CC BY
376
ОБЗОР
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.281.012.6
Тиганова И.Г., Ильина Т.С., Романова Ю.М.
ДВУХКОМПОНЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ РЕГУЛЯЦИИ БАКТЕРИЙ - МИШЕНИ ДЛЯ ПОИСКА НОВЫХ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ
ФГБУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ, Москва
Представлен обзор данных литературы о двухкомпонентных системах регуляции бактерий, которые в силу своей вездесущности и роли в регуляции факторов патогенности могут служить перспективными мишенями при осуществлении поиска новых антибактериальных препаратов. Рассматриваются данные: а) о структурной и функциональной организации двухкомпонентных систем на примере систем семейства OmpR (EnvZ/OmpR, PhoQ/PhoP), регулирующих у бактерий множество процессов, способствующих адаптации к стрессовым изменениям в окружающей среде и в организме хозяина, обеспечению вирулентности, образованию биопленок - причины многих хронических инфекций у человека; б) о генах и функциях, регулируемых двухкомпонентными системами, на примерах систем EnvZ/OmpR и в частности белка ОшрЯ, и PhoQ/PhoP. Обсуждаются возможности поиска ингибиторов белков двухкомпонентных систем регуляции или факторов вирулентности, контролируемых этими системами, и их использования в качестве новых антибактериальных препаратов.
Ключевые слова: мишень-направленный поиск антибактериальных средств терапии; двухкомпонентные системы регуляции; биопленки.
Открытие антибиотиков и их использование при лечении самых разных инфекционных заболеваний явились одним из величайших достижений медицины прошлого века. Однако по мере введения в практику все новых и новых антибиотиков и расширения их применения, часто не контролируемого, появились штаммы патогенных бактерий, резистентные ко многим антибиотикам, что привело к значительному снижению эффективности антибиотикотерапии. Быстрому распространению генов множественной резистентности способствовали мигрирующие генетические элементы - плазмиды, бактериофаги, транс-позоны, интегроны и генные кассеты, включающие гены в свой состав и передающие их другим бактериям с помощью специализированных рекомбинаци-онных систем [1]. Другим фактором, ответственным за повышенную резистентность бактерий к антибиотикам, оказалась способность большинства бактерий объединяться в сложноорганизованные сообщества -биопленки, в составе которых они защищены от разных стрессовых воздействий, включая лекарственные препараты, иммунные средства защиты хозяина и неблагоприятные факторы окружающей среды [2-5]. Доказано, что многие хронические заболевания обусловлены именно биопленочным ростом патогенных бактерий в различных органах и тканях, имплантатах, почечных и печеночных камнях [2, 6, 7]. В результате дисперсии (распада до отдельных клеток) биопленочных сообществ происходят дальнейшая колонизация новых поверхностей, приводящая к утяжелению инфекции, и распространение бактерий между различными хозяевами.
Быстрое распространение множественной рези-
стентности к антибиотикам среди микроорганизмов выдвинуло на передний план проблему борьбы с патогенными бактериями путем создания новых лекарственных препаратов с иными механизмами действия, отличными от антибиотиков.
В настоящее время ведется интенсивная работа, направленная на поиск новых терапевтических и профилактических методов лечения бактериальных и хронических инфекций, вызываемых бактериями, образующими биопленки. Полученные в последние годы данные уже позволили выбрать ряд потенциально антибиопленочных агентов, которые могут найти клиническое применение. Ими являются: 1) ферменты, разрушающие биопленочный матрикс [8, 9]; 2) сигналы регуляторной системы quorum sensing [10]; 3) маленькие молекулы, ингибиторы важных для этого процесса белков [11, 12].
В настоящем обзоре мы рассмотрим другие кан-дидатные мишени - белки двухкомпонентных регуля-торных систем бактерий, регулирующих множество процессов, включая вирулентность, и уже известные ингибиторы, взаимодействующие с выбранными мишенями и эффективно подавляющие вирулентность бактерий и процесс образования биопленок.
Двухкомпонентные системы регуляции активности генов у бактерий
Многие патогенные бактерии способны существовать как в окружающей внешней среде, так и в организме хозяина. Находясь в разных экологических нишах, бактерии постоянно подвергаются воздействию изменений в осмолярности и рН среды, источниках углерода, кворума собственной и существующих рядом популяций, температуре, антибиотиках, вязкости среды и т. п. В результате бактерии выработали ряд механизмов, позволяющих им быстро адаптироваться к условиям среды. Адаптация к новым условиям роста обеспечивается достаточно быстрыми изменениями в подвижности клеток и множественной реорганизацией экспрессии генов. Молекулярные ответы на сигналы окружающей среды отличаются сложностью и зависят наряду с другими от двухкомпонентных систем регуляции (Two-Component System - TCS).
