CC BY
24
BicHm Дшпропетровського унiверситету. Бюлопя, еколопя. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seriâ Biologiâ, ekologiâ Visnyk of Dnepropetrovsk University. Biology, ecology.
Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2016. 24(1), 143-150.
ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online
doi:10.15421/011617
www.ecology.dp.ua
УДК 577.152+577.345
Вплив reMi4HOÏ rinoKciï на динамiку концентрацiй ГФКБ у структурах мозку та сирoватцi кров1 щурiв
Дослiджено ефекти дИ гемчно! гтокси на розподл фшаментно! та розчинно! форм ГФКБ у рiзних вщдшах та структурах головного мозку щурш (кора головного мозку, мозочок, гшокамп, смугасте тiло, середнш мозок, варолпв мiст) i сироватц кровi щурш. На основi кшьюсного аналiзу вмiсту ГФКБ у структурах головного мозку гшоксичних щурш установлено, що гемiчна гшоксш викликае змши внутрiшньоклiтинного вмюту двох форм бшка, а також модифжащю !х сшввщношення. Це дозволяе припустити не тшьки виникнення змш кiлькостi асгроглiальних клпин, а й перебудову системи протжних фшаментш астроцигiв. Рiвень ГФКБ ютотно змiнювався в усiх мозкових утворах, що дослiджуються вже в рант термши постгiпоксичного перiоду. Спостере-ження показали, що гемiчна гшоксш неоднаково впливае на експресiю нейроспецифiчного бшка в рiзних структурах головного мозку щурш. Вщмшносп в експреси ГФКБ можуть бути викликат регюнальними вщмшностями астроцитарно! клпинно! попу-ляци, а також !х внутрштми особливостями, яю визначають в1рог1дн1 вiдповiдi на гшоксичне пошкодження в р1зних функцюна-льно та морфолопчно структурах мозку. Шдвищення експреси дослiджуваних форм бiлка можна пояснити посиленням астрогл1а-льно! реактивносп - особливгстю мозку, що виявляеться за р1зноман1тних видв патологiй ЦНС. Реактивт астроцити в таких випадках зазнають гшертрофи та характеризуються тдвищеним рiвнем ГФКБ, що е раншм та в1рог1дним iндикатором астроглю-зу. Вмст ГФКБ у сироватц кров1 статевозрiлих щурш, яю зазнали гшоксичного впливу, може свщчити про виид 1з пошкоджених астроцитш у кров'яне русло.
Ключоа слова: астроцигарт иром:жш фшаменти; iмуноферменгний анал1з; сироватка кров1
This article clarifies the questions on study of hypoxic influence on distribution of filament and soluble forms of GFAP in various structures of the brain (neocortex, cerebellum, hippocampus, striatum, middle brain, pons) and blood of the rats. Quantitative analysis of the contents of GFAP in the brain structures of hypoxic rats has established that hemic hypoxia results in changes in intracellular levels of GFAP forms and also in updating their ratio, which allows one to assume not only a change in astroglial cells, but also testifies to reorganization in the system of intermediate filaments of astrocytes. The level of GFAP substantially changed in all cerebral formations, which was already investigated in the early terms of hypoxic period. Observations showed that hemic hypoxia exerted a varied influence on expression of neurospecific protein in the different structures of cerebrum of rats. Differences in expression of GFAP can be caused by the regional differences in astroglial cellular population, and also their internal features that define the possible answers to hypoxic damage in different functional and morphological structures of the brain. An increase in expression of the investigated form of protein can explain strengthening
Утверситет Джорджа Вашингтона, 21106 St. NW, Вашингтон, DC 20052, США The George Washington University, 21106 St. NW, Washington, DC 20052, USA E-mail: tatyanaduka@gmail.com
Днтропетровський державний аграрно-економiчний утверситет, вул. Ворошилова, 25, Днтропетровськ, 49600, Украта DnipropetrovskState Agrarian-Economy University, Voroshilov Str., 25, Dnipropetrovsk, 49600, Ukraine Tel.: +38-056-374-24-41. E-mail: v-ch-49a@mail.ru
Effect of hemic hypoxia on dynamics of GFAP concentrations in the structures of the brain and blood serum of rats
2
T.I. Duka1, V.I. Chorna2
'The George Washington University, Washington, USA 'Dnipropetrovsk State Agrarian-Economy University, Dnipropetrovsk, Ukraine
of astroglial reactivity, a feature of the brain that appears in various types of pathologies of the CNS. Reactive asters in such exhibit hypertrophy and are characterized by an increased level of GFAP, which is an early and reliable indicator of astroglial pathology. An increase in expression of the investigated form of protein may be explained by strengthening of astroglial reactivity, a feature of the brain that appears in various types of pathologies of the CNS. The contents of GFAP in the blood of adult rats, as a result of the hypoxic influence received from it, can indicate a release of GFAP from damaged astrocytes in the blood flow.
Keywords: astroglial intermediate filaments; ELISA; blood Вступ
Гшоксш як неспецифДчний процес супроводжуе патолопчт стани головного мозку та може вносити знач-ний вклад у ïx розвиток. Радацшна поразка головного мозку також викликае гшоксичт ефекти, порушуе крово-постачання мозку (Moskalev, 1991). Результата експери-менпв iз вивчення впливу ютзуючого випромшювання (дя ренIгенiвськиx кванпв на гемопротеши та модельнi порфiрини) свДдчать про те, що активн радикали, як1 утворюються за да iонiзацiï, впливають на високоспряже-не порфiринове кiльце, електронну структуру атома залДза гему, бiлкову глобулу (Erastov et al., 1991).
Гемiчна ппокая розвиваеться, як вДдомо, в результат! порушення процесу перенесення О2 кров'ю внаслДдок зменшення в нДй вмсту гемоглобшу або зниження його спроможностД служити переносником О2. Характерна особливДсть гемiчноï' гiпоксiï - зменшення кисневоï' емностД кровi. Найменше вивчений тип гемчно1 гiпоксiï, за якого частина гемоглобшу (Hb) перетворюеться на метгемо-глобДн (MetHb). Основна причина розвитку гiпоксiï за метгемоглобiнемiï - зменшення юлькосп активного Hb, що бере участь у процесД перенесення О2 вДд легень до тканин. Дану форму ппокси не можна вважати «чистою», оскiльки метгемоглобшутворювач не тшьки впливае на зниження киснево1 емностД кровi (що е основною ознакою гемiчноï ппокси), а також може виявляти дiю, що пригнiчуе бюлопчне окиснення, гальмуе синтез дихальних фермен-тв, викликае змДни дихального ланцюга, у прoцесаx окиснення та фосфорилування (Gerginova et al., 1979).
