимуляцшних методик, покращенню можли-востей для реабЫтаци [6]. Проте, нав^ь адекватно виконане реконструктивне втручання з використан-ням нов^шх досягнень дiагностики та л^ування,
Стаття м'ютить рисунки, яю в'щображаються в друкован'1й версп у в'щт'!нках арого, в електронн'1й — у кольор'1.
як правило, не забезпечуе повноцшне вщновлення функци юнщвки i проблема вiдновлення втрачених функцш при ушкодженнi ПН не виршена [1,2,5,6].
Сьогоднi «золотим стандартом" вщновлення ПН за ix великих дефек^в вважають аутонейропластику. Великим е дефект, за якого шов юнець укiнець та спонтанна регенерацiя нерва неможливк На думку бiльшостi авторiв, це дефект довжиною 3 см i бiльше [6-10].
Проте, аутонейропластика мае ряд недолив. Для отримання аутотрансплантата використовують в основному чутливi нерви, найчастiше як донор - литковий нерв n.suralis [11]. Використання чутливих нервiв як аутотрансплантата для пластики дефек^в рухових нервiв супроводжуеться морфолопчною невiдповiднiстю природного мiкрооточення та рiз-ницею дiаметра аксонiв, що затримуе пролiферацiю нейролемоцитiв та 'х здатнiсть мiелiнiзувати нервовi волокна [8, 10].
^м цього, небажаними чинниками е додаткова операшя для видтення трансплантата, функцюналь-ний дефiцит в автономшй зонi нерва донора, утворен-ня двох зон нейрорафií, утворення невром та руб^в, що утруднюе проростання аксонiв [11].
Перспективною альтернативою аутонейроплас-тицi е нейроiнженерний тдхщ, що передбачае використання бюсумюних бiодеградуючиx матриксiв, стовбурових клiтин та трофiчниx чинникiв [12].
Однiею з вимог до перспективного у клЫчному вщношенш джерела стовбурових клiтин е аутоло-гiчнiсть та легка доступшсть, тобто, можливiсть нескладного отримання у патента. З цiе' точки зору оптимальними е постнатальш МСК-ПНГ (neural crest-derived multipotent stem cells).
При нейроонтогенезi тд час змикання нервових валиюв утворюеться структура, названа нервовим гребнем. ^тини нервового гребеня мiгрують у товщi сомiтiв, формуючи елементи периферично' нервово' системи та значну кiлькiсть структур типово' мезенхЬ мально' генеалогií. Наявшсть серед клiтин нервового гребеня ссавшв стовбурових клiтин встановлена не-щодавно [13]. Стовбуровi клiтини нервового гребеня (СКНГ) дають початок численним ^тинам нейраль-ного фенотипу — нейронам та гли чутливих вузлiв, бтьшост черепних нервiв (за винятком зорового, нюхового, ймовiрно, присiнково-завиткового) [14], елементам перифершно!' частини смакового (за винятком сенсорних ^тин [15]), нюхового [16] аналiза-торiв (проте, не слухового [17]), ган^ям вегетативно'' нервово' системи, нейролемоцитам ПН тощо. ^тини мезенxiмального («ектомезенxiмального») фенотипу та структур, що утворюються з СКНГ, включають фiбробласти ПН, юстки черепа, гладеньк мiоцити артерiй голови та ши', перицити судин мозку, мозковi оболонки, ^тини пульпи зуба та одонтобласти, клЬ тини перiодонтальноí зв'язки та зубного сосочка, ади-поцити та ^тини дерми обличчя, сполучнотканиннi елементи залоз, м^в та сухожиль голови, стромальш клiтини рогiвки, м'язи вшчастого тiла. Окремо треба вiдзначити таю типи ^тин, що утворюються з СКНГ: тгментоцити — меланоцити шюри, пiгментнi клiтини внутрiшнього вуха та шшо' локалiзацií; рiзноманiтнi гормон-продукуючi кл^ини: xромафiннi клiтини мозково' речовини надниркових залоз, хромафшш клiтини каротидного тта, кальцитонiн-продукуючi
клiтини прищитоподiбниx залоз тощо [14]. СКНГ дають початок нестин-позитивним стовбуровим кл^инам строми юсткового мозку [18]. Зважаючи на нейро-генний, дальний (нейролемоцити, що продукують ПН) потеншал СКНГ, 'х використання у виновному лiкуваннi ушкоджених ПН е перспективним [19, 20]. З практично' точки зору доцтьним е використання не власне СКНГ, що е в ембрюна, а постнатальних МСК-ПНГ, що м^тяться у тканинах дорослого ор-гашзму. 1снування МСК-ПНГ у тканинах та органах постнатального оргашзму ссавшв було доведено в останш 20 рокiв [14].