Двухкомпонентные системы бактерий являются вездесущими, и все исследованные к настоящему времени виды содержат множество TCS. Механизм действия сигнальной трансдукции, т.е. передача сигналов в системах TCS, осуществляется путем переноса фос-форильной группы от аденозинтрифосфата (АТФ) на специфический остаток гистидина в ферменте гисти-динкиназа (ГК). Это реакция аутофосфорилирования.
Сигнал
Периплазматический
домен Димеризация АТФ-связывающий Регуляторный Эффекторный
доменов
домен
домен
домен
ГК
1 1 (Н)
ТМ1 ТМ2
Схема двухкомпонентной системы сигнальной трансдукции по механизму фосфори лирования. Приведена по West and Stock (2001).
Белок - регулятор ответа (РО), как было показано, фос-форилируется в остатке аспартата и является белком-фосфатазой для гистидинкиназы (см. рисунок). Фос-форилирование вызывает изменение конформации регуляторов ответа, обычно активируя присоединенный домен, который затем приводит к стимуляции или подавлению экспрессии генов-мишеней. Уровень фосфо-рилирования РО контролирует его активность. Некоторые ГК являются бифукциональными, катализируя как фосфорилирование, так и дефосфорилирование родственного РО. Входящие извне сигналы могут регулировать либо киназную, либо фосфатазную активность бифункциональной ГК [13].
У представителей разных видов бактерий выявлено разное число отличающихся двухкомпонент-ных систем регуляции, образующих сеть регуляции. Так, Yersinia enterocolitica кодирует 24 TCS, тогда как Y.pestis - 29 TCS [14,15]. Pseudomonas aeruginosa имеет 64 TCS, благодаря чему она может существовать как во внешней среде, так и в различных нишах внутри организма хозяина [16]. Штамм E.coli K12 содержит в геноме наборы генов примерно для 30 TCS. По сравнению с ним геном Shigella flexneri утратил несколько двухкомпонентных регуляторных систем. У патогенных штаммов E.coli (EPEC и UP-EC, энтеропатогенных и уропатогенных соответственно) обнаружены дополнительные отличающиеся TCS по сравнению с непатогенным штаммом E.coli K12, роль которых пока остается неизвестной. Некоторые регуляторы таких сетей являются глобальными, контролирующими сотни генов. В табл. 1 приведены выборочные данные о встречаемости отдельных TCS в непатогенном, двух патогенных штаммах E.coli и штамме Shigella flexneri.
В то же время показано включение TCS, общих с E.coli K12, в регуляцию экспрессии генов вирулентности у патогенных E. coli и Shigella spp. [17] (табл. 2).
Здесь мы рассмотрим данные о функциях двух TCS, относящихся к семейству OmpR (EnvZ/OmpR и PhoQ/PhoP), регулирующих у бактерий множество процессов, способствующих адаптации к стрессовым изменениям в окружающей среде и в организмах хозяев и обеспечению вирулентности.
Система EnvZ/OmpR. Основными компонентами системы EnvZ/ OmpR являются мембранный белок EnvZ (гистидинкиназа), который в виде димера выполняет функцию сенсора сигнала, и родственный цитоплазматический фактор ответа OmpR [18, 19].
Белок EnvZ при получении сигнала автофосфорилируется в высококонсервативном остатке his243 [20, 21] и регулирует уровень фос-форилированного белка OmpR (OmpR-P) в клетке путем переноса фосфорильной группы EnvZ-P к OmpR. Поскольку белок EnvZ может действовать так же, как фосфатаза, он способен удалять фосфорильную группу белка OmpR-P. В зависимости от условий окружающей среды соотношение киназной и фосфатазной активностей EnvZ модулирует клеточные уровни OmpR-P [22, 23].
Фосфорилированный белок OmpR-P действует как фактор транскрипции, который, связываясь с промоторами генов-мишеней, регулирует их экспрессию. Как оказалось, он осуществляет контроль различных процессов в клетке и функционирует в клетках многих грамотрицательных бактерий как глобальный регулятор транскрипции определенных генов [24].