Дя гемчно1 гiпоксiï, передусДм, проявляеться на станi ЦНС, серцево-судинно1 та дихально1 систем, а також на багатьох бiоxiмiчниx процесах в органДзмД, що уражають ферментнi системи, якД захищають гемоглобДн вДд окиснення або каталзують вДдновлення метгемоглобДну. РеакцДя органiзму на гшоксш, що при цьому розви-ваеться, забезпечуеться також адренергДчною та гшофД-зарно-адреналовою системами, якД реал1зують, неспеци-фiчну вДдповДдь на цей вплив. За ппокси в органiзмi розвиваеться досить типова картина стадiï «тривоги» -загального адаптацiйного синдрому, в результат чого мо-бiлiзуються рiзноманiтнi меxанiзми захисту, мета яких -посилення неспецифiчноï резистентносп кл1тин, тканин, органiзму в цДлому до несприятливого впливу на них.
З усДх тканин органДзму найчутливiшi до киснево1 недостатностД - тканини головного мозку. Пошкодження енергетичного метабол1зму, надлишкове виДльнення амД-нокислот, послДдовна активащя NMDA i К/Q рецепторДв на клiтиннiй мембранi, колапс мембранного iонного насоса, збДльшення обм1ну мембран фосфолшщв - це непов-ний перел1к реакцш, що входять до складу метабол1чного каскаду, який iндукуеIься гiпоксiею мозку (Shimada, 1994). За дИ' гемчно1 ппокси вДдзначають високий рiвень пероксидацiï лшвдв, причому з усix видiв гшоксш за гемчно! форми цi процеси вДдбуваються найштенсивт-
ше, 1х пов'язують iз пом1тною акумуляцiею катехоламД-нДв, дефщитом антиоксидантно1 системи, зниженням ци-тохром С активносп. Гемiчна гшокая викликае нейро-логДчний дефщит i розлади мнестичних функцш. Астро-цити вДдцрають ключову роль у нормальному функцю-нуваннi мозку, необхДдт для активних нейрон-гл1альних взаемодiй у тдтримант гомеостазу (Miller et al., 2012). Цд функцiï стають пом1тними за умов вДдповвд ЦНС на пошкодження, у тому числД на гшоксичне (Bakhot et al., 1991). Високий рiвень глутамДн синтетази виявлений в астроци-тах, iï ферментативна активнiсть пов'язана зД специфДч-ним глутаматним транспортером, працюючи у комплексД як частина глутамат/глутамДн циклу, вони вилучають i про-водять детоксикащю надлишкового глутамату, забезпечу-ють нейрональнД клДтини глутамДном (Sonnewald et al., 1997). Астроцити зберДгають глДкоген i потенцшно можуть забезпечувати лактатом у результат альтернативного енергетичного субстрату для нейронДв у перДод вДдновлення для шдтримання осмотичного оточення (Schurr et al., 1997). АстроглДя продукуе рДзномаштш цитокДни та фактори росту, що функцюнують як медДатори Дмунно1 та запально1 вДдповДдей, можуть су-проводжувати як нейротоксичний, так i нейропротек-торний ефект. Високий рДвень глутатюну, важливого антиоксиданта в ЦНС, виявлений в астроцитах, але не в нейронах. Таким чином, цД астроцитарнД можливостД та властивостД можуть сприяти функцюнуванню нейронДв або, навпаки, загострювати нейрональну дисфункцДю.
Активащя астроцитДв характеризуется гшерплазДею та гшертрофДею клДтин Дз посиленою ГФКБ Дмунореак-тивнДстю, що показано для церебральной шеми мозку щурДв (Kindy et al., 1996). Однак ДншД дат показують ранне падДння ГФКБ реактивностД в областях важкого Дшемчного Днсульту. Хоча вщмшносп серед Дшемчних моделей, що використовували у багатьох дослДдженнях, сприяють розбДжностям i надто суперечливД у виявлених астроцитарних вДдповДдях.
Посилення експреси ГФКБ в областях, якД приляга-ють до областД Днфаркту, первДсно розглядалося винят-ково як частина формування глДального рубця, що стримуе та Дзолюе шфарктш тканини вДд непошкодже-них тканин мозку та природно ДнгДбуе нейритний рДст. Ця точка зору була модифДкована у зв'язку зД сприятли-вими нейропротекторними та детоксикувальними вла-стивостями реактивних астроцитДв (Houle, 1992). Проте деякД дослДдники вивчали астроцитарнД модифшацл у перДод ранньо1 вДдповДдД (години) ДшемДчного Днфаркту та взаемозв'язок Дз нейрональною смертю. Yamashita et al. (1996) продемонстрували, що швидка втрата ГФКБ мРНК у центральних ДшемДчних дДлянках прямо вДдповДдае втратД АТР. Таким чином автори дослДджень припускають, що зниження експресД1 ГФКБ може бути результатом астроцитарно" дисфункцД1. Результата за-стосування моделД реперфузД1 гшоксп у мозку щурДв i дослДдження Martin et al. (1997), проведет з використан-
ням rin0Kci-imeMi4H0i моделi на неонатальних поросятах, показують, що первiсно вщбуваегься зниження ГФКБ iмунозабарвлення всерединi обласп iнфаркту пiсля 10-12 годин вщновлення.
Проте точний тимчасовий iнтервал зниження ГФКБ мунореактивносп не вказаний. Пониження ГФКБ iмунореакгивностi зумовлене реорrанiзацieю ПФ, що вщбуваегься паралельно зниженню мРНК ГФКБ (Duka et al., 2002). Точн механзми мiж деполiмеризацieю ГФКБ i наступною втратою iмунореакгивностi, астроцитарною дисфункц1ею та остаточною смертю астроцитарних клггин ще не вiдомi. Одна iз швидких постiшемiчних подiй - набряк клггин, названий цитотоксичною едемою (Hariri, 1994), що вщбуваегься у перш1 декiлька годин псля шсульту та залежить вiд тяжкосп шсульту. Астроцитарний набряк - осмотичний наслiдок споживання глутамату, лак-тату, цдрогену та iонiв калiю, вившьнених 1з некротичних клггин - це причина деполмеризаци ПФ i втрати ГФКБ iмунореактивносгi. Це доведено iз використанням ангигiл до епiтопiв зiбраних фiламентiв. Petito and Halaby (1993) пропонували подiбне пояснення для зниження знов синте-зованого ГФКБ в активованих астроцитах.