Одним з найперспектившших джерел МСК-ПНГ е волосяний мшечок. Вiн складаеться з концентрич-но розташованих цилiндрiв, що мютять клiтини, якi продукують високоспецiалiзованi протеши, зокрема, кератин, основний компонент волосся i перебувають у постшному динамiчному станi: фаза росту (анаген), перехщна фаза (катаген), фаза спокою (телоген). МСК-ПНГ розташоваш у зонi потовщення тхви волосяного мiшечка (bulge of hair follicles) у точц при-крiплення к м'язу - тдшмачу е волосина (m. arrector pili) [21].
Група вчених пiд керiвництвом M. Sieber-Blum вщкрили 'х у 2004 р. i довели походження цих клЬ тин з нервового гребеня [21]. Сьогодш доведено, що МСК-ПНГ, видтеш з волосяного мiшечка, можуть диференцiюватися у нейрони, глiальнi кл^ини, ос-теобласти, гладеньком,язовi клiтини, меланоцити in vitro [20, 23] та демонструють цей мультилшшний по-теншал на клональному рiвнi [24]. Нестин-позитивш, кератин 15-негативнi клiтини можуть диференшюва-тися у нейрони при 'х пiдшкiрнiй iмплантацií бiлими мишам [22]. У дослщженнях морфофункцiональниx властивостей МСК-ПНГ in vitro доведено, що вони мають високий пролiферативний потеншал, здатш до мультилiнiйного диференцiювання, експресують антигени, характеры для ^тин нервового гребеня (Sox10, p75/CD271), нейральних стовбурових кл^ин (Sox2 та nestin), мезенxiмальниx МСК (CD44, CD73, CD90 та шшО [21, 23]. В культурi in vitro МСК-ПНГ здатш до клонального росту та самовщновлення [23, 24]. Видтеш з волосяних мшечюв гризушв та людини МСК-ПНГ, залежно вщ умов культивування, перетво-рювалися у ß-Ш-тубулш iмунопозитивнi нейрони та глюцити, що експресували протеiн S100ß, основний бток мiелiну (MBP), або дальний фiбрилярний кис-лий бiлок (GFAP) [23, 24].
Одним з найпоширешших методiв дослiдження функцií ПН е ЕНМГ. Основними показниками ЕНМГ е ампл^уда М-вщпов^ (АМВ) та швидюсть проведення збудження руховими волокнами нерва (ШРВ). АМВ опо-середковано вщображае кiлькiсть волокон, заданих пiд час скорочення м'яза, i е штегральним електрич-ним еквiвалентом збудження м'яза у дослщжуванш точцi. ШРВ вщображае ступiнь мiелiнiзацií та дiаметр рухових волокон нерва.
Мета дослщження. Провести порiвняльну оцш-ку ефективностi пластики дефекту ПН з використан-ням тканинно-шженерних провiдникiв рiзного типу за даними ЕНМГ.
Матерiали i методи. Дослщження проведене на 52-х бтих безпородних щурах-самцях, маса тiла (250±25) г, вiк 5-6 мiс, яких утримували у стандартних умовах вiварiю, з дотриманням чинних норм бюетики
(Директива Ради £С 86/609/ЕЕС «Про наближення закошв, тдзаконних та адммшстративних положень держав-члешв про захист тварин, яких використову-ють для експериментальних та шших наукових цшей», 1986: бвропейська Конвеншя про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментальних та наукових цтей, 1986; Закон УкраТни №3447-IV «Про захист тварин вiд жорстокого поводження», 2006. Протокол дослiдження схвалений Ком^етом з бiоетики 1нституту нейрохiрургN.
Тварини розподiленi на 4 групи: група 1 — фор-мування дефекту СН довжиною 1 см, та негайна аутопластика (n=14); група 2 — невротомiя, негайна пластика з використанням комерцшного провщника (NeuraGen®, Integra LifeSciences, США) -порож-нистоТ трубки з колагену I типу (n=15); група 3 — невротомiя, негайна пластика з використанням тканинно-шженерного провiдника на основi колагено-вого провщника NeuraGen®, заселеного син генними МСК-ПНГ (n=16); група 4 — несправжньо опероваш тварини (n=7).
МСК-ПНГ видшеш методом експлантатiв [22] з репону bulge волосяного мiшечка вуав безпорiдних дорослих щурiв - самщв (n = 3) вiварiю 1нституту нейрохiрургií 1нститут генетичноТ та регенеративное медицини.
Капсулу мшечка розрiзали вздовж, мiшечок переакали поперечно вище та нижче потовщення, яке видiляли з капсули та вмщували в чашку Петрi, вкриту колагеном. П^ля прикрiплення протягом 1 год експлантати заливали середовищем росту: aMEM («Sigma», США) з додаванням 5 % фетальноТ телячоТ сироватки («Sigma», США), 5 нг/мл основного фактору фiбробластiв («Sigma», США), 10 нг/мл етдермального фактору росту («Sigma», США), 1 % розчину в^амЫв MEM («Sigma», США), 1% поживноТ добавки ITS («Gibco», США), 2 ммоль глутамшу, 100 од/мл пенщилшу, 100 мкг/мл стрептомщину, 2,5 мкг/мл амфотерицину В. Культивування здшснюва-ли в мультигазовому iнкубаторi CB 210 ("BINDER", Ымеччина) при температурi 37° С у газовш сумiшi такого складу: 90 % N2, 5 % O2, 5 % СО2. Перший пасаж (П1) проводили на 10-ту добу в культуральний флакон 25 см2. Наступш пересiви кл^ин здiйснювали при досягненнi культурою субконфлуентного стану. Заавна концентрацiя при переавах становила 1000 клiтин/см2. Пасажування проводили з використанням 0,05 % розчину трипсину в 0,53 ммоль розчиш Na2EDTA («Sigma», США). В експеримент використо-вували клiтини П3-П5.
Тканинно-шженерний провiдник для пластики дефекту ПН заавали МСК-ПНГ за двохетапною тех-нiкою. Першим етапом заавали 200 тис МСК-ПНГ на внутршню поверхню колагенового провщника NeuraGen® довжиною 1,2 см. Для цього закривали один кшець трубки, вносили суспензiю клiтин у по-живному середовищi, та закривали другий кшець. Для рiвномiрного розподту клiтин провiдник вмiщували у ролерну установку CellNest Roller D2 (SINO-BIOTOP, Китай), що знаходилась у мультигазовому шкубатор^ та культивували протягом 24 год з швидюстю 20 об. хв. Другим етапом на наступну добу заавали ще 800 тис МСК-ПНГ у порожнину провщника шляхом полЬ меризаци фiбринового гелю, виготовленого з кровi щурiв. Для виготовлення фiбринового гелю у щурiв
збирали кров: 1) у центрифужш пробiрки без антикоагулянту для виготовлення сироватки, що метить тромбiн; 2) у центрифужш пробiрки з антикоагулянтом ACD-A ("Haemonetics", США) у стввщношенш 9:1 для отримання збагаченот тромбоцитами плазми (ЗТП). Кров без антикоагулянту шкубували у термостат при температурi 37° С на протягом 1 год для TT згортання. Центрифугували протягом 20 хв при температурi 4° С, 2300 g, вщбирали супернатант (сироватка, що мicтить тромбш) та заморожували при температурi - 80° С до використання. Кров з антикоагулянтом центрифугували в два етапи: 1) 10 хв при температурi 4° С 800 g (седименташя еритроци^в та мононукле-арiв кровi, отримання плазми); 2) 20 хв при темпе-ратурi 4° С, 2300 g для седиментаци тромбоцитiв та отримання ЗТП. ЗТП двiчi заморожували-вiдтаювали, центрифугували 20 хв при температурi 4° С, 2300 g. Супернатант (крiолiзат ЗТП) вщбирали та зберiгали при температурi - 80° С до використання. Для фор-мування фiбринового гелю ^тини ресуспендували у 900 мкл крiолiзату ЗТП, додавали 100 мкл сироватки з активованим тромбшом (cумiш 750 мкл сироватки з тромбшом з 250 мкл 10 % розчину СаС12) та запов-нювали цим розчином порожнину закритого з одного боку колагенового провщника, закривали другий ю-нець провщника та шкубували 20 хв у мультигазовому iнкубаторi при температурi 37° С до полiмеризацiT фiбринового гелю. Заciяний кл^инами провiдник вмiщували у живильне середовище та культивували протягом 24 год до використання.