Роль астроцигiв, що сприяють нейрональному вижи-ванню та вщновленню пiсля мозкового iнсульту, позитивна, оскльки вони захищають нейрони вiд апоптично! / некротично! загибелi в iнфарктних дiлянках мозку (Duka et al., 2009). Роль нейрогли у процеа набряку цiкавить багатьох дослвдниюв. Йдеться, в першу чергу, про вiдростки астроцитiв, що беруть участь у формуванн ГЕБ. За гшоксичного набряку мозку збшьшуегься обсяг ядер тальних клiтин, збшьшуегься кшьюсть перива-скулярних rлiоцитiв, кiлькiсть перинейрональних глю-цитiв, навпаки, зменшуегься. Прийнято вважати, що, порiвняно з нейронами, астроцити менш чутливi до гшо-кси. Проте iснують також iншi данi. За циркуляторно! гшоксп модифшацп нейрональних клiтин мають вогни-щевий характер, а найлабiльнiшi астроцити набрякають уже на третiй хвилинi (Dong et al., 1999). Розглядаючи патолоrо-анатомiчну картину iнфаркту головного мозку, зважають на те, що rлiальнi клггини в осередку гинуть ранiше, нж нейрони.
Увагу дослiдникiв привертають особливосп та реакци елементiв астрогли на рiзноманiтнi види кисневого голо-дування. З'ясувалося, що зупинка серця спричинюе гшер-плазiю астрогли у мозку загиблих (Sharma et al., 1992). Да-ючи морфоriстохiмiчну характеристику шемчних шфар-кгiв мозку в гострш стада iнсульту у хворих атеросклерозом, вщмчали riпертрофiю астроцитiв навколо осередку, появу дренажних форм. У шдданих riпобаричнiй гшо-ксй шурiв в астроцитах помiчали збшьшення кiлькостi та розмiрiв мггохондрш, пдвищення вмiсгу гранул rлiкоrену.
Сигнали, що ведуть до стимуляци синтезу мРНК ГФКБ у пошкодженому мозку - характерна ознака ней-ронального пошкодження або збудження NMDA рецепторiв. Дослвдженнями (Steward et al., 1991; Sherwood et al., 2010) доведений зв'язок мж rлiальною генною експресieю та анормальною нейрональною активтстю. Гiпоксiя-iшемiя може також прямо пошкоджувати астроцити та сприяти астроцитарнш дисфункци або посилюва-ти активацш iшемiчноrо мозкового пошкодження. Нинi це питання залишаегься невирiшеним. Розумiння молеку-лярних сиrналiв, що регулюють експресш ГФКБ, удоско-
налюе нашi можливосп модифшувати астроцитарну ввд-повщь зршого мозку та мозку, що розвиваегься, на гшоксичне пошкодження.
Мета ще! статтi - з'ясувати вплив експериментально! rемiчноl гшокси на вмiст i перерозподiл фшаментно! та розчинно! форм тального фiбрилярноrо кислого бiлка в морфофункцюнальних структурах головного мозку та сироватщ кровi шурiв.
Матерiал i методи досл1джень
Об'ект дослщжень - головний мозок i сироватка кровi бiлих лабораторних щурiв i шурiв лшп Вiстар рiзноrо вiку. Пюля декаштацп з головного мозку кон-трольних i дослiдних щурiв видшяли такi струкгури: кору великих нашвкуль, гшокамп, смугасте тiло, мозо-чок, середнш мозок i варолив тст. 1з них отримували бiлковi фракцй для визначення концентраци ГФКБ. Уа операци в роботi з мозком виконували за 0 °С.
Для отримання очищеного препарату ГФКБ викори-стовували бiлу речовину мозку (аутопсiйний матерiал жертв нещасних випадкв). Кров вщстоювали одну годину за кмнатно! температури та центрифугували 20 хв за 3 000 об./хв. Сироватку кровi використовували для визначення вмюту ГФКБ.
Експериментальне моделювання reMi4HOi ппокси. Гемiчну riпоксiю моделювали, використовуючи нiтрит натрiю - класичний метrемоrлобiнутворювач. Нприт натрiю вводили iнтраперитонально у вигляд 2% NaNO2, приготовленого на фiзiолоriчному розчинi (Duka et al., 2000). Загальна кiлькiсть NaNO2 складала 900 мкг/кг ваги тварини. Контрольним щурам уводили фiзiолоriчний роз-чин в еквiвалентному об'емi. Сгушнь гшокси тестували за концентрацiею метгемоглобiну в кровi шурiв методом Евеллiна та Меллоя.
Методи видiлення та очищения ГФКБ. Для видшення та очищення ГФКБ використовували аутопсшний матерiал жертв нещасних випадюв через 812 годин тсля загибелг Перший етап очищення полягав у отриманн фракци збагачено! розчинною формою ГФКБ мозку шляхом диференцшного ценгрифугування (Drozdov et al., 2009). Отриману фракцiю, збагачену роз-чинною формою ГФКБ, використали для подальшого очищення ГФКБ. Наступний етап очищення ГФКБ включав адсорбцiйну хроматографiю, яку проводили з використанням пдроксилапатиту (Sigma, USA) та осад-ження 30% сульфатом амонш. Хроматографiю проводили на колонщ об'емом 10 мл. Збагачену фракцш наносили зi швидюстю V = 8 мл/год. на колонку, урiвноважену 0,05 М натрiй-фосфатним буфером (рН = 8,0). Пiсля цього колонку промивали 8-10 об'емами 0,05 М натрш-фосфатного буфера (рН = 8,0). Елюцш ГФКБ проводили 0,1 М калш-фосфатним буфером (рН = 8,0). Вихвд бiлкiв контролювали спекгрофотометрично за довжини хвилi 280 нм. Результата очищення розчинно! форми ГФКБ наведено в таблищ.
Методи щентифшаци молекулярних форм ГФКБ. Отриману антисироватку до ГФКБ перевiряли на сшцииф!ч-нсть за допомогою перехресного iмуноелекгрофорезу та iмуноблотингу п1сля елекгрофорезу в полiакриламiдному гелi (ПААГ) за присутносп додецилсульфату натрiю (ДСН).
Таблиця
Результата очищения розчинноТ форми ГФКБ
Фракця Об'ем фракци, мл Вмст за-гального бшка, мг/мл Вмст ГФКБ у фракщях, мг/мл
Гомогенат б1ло! речовини мозку людини 45 15,50 0,65
S1 п^сля першого центрифугування 40 5,17 0,64
S2 июля центрифугування шдкисленого S1 55 1,39 0,00
S3 20 1,89 0,39
Фракця ГФКБ иiсля хро-матографи на г1дроксил-апатит! та осадження 30% сульфатом амон1ю 2 0,48 0,41
Електрофорез у ПААГ за присутносп ДСН. Елек-трофорез у потакриламвдному гелi (ПААГ) за присутносп додецилсульфату натрш ДСН проводили за Леммлi на пластинi 180 х 160 х 1 мм. Склад диференцшвального гелю: 5% T i 2% С, або 20% Т i 2% С; 0,375 M трис-HCl буфер (pH = 8,8), 0,1% SDS; 0,025% персульфату амонш, 0,025% ТЕМЕД. У гель i3 високою конценIрацieю акрш-амиду вводили глщерин в остаточнш концентраци 5% для запобпгання нер1вномрного розбухання гелю щд час за-барвлення та знебарвлення. Використали диференцш-вальний гель iз лшшним граденгом акриламдду 5-17, 5% i зшивкою 2%. Градент створювали за допомогою змшувача. Пюля заливання обережно нашаровували воду. Полiмеризували гель не менше 60 хвилин. По завер-шеннi полшеризаци шар води обережно видаляли, про-мивали поверхню гелю буфером для концентрувального гелю та заливали його. Вщстань м1ж нижньою межею концентрувального гелю та дном «кишеш» для нанесення зразка склала не бшьше 15 мм. Склад концентрувального гелю: 3% Т, 2,6% C, 125 mM трис-НС1 (рН = 6,8), 0,1% ДСН, 0,025% ТЕМЕД, 0,025% персульфат амонш. Пюля закшчення полiмеризацil проби вносили в лунки (загальна концентращя бiлка на одну лунку не перевищувала 100 мкг). Зразки розчиняли у буферi такого складу: 62,5 mM трис-HCl буфер (рН = 6,8), 2,3% ДСН, 10% глщерин, 0,05% бромфенолового синього, 100 mM дитютрейтолу. Як електродний буфер використано роз-чин, що м1стить 0,025 М трис-HCl (pH = 8,3), 0,192 M глщин, 0,1% ДСН. Електрофорез поводили за 15 мА до проходження барвником гелю з метою зниження можли-во! конвекци гад час входження бшка в гель; пюля цього -за 25-30 мА до щдходу зони барвника до нижнього краю гелю. Пюля закшчення електрофорезу гель фiксували 12,5% ТХУ. Забарвлення проводили розчином Кумассi R-250 за загальноприйнятою методикою.
1муиоблотииг. 1муноблотинг (рiзновид iмунофер-ментного анал1зу) вперше запропонований Towbin, як метод, що дозволяе проводити реестрацш антигешв, подшених ДСН-електрофорезом у пол1акрилам1дному гел1 (ПААГ), за допомогою мчених антитiл. Пюля розподiлу бiлкiв електрофорезом у ПААГ за присутносп ДСН гел1 обережно помщали у прилад для блотингу з графiтовими електродами на заздалепдь змоченi буфером для перенесння на листи хроматографiчного паперу. Для електроперенесення використали буферний розчин такого складу: 0,025 М трис, 0,192 М глщин, 20% мета-
нол та 4М сечовина. Для полшшення перенесения висо-комолекулярних полiпептидiв до буфера вносили ДСН (до 0,1%). Перенесення здшснювали на нпроцелюлоз-ний папiр за умов струму 250 мА, напруги - 60 V, протя-гом 1,5 години.
Для визначення молекулярно! маси дшянку з мар-керними бшками п1сля розподiлу в ПААГ i перенесення на нiтроцелюлозну мембрану (НЦМ) забарвлювали 0,1% спиртовим розчином амщо-чорного. Пiсля зак1нчення електрофорезу нiтроцелюлозиу мембрану промивали чотири рази по 10 хв забуферним фiзiологiчним розчином (ЗФР) (pH = 7,2) для вилучення надлишку ДСН i метанолу. Вшьш мiсця зв'язування блокували 5% БСА (Sigma, USA) або 10% розчином сухого молока.
Виявлення антигешв на нироцелюлознш реплiцi проводили непрямим методом. Нпроцелюлозу упро-довж 12 годин за 4 °С шкубували з антисироваткою про-ти ГФКБ у розведенш 1 : 500. В шкубацшне середовище уводили твш-20 до 0,1% i 1% альбумш для ослаблення неспецифiчного зв'язування. Пюля ретельного проми-вання (6 разiв по 10 хв) НЦМ шкубували з антитшами проти iмуноглобулiнiв кролика, мiчених пероксидазою хрону (у розведенш 1 : 3000) за 37 °С упродовж 1,5 го-дини. Пюля промивання реплшу блота помщали у роз-чин субстрату: 5 мг 3,3^амшобензидину (ДАБ) (Sigma, USA) в 0,1 М трис-HCL (pH = 7,4, 20 мл) iз 70 мкл 3% перекису водню на 5-10 хвилин. Пiсля проявлення смуг реакцш зупиняли, ретельно промиваючи НЦМ водою. Для посилення пероксидазно! активностi в субстрат уводили юни кобальту. Це сприяло також змш кольорiв пофарбованих смуг iз коричневого на чорний або синiй.
Антисироватку до ГФКБ тестували методом 1муноблотингу.
Отримання фракци цитоскелетних бшк1в методом дифереицiальиого центрифугування. Мозок пiсля декапiтацil щурiв дiлили на кору великих твкуль, г^покамп, смугасте т1ло, мозочок, середн1й мозок, варолив мiст. Фракцil цитоскелетних бiлкiв отримували методом диференцiального центрифугування.
Методика непрямого неконкурентного шунофер-ментного аиалiзу (1ФА) для визначення ГФКБ у фра-к'ц1я\ мозку. 1муноферментне визначення форм ГФКБ у фракщях мозкових структур проводили у два етапи. Перший етап - iнгiбування антигеном антитш у рддкому середовищi. Другий - взаемодя сумiшi, що прореагувала на першому етап1, iз сорбованим на твердш фазi антигеном. Анти-ГФКБ 1муноглобул1ни, як1 зв'язалися, виявля-ються п1сля цього за допомогою вторинних противидових антит1л, кон'югованих пероксидазою хрону.