Хiрургiчнi втручання (рис. 1) виконували тд загальним знеболенням (внутршньоочеревинне вве-дення cумiшi розчишв ксилазину - Sedazin, Biowet, Польща, 15 мг/кг та кетамiну - Calipsol, Gedeon Richter, Угорщина, 70 мг/кг маси тта). Тварину фк-сували на операцiйному столику черевцем донизу у середньому фiзiологiчному положены. Дотримуючись правил асептики та антисептики, тсля оброблення операцшного поля, виконували лшшний розрiз шкiри по латеральнш поверхнi стегна у проекцiT СН злiва. За допомогою iнcтументiв (затискач типу "мосют", пiнцет хiрургiчний) тупо видтяли та мобiлiзували лiвий СН. На вщсташ (20±1,5) мм вщ точки виходу СН з порожнини малого таза за допомогою леза виакали фрагмент довжиною (10±2) мм. У тварин групи 1 виачений фрагмент повертали на 180° i ф^сували до кукс нерва кшець в кiнець шляхом епiневральноT нейрорафи атравматичною голкою з монофтамент-ною полiамiдною ниткою № 10/0 (ТОВ "ДЕВЦ "Олiмп", Укратна) з використанням операцшного мкроскопа (збiльшенняx12). У тварин групи 2 здшснювали пластику зони дiаcтазу СН з використанням провщ-ника (NeuraGen®, Integra LifeSciences, USA) шляхом епшевральнот фiкcацiT. У тварин групи 3 дiаcтаз мiж куксами СН усували аналопчним чином, проте, колагеновий провщник попередньо заciвали МСК-ПНГ у кшькост 1х10б кл^ин. У тварин групи 4 тсля мобЫзаци СН невротомiю не виконували.
Пюля ретельного гемостазу у тварин уах груп опе-рaцiйну рану закривали одним рядом вузлових и^в з використанням атравматичнот голки з монофтамент-ною полiaмiдною ниткою № 4/0 (ТОВ "ДЕВЦ "Олiмп", Укратна). Для профшактики iнфекцiйних ускладнень застосовували бщилш-5 (ОАО «Киевмедпрепарат»), пiдшкiрно вводили суспенз^ у задню шийну дтянку,
Рис. 1. А - видтення СН; Б - формування дефекту СН; В - аутонейропластика; Г - провщники, тдготовлеш до iмплантацií; Д - пластика зони дiастазу СН з використанням провщника.
1 млн. ОД на 1 кг маси тта. Як протизапальну та про-тинабрякову тератю внутршньоочеревинно вводили розчин дексаметазону (KRKA, Словешя, 6 мг/кг маси тта). Тварини протягом 2-4 год утримували в при-мщенш з тдвищеною температурою пов^ря (30° C), у подальшому — у звичних умовах вiварiю.