Планшети для iмуноаналiзу (Медполимер, Санкт-Петербург) сенсибшзували 18 годин за 4 °С фракцiею, збагаченою розчинною формою ГФКБ пiсля хрома-тографи на г1дроксилапатит1 в 0,05 М Na-карбонатному буферi (рН = 9,6). Пюля триразового промивання 0,01 М Na-фосфатним буфером з 0,15 М NaCl i 0,05% твiн-20 (рН = 7,4, ЗФР + Тв), вшьш центри зв'язування, що за-лишалися, блокували 1% розчином бичачого сироватко-вого альбумiиу (БСА) в ЗФР упродовж одше! години за 37 °С, а п1сля цього планшети тричi промивали ЗФР + ТВ. Уа реагенти у цих i наступних операц1ях вносили в об'емi 100 мкл у кожну лунку. Екстракти в1дд1л1в мозку, що досладжено, у концевому розведеннi шкубували про-
тягом години за 37 °С у npo6iprax i3 моноспецифiчною антисироваткою до ГФКБ. Псля цього сумш i3 npo6ipoK переносили в лунки сенсибшзованого планшета та iнкубували 18 годин за +4 °С. Псля триразового проми-вання планшета ЗФР + ТВ у лунки вносили вторинт ангипла, мiченi пероксидазою хрону (Sigma, США) у розведент 1 : 4 000 та шкубували 1,5 години за 37 °С.
Дослвджено екстракти антисироватки до ГФКБ i пероксидазнi кон'югати розводили забуференим фiзiологiчним розчином, що мiстигь 0,05% твш-20. Пiсля iнкубацiï планшети промивали ЗФР + ТВ i додавали в кожну лунку по 100 мкл 0,05% розчину ортофеншендамшу (Sigma, США) з 0,015% Н2О2 в 0,1 М цитратно-фосфатному буферi (рН = 5,0).
Реакцию зупиняли через 15 хв додаванням 50 мкл 40% сiрчаноï кислоти. Оптичну щшьтсть продукта реакцiï вимiрювали на мiкроридерi «Диагност» за дов-жини хвил 492 нм. Кал1брувальну криву будували, ви-користовуючи як стандарт збагачену розчинну форму ГФКБ (Берингер Манхейм, Шмеччина). Вмiст ГФКБ виражали в мкг/г тканини та мкг/мг загального бшка.
Умови проведення 1ФА для визначення ГФКБ у сироватцi кровь Планшети для 1ФА (Costar, USA) сенсибшзували очищеним ГФКБ у 0,05 М натрш-карбонатному буферi (рН = 9,6) у розведент 1/80 об'емом 100 мкл у кожну лунку упродовж 18 годин за +4 °С. Ввд бшка, який не зв'язався, звiльнювались триразовим про-миванням сольовим 0,1 М натрiй-фосфатним буфером (рН = 7,2), що мiстив 0,05% Твш-20 (промивний буфер). Незайняп активш центри зв'язування на планшет блоку-вали бичачим сироватковим альбумшом у 0,1 М натрш-фосфатному буферi (рН = 7,2) i знову тричi промивали.
Проби сироватки кровi в юнцевому розведеннi 1/16 шкубували упродовж години за 37 °С у пробiрках iз моноспецифiчною антисироваткою до ГФКБ у юнцевому розведент 1/2 000.
Сумш проби, що дослвджували, з антисироваткою до ГФКБ тсля попередт^' шкубацп вносили в лунки сен-сибiлiзованого антигеном планшета та шкубували упродовж 2 годин за 37 °С. Пюля триразового промивання планшета у лунки вносили по 100 мкл антитш до ii^TO-глобулiнiв кролика, кон'югованих iз пероксидазою хрону у розведент 1 : 500 та шкубували протягом години за 37 °С. Псля триразового промивання у лунки вносили по 100 мкл субстратноï сум^ для пероксидази: 0,05% орто-фенiлендiамiн з 0,015% Н2О2 у цитратно-фосфатному буферi (рН = 5,0). Через 15 хвилин реакцiю зупиняли додаванням 50 мкл 40% сiрчаноï кислоти. Оптичну щшьтсть вимрювали на мiкрорiдерi КАИ-Ц-01 за довжини хвил1 492 нм. Для побудови калбрувального графiка ви-користовували очищений нами ГФКБ, а також ГФКБ iз мозку бика (Берингер Манхейм, Шмеччина). Чутливiсть методу - 1 нг/мл.
Метод визначення вмсту метгемоглобiну в кров1 щурiв. Концентращю метгемоглобшу (MetHb) визначали методом Евеллша та Меллой. До 10 мл фiзiологiчного розчину додавали 0,2-0,3 мл кровi, взята на циIратi натрш, центрифугували за 3 000 об./хв упродовж 20 хв. До отриманого ввдстою додавали 6 мл дистильованоï води та залишали на 30-60 хв для гемолзу еритроципв. Псля цього до отриманого гемолзату додавали 4 мл
0,1 М фосфатного буфера (рН = 6,8) та центрифугували за 6 000-7 000 об./хв упродовж 20 хв.
Прозорий гемолiзат зливали та дшили на дв! р!вн порцп, в одну з яких вiдразу ж додавали 5 мг сухого R3|Fe(CN)6] i залишали на 10 хв. Кожну з порцш фото-метрували за довжини хвил 630 нм до i п1сля додавання до них розчину щащду. Як контрольний розчин викори-стано дистильовану воду та дистильовану воду, яка мiстила 5 мг сухого R3[Fe(CN)6]. У результатi одержува-ли величини Ei (оптична щшьтсть проби, що мктить MetHb у тш концентраций, в як1й вш був у кров1), Е2 (оптична щшьтсть проби, в якш весь наявний MetHb пе-рейшов у форму MetHbCN), Е3 (оптична щшьтсть проби, в який вмiстMetHb складае 100%) i Е4 (оптична щшьтсть проби, в якш весь MetHb перейшов у форму MetHbCN). Розрахунок вщносно! кшькосп MetHb проводили за формулою:
E1 ~ E2 100:MetHb%.
E 3 _ E 4
Визначення загального бшка у фракцях мозку проводили методом Лоур! (Lowry et al., 1951) i Бредфорд (Gotham et al., 1988). Як стандарт використали сироват-ковий альбумiн бика на ввдповщному буферi.
Статистичну обробку результата проводили за-стосуванням програми Statistica 8.0. Ввдмшносп м!ж виб!рками вважали в!ропдними за Р < 0,05.
Результати та Тх обговорення
Вплив гемiчноТ гтоксп на розподш фшаментноТ та розчинноТ форм ГФКБ у структурах головного мозку щурiв. 1з метою визначення впливу експериментально! гемчно! гшоксп на систему пром!жних фiламентiв астро-ципв проведено iмуноферментне дослвдження форм ГФКБ у структурах головного мозку гшоксичних щур!в. Викликана в результатi уведення штриту натрш гемiчна гшокая спричинювала тдвищення вмтсту у кров! мет-гемоглобiну. Його рiвень склав 25-28%, що свщчить про розвиток у щур!в гем!чно1 гшоксп середньо! тяжкосп.
Аналiзуючи дат про вмкт фшаментно! форми ГФКБ у результат! до гемчно! гшоксп в головному мозку до-рослих щур!в, слiд зазначити, що рiвень дослвджуваного бiлка юготно змiнювався в уах дослвджуваних мозкових утвореннях. Особливо чттко це виявилося на 12-ту добу (рис. 1). Привергае увагу те, що встановлен зрушення в цшому мають под1бний характер у р!зних структурах головного мозку. Законотрнсть змш експреси даного нейро-специф!чного бшка у динамщ постгшоксичного перюду виявляеться у в!ропдному та планомрному збiльшеннi концентраци ГФКБ, починаючи з перших еташв спосте-режень (через 24 години) при зютавлент з контролем. Привертае увагу той факт, що найвиразтш1 зрушення ви-явлен у тканин! кори головного мозку, в мозочку та серед-ньому мозку. У цитоскелетнш фракци фронтально! кори вмiст ГФКБ збшьшувався через 24 години з 10,6 ± 1,38 мкг/г тканини до 17,9 ± 0,71 (Д +69,3%), згодом на 12-ту добу -до 24,0 ± 1,18 (Д +128,8%). Змши концентраци дослвджу-ваного бшка в середньому мозку, мозочку та смугастому тш згодом на 6-ту добу були дещо бшьшими, нiж у кор! головного мозку. Прирюг вмiсту ГФКБ у цей перюд спо-стережень складав 31,9, 131,3 та 96,3% вщповщно.
% змши
250 -
200 "
150 -
100 -контроль
50 "
А
В
Д
*
п
Б
о
12
1 6 12
1 6
I
Г
Л
6 12
1 6 12
1 6 12
Ж
I
ппи
1 Ы 12
Доби
Рис. 1. Вплив гемiчноТ гшокси на змши фшаментноТ форми ГФКБ (% в1д контролю) в головному мозку щур1в:
А - кора головного мозку, Б - гшокамп, В - смугасте т1ло, Г - середнш мозок, Д - мозочок, Ж - варолив м1ст; * - в1рог1дна в1дмшшсть в1д контрольних значень (Р < 0,05)
Змши ршня глального ф1брилярного кислого бшка у смугастому тш та гшокамт мали шший характер. Особливютъ для смугастого тша полягала у зниженн концентраци ГФКБ через 24 години на 46,1% 1з наступ-ним його ютотним пщвищенням через 6 дб з 37,9 ± 1,24 до 74,4 ± 2,74 (Д +96,3%), через 12 дб з 43,1 ± 3,66 до 94,6 ± 6,60 (Д +119,1%). Особливють зрушень концентраци бшка, що дослдджусться, для гшокампа полягала у тому, що за умов пщвищення його вмюту через одну добу постгшоксичного перюду на 36,6%, у подальшому вщбувалося в1ропдне зниження концентраци ГФКБ 1 через 12 дб цей показник знизився на 40,2%.
Закономрнють змш конценграцii розчинно! форми ГФКБ мала дещо шший характер (рис. 2). Оцшюючи и, необхвдно пiдкреслиги, що в р1зних структурах головного мозку вона була неоднаковою. Подбний характер 1з фiламентною формою ГФКБ мали змши розчинно! форми бшка в гшокамт та мозочку гшоксичних шурш. У мозочку (рис. 2) через 24 години вмют розчинного ГФКБ достов1рно тдвишувався з 6,3 ± 0,46 до 12,4 ± 1,50 мкг/г тканини (Д +96,5%). На 6-ту добу постгшоксичного перюду параметр ютотно зростав пор1вняно з контроль-ними значеннями (прирют склав 391,1%). У шзт термши (через 12 дб) рiвень ГФКБ зростав 1з 10,0 ± 1,63 до 50,3 ± 2,76 (Д +400,2%). Аналопчт змши виявлет в ппокамп! гшоксичних шур1в, де прирют вмюту ГФКБ на 12-ту добу постгшоксичного перюду склав 240,6%. Змши вмюту розчинного ГФКБ у смугастому тш через 24 години були дещо чпташими, нж у вах шших дослщжених структурах мозку. Прирют вмсту ГФКБ склав 350,0% у цей перюд спостережень. Через 12 дб змши були менш ви-раженими пор1вняно з гшокампом 1 мозочком.
Особливють змши р1вня ГФКБ у розчиннш фракци тканини кори головного мозку гшоксичних щур1в - його ютотне збшьшення т1льки на 12-ту добу спостережень з 4,5 ± 0,39 мкг/г тканини до 28,5 ± 1,30 (Д +529,5%) (Р < 0,001). У варол1евому мосп р1вень розчинного ГФКБ мав тенденщю до зниження, на 12-ту добу постгшо-
ксичного перюду концентрата ГФКБ склала 7,7 ± 0,64 (Д -74,3%). Аналопчт змши спостер1гали в розчинн1й фракци, отриманш 1з тканини середнього мозку. Однак вони, пор1вняно з варол1евим мостом, були не наст1льки виражет. Зниження вмюту ГФКБ до 12-! доби постгшоксичного перюду досягало 15,8 ± 1,49 мкг/г тканини, що було в1ропдно нижче за контрольт показники (на 34,3%).
Вплив гем1чноТ гшокси на вм1ст ГФКБ у сироватщ кров1 щур1в. Визначення антигетв мозку мае практичне значення для оценки деяких ланцюг1в патогенезу пош-коджень нервово! системи. В оргаМзм в норм1 вщсутня 1мунолог1чна толерантнють до мозково! тканини, яку гематоенцефалчний (ГЕБ) бар'ер захищае в1д 1муноло-пчного конфл1кту. У патогенез1 низки критичних стан1в за впливу р1зних фактор1в може порушуватись захисна функцш ГЕБ, внаслщок чого виникае ф1зюлопчна неаде-кватнють проникливосп бар'ерних утворень, що сприяе проникненню НСБ у кров. Щкавий 1 той факт, що гшоксичт ефекти порушують кровопостачання мозку та можуть сприяти порушенню проникносп ГЕБ. У зв'язку 1з цим ми встановили вмют ГФКБ у сироватц1 кров1 щур1в у динамщ постгшоксичного перюду.