ЕНМГ проводили тваринам уах груп через 4 i 8 тиж пiсля моделювання травми. П^ля глибокоТ анестезií тварину укладали черевцем донизу, вздовж хвоста ф^сували електрод заземлення (металiзо-вана стрiчка, змочена iзотонiчним розчином натрiю хлориду, шириною 20 мм, довжиною 100 мм), лiвий та правий СН моб^зували у дiлянцi верхньоТ трети-ни стегна, охоплювали платиновим гачкоподiбним бiполярним електродом (дiаметр одного електрода 0,22 мм, вщстань мiж електродами 5,5 мм), уникаючи контакту з навколишшми тканинами. Стимулюючий струм генерували на цифровому електронейро-мiографi «Нейро-МВП-МНкро» (ТОВ «НЕЙРОСОФТ», Рос/я), подавали в iмпульсному режимi (тривалiсть iмпульсу 5 мс) з частотою 0,2 Гц (1 iмпульс на 5 с) та кроком збтьшення сили струму 1 мА. 1нтенсившсть стимуляцií тдбирали iндивiдуально, виходячи з того рiвня, за якого досягали Амв (потеншал дií - ПД м'яза), вона становила у середньому (2,5±5) мА, (3,0±5) мВ. Збудження реестрували на електронейромiографi за допомогою концентричного голкового електрода (довжина 25 мм, дiаметр 0,3 мм, площа вiдведення 0,015 мм2) у руховш точцi литкового м'яза. Вщстань мiж стимулюючими та рееструючим електродами 30 мм. П^ля дослiдження тварину у станi наркотичного сну виводили з експерименту методом дислокаци шиТ шляхом тракцiТ за ростральний юнець.
Аналiзували такi показники ЕНМГ: ампл^уду М-вiдповiдi (ампл^уда ПД м'яза - АМВ), латентний перюд М-вiдповiдi (латенцiя ПД м'яза - ЛПМВ); у подальшому аналiзували iндивiдуальнi значення, отриманi за максимально!' реестрованоТ величини АМВ (у бтьшосп спос-тережень — при силi стимулюючого струму 3 мА).
Статистична обробка цифрових даних здшснена за допомогою програмного пакета Statistica 10.0 на персональному комп'ютерк Усереднеш величини представляли у виглядi (М±т), де М — середне значення величини, m — стандартна похибка середнього значення. Статистичну значущють рiзницi даних правоí та лiвоí задшх кiнцiвок у межах кожноí групи оцшювали за Уíлкоксоном (Wilcoxon Matched Pairs Test), гомолатеральних юншвок у межах кожноТ групи у рiзнi строки спостереження, а також мiж рiзними групами в однаковi строки спостереження — за U-тестом Мана-Утш (Mann-Whitney U-test). Припущення щодо статистичноí значущостi отриманого результату вважали вiрним, якщо ймовiрнiсть нульовоí ппотези була менше (р<0,05).
Результати та ix обговорення. Наприкiнцi 4-го тижня спостереження у груш 1 з уах показниюв ЕНМГ лише Амв ЗПК була статистично значущою (р = 0,018; U-тест Мана-Уíтнi) менша, шж З1К
- вiдповiдно (3,3±0,5) та (16,5±2,3) мВ. У групах 2 i 3 вiдзначали статистично значуще (р = 0,018, U-тест Мана-Уíтнi) збiльшення Амв в З1К: в групi 2
— (16,5±2,3) i (0,9±0,2) мВ; в груш 3 — (14,7±2,2) та (2,3±0,2) мВ р=0,018, U-тест Мана-Утш). Наприкiнцi 8-го тижня в групах 1 i 2 динамка показникiв ЕНМГ в З1К та ЗПК аналопчна такiй у попередш строки спостереження (див. таблицю).
Отже, колагеновий провщник, iмплантований без кл^инного компоненту, не мав стимулюючого впливу на р^т нервових волокон особливо тих, що забезпе-чують високу швидюсть проведення iмпульсу. Такi результати, ймовiрно, свiдчать про компенсаторне уповтьнення рухiв З1К вiдповiдно до упов^нено: руховоí активностi ЗПК, щоб не порушувати руховий патерн. Пiсля аутонейропластики цього не спос-терiгали, осктьки немае вираженого уповiльнення швидкостi проведення збудження по нерву.
В дослщжуваних групах наприюнц 4-го тижня статистично значущих вiдмiнностей показникiв ЕНМГ
Результати ЕНМГ-дослщження у тварин експериментальних груп. Даш щодо статистичноТ значущосп вiдмiнностей представлен у текстi.