Анал1зуючи дан к1льк1сного визначення нейроспе-циф1чного бшка ГФКБ у сироватц кров1 контрольно! групи щур1в 1 щур1в, як1 зазнали дц гем1чно! гшокси (рис. 3), сл1д вщзначити в1ропдну р1зницю в концентра-ц11 цього бшка. В норм нейроспециф1чн1 бшки практично не виявляються або виявляються у слщовш кшькосп у сироватщ кров1. У контрольнш груш щур1в вмют ГФКБ у сироватц кров1 складав 4,25 нг/мл. Це узгоджуеться з лтературними даними, як1 зазначають, що у сироватц кров1 1нтактно! групи щур1в концентрадя ГФКБ складае близько 4 нг/мл. Вмют дослшжуваного астроглального бшка через одну добу пюля експерименту пддвищувався до 18,5 ± 0,97 нг/мл, через 6 дб цей показник складав 17,3 ± 0,85, через 12 дб р1вень ГФКБ продовжував залишатися щдвищеним, але не вщр1знявся в1д попередах досл1джуваних строк1в (18,5 ± 0,93 нг/мл).
*
*
*
*
*
*
*
1
*
*
% змши
600 ■
500 ■
400 ■
300 ■
200 ■
100 -контроль
А
1Ь
В
Д
* *
Б
_оП1
-т-
■* | ^ Г
12
Ж
1 6 12
1 6 12 1 6 12
1 6 12 1 6 1 6 12
Доби
Рис. 2. Вплив гемiчноТ гшокси на змши розчинноТ форми ГФКБ (% в1д контролю) в головному мозку щур1в:
А - кора головного мозку, Б - гшокамп, В - смугасте тшо, Г - середнш мозок, Д - мозочок, Ж - варолив мют; * - в1рог1дна в1дмшшсть ввд контрольних значень (Р < 0,05)
1ншими словами, аналзуючи дан 1муноферментного визначення ГФКБ у сироватц1 кров1 щурш, як: зазнали впливу гемчно! гшокси, встановили, що концентрация ГФКБ була шдвищеною, а динамша змш вмюту цього бшка не ввдрдзнялася залежно ввд тривалосп постгшо-ксичного перюду.
Визначений нами шдвищений р1вень ГФКБ у сиро-ватц кров1 гшоксичних щурш може вказувати на те, що
дая гемчно! гшокси може бути основним пор1вняно з шшими фактором у формувант порушення проникносп гематоенцефалчного бар'еру (ГЕБ). Р1зний стутнь шдви-щення концентраци ГФКБ у сироватц кров1 може бути результатом деструктивних процесш у тканинах мозку; порушення стану ценгральних нейротрансмтерних систем та змша функцюнування гематоенцефалчного бар'еру може також сприяти ел:м:нац11 НСБ до кров'яного русла.
Вмют ГФКБ, нг/ мл
20
15
10
4-
1 6 12 Перюд дослщжень, доба
б
Рис. 3. Вмкт ГФКБ у сироватщ кров1 щурш (а) та iмуноблотинг сироватки кров1 шур1в-самок (б), якi зазнали дГж гемiчноТ гшокси: * - в1ропдна в1дмшшсть в1д контрольних значень (Р < 0,05)
Розглянемо дш причини, в результат: яких астроци-тарний маркер може ел1м1нувати в кров. По-перше, по-силення астрогтально! реактивносп - особливють мозку, що виявляеться також за р1зноман1тних видав патологш ЦНС. У головному мозку неонатальних 1 до-рослих тварин ГФКБ-iмунореакгивнiсть - надiйний маркер астроглюзу, який корелюе з ультраструктурними проявами реактивних асгроцитiв. По-друге, деградацiя цього бшка внаслiдок посилення неспециф!чного Са2+-
залежного протеолзу, в результата якого утворюються низькомолекулярш деривати, 1мов1ршсть проходження яких через ГЕБ значно вища, нж у iнтактноl форми ГФКБ. Визначено вищу проникшсть ГЕБ у ембрютв i новонароджених пор!вняно з дорослим оргашзмом.
Проте пiдвищений вмют ГФКБ у кров! вказуе не тшьки на модифiкацiю функцiонування ГЕБ i збiльшення його проникносп, а i на можлив1 порушення розвитку ЦНС, оскшьки асгроглiальнi клтини модулюють нейро-
*
0
5
0
К
а
нальну диференщацш. Отримат результати щдвищеного вмДсту ГФКБ у сироватцД кров! нащадкв вiд опромДнених та гдпоксичних щурДв свiдчать про модифiкацiю функцДй ГЕБ i можливД порушення нервово! системи в результат! до гемдчно! гшокси.
Висновки
НДтритна метгемоглобiнемiя середньо! тяжкостД спричиняе змiни концентраци фшаментно! та розчинно! форм ГФКБ, а також 1х сшввДдношення у структурах головного мозку дослiдних шурiв. Установлено збДльшення фДламентно! форми ГФКБ у корД головного мозку, в мо-зочку та середньому мозку в 2,3, 2,6, 1,8 раза вДдповДдно. ЗмДни концентраци розчинно! форми ГФКБ спостерДгали в усiх втдЬях i структурах мозку гдпоксичних щурДв.
Установлено наявнДсть ГФКБ у сироватцД кров! статевозрДлих щурiв, якi зазнали гДпоксичного впливу, що може свiдчити про змдни проникностД ГЕБ в експе-риментальних тварин. Огримаш результати дозволяють розглядати даний нейроспецифДчний бДлок як маркер оцДнки ступеня тяжкостД та спрямованостД перебДгу патологДчних станiв у головному мозку.
ДинамДка змiн концентраци ГФКБ у сироватцД кров! у постппоксичний перДод можливо вДдбуваеться або за ра-хунок посилення експресД! цього бДлка в мозку за да гемiчно! гiпоксi!, або за рахунок протеолДтично! деграда-цд!', у результат! яко! утворюються низькомолекулярнД деривати. 1мовДрнДсть проходження останнiх через ГЕБ значно вища, нДж ДмовДрнДсть проходження через ГЕБ штактною недеградованою формою ГФКБ. ВДдмДчене зростання вмдсту розчинно! форми ГФКБ за да гемдчно! гшокси може бути пДдтвердженням дано! гДпотези.
АналДзуючи данД Дмуноферментного визначення ГФКБ у сироватцД кровД щурДв, як зазнали впливу гемДчно! гшокси, слДд пДдкреслити, що концентрацДя ГФКБ була пДдвищеною, а динамдка змДн вмДсту цього бДлка не вддрДзнялася залежно вДд тривалостД постгдпо-ксичного перДоду. Як показано в низцД експерименталь-них та клДнДчних дослдджень, визначення ГФКБ у сироватцД кровД та в СМЖ може мати дДагностичний характер у випадках пошкодження мозку, в тому числД в разД пошкодження ЦНС плоду та новонародженого.
Бiблiографiчнi посилання
Bakhot, C., Armanini, M., Benett, G.L., Wong, W.L., Hansen, S.E., Tavlor, R., 1991. Increase in glia-derived nerve growth following destruction of hippocampal neurons. Brain Res. 560, 76-83. Dong, L., Carolyn, L., Frank, C., Ellison, J.A., Lysko, P.G., Li, K., Simpson, A., 1999. Astrocytic demise precedes delayed neuronal death in focal ischemic rat brain. Brain Res. Mol. Brain Res. 68, 29-41.
Duka T.I., Leshchins'ka, I.A., Chornaya, V.I., 2002. The characteristics of glial fibrillary acidic protein - component of astroglial intermediate filaments. Biopolym. Cell 18(3), 179-185. Duka, T., Duka, V., Joyce, J.N., Sidhu, A., 2009. Аlpha-Synuclein contributes to GSK-3 beta-catalized Tau phosphorylation in Parkinson's disease models. FASEB J. 23(9), 2820-2830. Duka, T.I., Leschinskaya, I.A., Chernaya, V.I., 2000. Vliyanie gemichekoy gipoksii sredney tyazhesti na soderzhanie NCAM i GFKB v razvivayuschemsya mozge i mozge vzroslyih zhivot-
nyih. Reports of the National Academy of Siences Ukraine 4, 164-170 (in Russian).
Erastov, A.A., Vasin, A.L., Ostrovskyi, A.V., Vainer, E.A., Ka-domtseva, M.B., Ponomarev, V.N., 1991. Yzmenenye elektronnykh spektrov porfyrynovykh system pry obluchenyy ympulsnym elektronnym puchkom. Radyobyolohyia 31(6), 900-904 (in Russian).
Gerginova, M., Huckev, D., Ovanesian, M., 1979. Blood gas. Erythropoietic and pathohistological changes in rat chronic methemoglobinemia models. Folia Med. 21(2), 39-43.
Gotham, S.M., Fryer, P.J., Patterson, W.R., 1988. The measurement of insoluble proteins using a modified Bradford assay. Anal. Biochem. 173(2), 353-358.
Hariri, R.J., 1994. Cerebral edema. Neurosurg. Clin. N. Am. 5(4), 687-706.
Houle, J., 1992. The structural integrity of glial scar tissue associated with a chronic spinal cord lesion can be altered by transplanted fetal spinal cord tissue. J. Neurosci. Res. 31(1), 120-130.
Kindy, M.S., Bhat, A.N., Bhat, N.R., 1990. Transient ischemia stimulates glial fibrillary acid protein and vimentin gene expression in the gerbil neocortex, striatum and hippocampus. Brain Res. Mol. Brain Res. 13(3), 199-206.
Lowry, O.H., Rosebrough, H.I., Farr, Z.A., Randall, RJ., 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193(1), 265-275.
Martin, L.J., Brambrink, A.M., Lehmann, C., Portera-Caillau, C., Koehler, R., Rothstein, J., Traystman, P.J., 1997. Hypoxia-ischemia couse abnormalities in glutamate transporters and death of astroglia and neurons in newborn striatum. Ann. Neu-rol. 42(3), 335-348.
Miller, D.J., Duka, T., Stimpson, C.D., Schapiro, S.J., Baze, W.B., McArthur, M.J., Fobbs, A.J., Sousa, A.M., Sestan, N., Wild-man, D.E., Lipovich, L., Kuzawa, C.W., Hof, P.R., Sherwood, C.C., 2012. Prolonged myelination in human neocortical evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(41), 16480-16485.
Moskalev, J.I., 1991. Otdalennye posledstvija vozdeistvija yoniziruiushcheho izluchenija [Long-term effects of ionizing radiation]. Meditsyna, Moscow (in Russian).
Petito, C.K., Halaby, I.A., 1993. Relationship between ischemia and ischemic neuronal necrosis to astrocytes expression of glial fi-brillary acid protein. Int. J. Dev. Neurosci. 11, 237-239.
Schurr, A., Payne, R.S., Miller, J.J., Rigor, B.M., 1997. Brain lactate is an obligatory aerobic energy substrate for functional recovery after hypoxia: Further in vitro validation. J. Neurochem. 69(1), 423-426.
Sharma, H.S., Kretzschmar, R., Cervos-Navarro, J., Ermisch, A., Ruhle-H.J., Dey, P.K., 1992. Age-related pathophysiology of the blood-brain barrier in heat stress. Prog. Brain. Res. 91, 189-196.
Sherwood, C.C., Duka, T., Stimpson, C.D., Schenker, N.M., Garrison, A.R., Schapior, S.J., Baze, W.B., McArthur, M.J., Erwin, J.M., P.R., Hof, P.R., Hopkins, W.D., 2007. Neocortical synap-tophysin asymmetry and behavioral lateralization in chimpanzees (Pan troglodytes). Eur. J. Neurosci. 31(8), 1456-1464.
Shimada, M., 1994. Pathogenesis of hypoxic encephalopathy during pre- and perinatal periods. No To Hattatsu 26(2), 111-112.
Sonnewald, U., Westergaard, N., Schousboe, A., 1997. Glutamate transport and metabolism in astrocytes. Glia 21(1), 56-63.
Steward, O., Torre, E.R., Tomasuo, R., Lothman, E., 1991. Neuronal activity up-regulates astroglial gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(15), 6819-6823.
Yamashita, K., Vogel, P., Fritze, K., Back, T., Hossmann, K.A., Wiessner, C., 1996. Monitoring the temporal and spatial activation pattern of astrocytes in focal cerebral ischemia using in situ hybridization to GFAP mRNA: Comparison with sgp-2 and hsp70 mRNA and the effect of glutamatye receptor antagonists. Brain Res. 735(2), 285-297.
Hadiumna do редкonегii 02.03.2016