Групи тварин Кшщвка Величина показника у строки спостереження, тиж (М±т)
4 8
А, мВ t, мс А, мВ t, мс
1 ЗПК 3,3±0,5 1,3±0,2 4,1±0,7 1,1±0,2
З1К 16,5±2,3 1,1±0,2 20,3±3,0 1,3±0,1
2 ЗПК 0,9±0,2 4,1±2,0 1,4±0,3 2,5±0,6
З1К 16,5±2,3 1,1±0,1 14,8±1,8 1,3±0,1
3 ЗПК 2,3±0,2 1,9±0,3 2,9±0,4 1,9±0,7
З1К 14,7±2,2 1,2±0,1 14,8±1,8 1,2±0,1
4 ЗПК 16,6±1,4 1,4±0,2 22,4±2,2 1,1±0,3
З1К 15,7±2,4 1,2±0,1 17,0±1,9 1,2±0,1
в З1К не були (рис. 2). Амв у груш 2 - (0,9±0,20 мВ ста-тистично значущо менша, шж в групi 1 - (3,3±0,50 мВ (р=0,006); в групi 3 - (2,3±0,20 мВ (р=0,002); в груш 4
- (16,6±1,4) мВ (р=0,006 Амв у групах 1 i 3 статистично значущо менша, шж в групi 4 (р=0,004).
Через 8 тиж (рис. 3) спостереження вщзначено статистично значуще збтьшення Амв ЗПК у тварин групи 1 до (4,1±0,7) мВ лише порiвняно з таким в груш 2 (1,4±0,3) мВ (р=0,007). Амв ЗПК в групах 1, 2 i 3 статистично значущо поступала такш в групi 4
- (22,4±2,2) мВ (р = 0,006, р = 0,004, р = 0,004 вщповщ-но). Рiзницi показника в З1К не було.
Статистично значущi вiдмiнностi мiж показниками в З1К не виявленi.
Пiсля аутонейропластики, попри низьк показники реiннервацiТ м'яза, спектр регенеруючих волокон, що забезпечували решнервацю ймовiрно, не вiдрiзнявся вiд таких у контралатеральному нервi тieТ самоТ твари-ни, проте, вiдрiзнявся вщ спектру у псевдооперованих тварин наявшстю волокон бiльшого дiаметра. Пiсля iмплантацiТ колагенового провiдника у поeднаннi з МСК-ПНГ наприкiнцi 1-го мiсяця спектр волокон суттево вiдрiзнявся вiд такого у контралатеральному нерв^ проте, не вiдрiзнявся вiд спектру волокон не-
Рис. 2. Амплiтуда Аив, ЛПМВ З1К та ЗПК через 4 тиж у тварин експериментальних груп порiвняно з такими в контрольнш груш (пояснення у тексп).
Рис. 3. Амв, ЛПмв З1К та ЗПК через 8 тиж у тварин експериментальних груп порiвняно з такими в контрольнш груш (пояснення у тексп).
рва у псевдооперованих тварин. На 2-му м^яц тсля iмплантацN колагенового матриксу, асоцшованого з МСК-ПНГ, вiдзначали результативну решнерва^ю м'яза волокнами великого дiаметра, через 8 тиж швид-кiсть проведення збудження не вiдрiзнялася вiд такоТ в iнтактнiй кiнцiвцi. Отже, тсля аутонейропластики протягом 1-го мiсяця виявляли переважно проростан-ня волокон великого дiаметра, чого не спостерiгали при iмплантацiТ колагенового провiдника, та вщзна-чали меншою мiрою - при iмплантацiТ колагенового провiдника, асоцiйованого з МСК-ПНГ. Протягом 2-го м^яця тсля аутонейропластики ре шнерваци здшс-нювалася переважно волокнами меншого дiаметра, при iмплантацiТ колагенового провiдника, асоцшова-ного з МСК-ПНГ - волокнами бтьшого дiаметра.
Результат реiннервацiТ пiсля аутонейропластики та iмплантацiТ колагенового провiдника у поеднанш з МСК-ПНГ за показниками ЕНМГ у цтому зiставний, вщзначено статистично незначущу рiзницю елект-рофнзюлопчного спектру волокон, що реiннервували паретичний м'яз.
Висновки. 1. МСК-ПНГ справляють позитивний вплив на регенерашю ПН внаслщок стимуляцiТ про-ростання бшьшоТ кiлькостi нервових волокон, нiж при iмплантацiТ колагенового матрикса без МСК-ПНГ, про що опосередковано свщчить показники ЕНМГ.
2. ТканинноЧнженерний пiдхiд у пластиц дефекту ПН з використанням колагенових матрикав та МСК-ПНГ забезпечуе результат, вщповщний "золотому стандарту" - аутонейропластицк
3. Доцiльна розробка подальших шляхiв удоско-налення тканинно-шженерного пiдходу до вщнов-лення ПН, оскшьки аутонейропластику удосконалити неможливо.
References
1. Torres RY, Miranda GE. Epidemiology of Traumatic Peripheral
Nerve Injuries Evaluated by Electrodiagnostic Studies in a Tertiary Care Hospital Clinic. Bol Asoc Med P R. 2015 Jul-Sep;107(3):79-84. PubMed PMID: 26742202.
2. Puzovic V, Samardzic M, Jovanovic M, Zivkovic B, Savic A, Rasulic L. Etiology and mechanisms of ulnar and median forearm nerve injuries. Vojnosanitetski pregled. 2015 Nov; 72(11):961-7. doi:10.2298/VSP140818106P. PubMed PMID: 26731969.
3. Tsymbalyuk VI, Chebotaryova LL, Dubyna GI. Electrophysiological diagnostics of the closed injury brachial plexus in a combination with craniocereberal trauma. Ukrainian Neurosurgical Journal. 2004;(4):65-8. Ukrainian.
4. Zozulya YuA, Tretyak IB, Tsymbalyuk YuV, Sapon NA. [Restorative surgery with invasive nerve stimulation in brachial plexus injuries]. Ukrainian Neurosurgical Journal. 2013;(2):19-22. Ukrainian. Available from: http://theunj. org/article/view/51852.
5. Rasulic L, Puzovic V, Rotim K, Jovanovic M, Samardzic M, Zivkovic B, Savic A. The epidemiology of forearm nerve injuries - a retrospective study. Acta clinica Croatica. 2015 Mar; 54(1):19-24. PubMed PMID: 26058238.
6. Brooks DN, Weber RV, Chao JD, Rinker BD, Zoldos J, Robichaux MR, Ruggeri SB, Anderson KA, Bonatz EE, Wisotsky SM, Cho MS, Wilson C, Cooper EO, Ingari JV, Safa B, Parrett BM, Buncke GM. Processed nerve allografts for peripheral nerve reconstruction: a multicenter study of utilization and outcomes in sensory, mixed, and motor nerve reconstructions. Microsurgery. 2012 Jan;32(1):1-14. doi: 10.1002/micr.20975. Epub 2011 Nov 28. PubMed PMID: 22121093.
7. Battiston B, Titolo P, Ciclamini D, Panero B. Peripheral Nerve
Defects: Overviews of Practice in Europe. Hand Clin. 2017 Aug;33(3):545-550. doi: 10.1016/j.hcl.2017.04.005. Review. PubMed PMID: 28673630.
8. Pabari A, Yang SY, Seifalian AM, Mosahebi A. Modern surgical management of peripheral nerve gap. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 2010 Dec; 63(12): 1941-8. doi:10.1016/j.bjps.2009.12.010. Epub 2010 Jan 12. Review. PubMed PMID: 20061198.
9. Korus L, Ross DC, Doherty CD, Miller TA. Nerve transfers and neurotization in peripheral nerve injury, from surgery to rehabilitation. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 2016 Feb; 87(2): 188-197. doi: 10.1136/jnnp-2015-310420. Epub 2015 Jul. Review. PubMed PMID: 26134850.
10. Safa B, Buncke G. Autograft Substitutes: Conduits and Processed Nerve Allografts. Hand Clinics. 2016 May; 32(2):127-40. doi: 10.1016/j.hcl.2015.12.012. doi: 10.1016/ j.hcl.2015.12.012. Review. PubMed PMID: 27094886.
11. Riedl O, Frey M. Anatomy of the sural nerve: cadaver study and literature review. Plastic and Reconstructive Surgery. 2013 Apr; 131(4): 802-10. doi: 10.1097/PRS.0b013e3182818cd4. Review. PubMed PMID: 23542252.
12. Sullivan R, Dailey T, Duncan K, Abel N, Borlongan CV. Peripheral nerve injury: Stem cell therapy and peripheral nerve transfer. International Journal of Molecular Sciences. 2016 Dec 14;17(12). pii: E2101. Review. PubMed PMID: 27983642; PubMed Central PMCID: PMC5187901.
13. Morrison SJ, White PM, Zock C, Anderson DJ. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 1999 Mar 5; 96(5): 737-49. PubMed PMID: 10089888.
14. Dupin E, Sommer L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 2012 Jun 1; 366(1): 83-95. doi: 10.1016/j.ydbio.2012.02.035. Epub 2012 Mar 8. Review. PubMed PMID: 22425619.
15. Barlow LA. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 2015 Nov 1;142(21):3620-9. doi: 10.1242/dev.120394. Review. PubMed PMID: 26534983; PubMed Central PMCID: PMC4647210.
16. Suzuki J, Osumi N. Neural crest and placode contributions to olfactory development. Current Topics in Developmental Biology. 2015; 111: 351-74. doi: 10.1016/bs.ctdb.2014.11.010. Epub 2015 Jan 20. Review. PubMed PMID: 25662265.
17. Whitfield TT. Development of the inner ear. Current Opinion in Genetic Development. 2015 Jun; 32: 112-8. doi: 10.1016/ j.gde.2015.02.006.
18. Lindsay SL, Barnett SC. Are nestin-positive mesenchymal stromal cells a better source of cells for CNS repair? Neurochemistry International. 2017 Jun;106: 101-107. doi: 10.1016/j.neuint.2016.08.001. Epub 2016 Aug 3. PubMed PMID: 27498150; PubMed Central PMCID: PMC5455984.
19. Neirinckx V, Cantinieaux D, Coste C, Rogister B, Franzen R, Wislet-Gendebien S. Concise review: Spinal cord injuries: how could adult mesenchymal and neural crest stem cells take up the challenge? Stem Cells. 2014 Apr;32(4):829-43. doi: 10.1002/stem.1579. Review. PubMed PMID: 24155224.
20. Vasyliev RG, Rodnichenko AE, Shamalo SN, Demidchouk AS, Labunets IF, Chaikovskii YB, Butenko GM. Effects of neural crest-derived multipotent stem cells on regeneration of an injured peripheral nerve in mice. Neurophysiology. 2015;47(1):80-83. doi: 10.1007/s11062-015-9501-6.
21. Amoh Y, Aki R, Hamada Y, Niiyama S, Eshima K, Kawahara K, Sato Y, Tani Y, Hoffman RM, Katsuoka K. Nestin-positive hair follicle pluripotent stem cells can promote regeneration of impinged peripheral nerve injury. J Dermatol. 2012 Jan;39(1):33-8. doi: 10.1111/j.1346-8138.2011.01413.x. Epub 2011 Nov 21. PubMed PMID: 22098554.
22. Sieber-Blum M, Grim M, Hu Y, Szeder V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle. Developmental Dynamics. 2004 Oct; 231(2):258-69. doi: 10.1002/ dvdy.20129. PubMed PMID: 15366003.
23. Najafzadeh N, Esmaeilzade B, Dastan Imcheh M. Hair follicle stem cells: In vitro and in vivo neural differentiation. World Journal of Stem Cells. 2015 Jun 26; 7(5) :866-72. doi: 10.4252/wjsc.v7.i5.866. Review. PubMed PMID: 26131317; PubMed Central PMCID: PMC4478633.
24. Fairbairn NG, Meppelink AM, Ng-Glazier J, Randolph MA, Winograd JM. Augmenting peripheral nerve regeneration using stem cells: A review of current opinion. World J Stem Cells. 2015 Jan 26;7(1):11-26. doi: 10.4252/wjsc.v7.i1.11. Review. PubMed PMID: 25621102; PubMed Central PMCID: PMC4300921.