Гены ompR и envZ входят в состав оперона ompB и котранскрибируются в виде полицистронной мРНК с промотора, расположенного в 5-области по отношению к гену ompR [25]. Было показано, что в клетке синтезируется значительно меньше молекул белка EnvZ по сравнению с OmpR. Согласно сделанной оценке, в клетках E. coli, выращенных в L-бульоне до середины log-фазы, на 3500 молекул белка OmpR приходится лишь 100 молекул белка EnvZ [26]. Почти такие же уровни белков сохранялись при выращивании в условиях высокой осмолярности среды, но при низкой осмолярности они снижались до 60%
Таблица 1
Наличие некоторых двухкомпонентных систем у непатогенного, двух патогенных штаммов E. coli и штамма Shigella flexneri
Название TCS E. coli K12 MG1655 EHEC O157 Sakai UPEC CFT037 S.flexneri 2a 2457T
Семейство OmpR
PhoQ/PhoP + + + +
EnvZ/OmpR + + + +
CpxA/CpxR + + + +
QseC/QseB + + + +
Семейство NarL
RcsC/RcsB + + + +
BarA/UvrY + + + +
Патогенспецифичные
TCS
ECs0417/ECs0418 - + - -
C3564/c3565 - - + -
C4545/c4546 - - + -
C5041/c5040 - - + -
Таблица 2
Участие ряда TCS в регуляции генов вирулентности в патогенных штаммах E.coli и S. flexneri
TCS Регулируемый процесс Тип регуляции Регулируемый ген Патоген Роль в вирулентности
EnvZ/OmpR Транскрипция Позитивный сsgD E.coli Образование ворсинок
EnvZ/OmpR " " ompC S. flexneri инвазия
CpxA/CpxR Сборка " н.о. EPEC пили IV типа
CpxA/CprR Сборка и транскрипция " н.о. UPEC Р-пили
CpxA/CpxR Транскрипция Негативный csgD E.coli Образование ворсинок
CpxA/CpxR " Позитивный virF S. sonnei TTSS и эффекторы
CpxA/CpxR Посттранскрипция " invE S. sonnei TTSS и эффекторы
BarA/UvrY неизвестен " н.о. UPEC Метаболизм углерода
RcsC/RcsD/ RcsB Транскрипция " grvA EHEC TTSS, эффекторы, адгезия
RcsC/RcsD/RcsB транскрипция Негативный pchA,B EHEC TTSS,эффекторы, адгезия
RcsC/RcsD/ RcsB транскрипция " csgD E. coli ворсинки
QseC/QseB транскрипция Позитивный flhDC EHEC флагеллы
PhoQ/PhoP неизвестен " н.о. S.flexneri Устойчивость к РМК
Примечание. н.о. - не определен. Устойчивость к PMN - устойчивость к убивающему действию полиморфноядерных лейкоцитов. EPEC, UPEC, EHEC - энтеропатогенные, уропатогенные, энтерогеморрагические штаммы Escherichia coli соответственно (модифицировано по (Tobe Т., 2008)).
от вышеуказанных. Было показано, что при всех различных условиях выращивания соотношение белков OmpR и EnvZ сохраняется почти постоянным и молекулы OmpR всегда присутствуют в 30-35-кратном избытке над мономерами EnvZ-белка и 60-70-кратном избытке по сравнению с димерами EnvZ. Поскольку оба гена этих белков транскрибируются в виде одной полицистронной мРНК, их экспрессия дифференциально регулируется на уровне инициации трансляции [26].
Белок EnvZ, состоящий из 450 аминокислотных остатков, существует во внутренней цитоплазмати-ческой мембране E. coli в виде димера. Он состоит из периплазматического сенсорного домена и цито-плазматического домена (аминокислотные остатки 180-450), который в свою очередь состоит из линкера (аминокислотные остатки 180-222), домена А (аминокислотные остатки 223-289) и домена В (а.к. остатки 290-450) и обладает киназной и фосфатазной активностью, как и интактный белок EnvZ [27, 28]. Область линкера играет важную роль в передаче сигнала от периплазматического рецептора к цитоплазматиче-скому каталитическому домену. Домен А сам по себе обладает фосфатазной активностью в отношении OmpR [29].
Белок OmpR состоит из 239 аминокислотных остатков и содержит N-терминальный домен с высококонсервативным сайтом фосфорилирования Asp-55, и C-терминальный домен, связывающийся с ДНК [30, 31]. Два домена соединены длинным гибким линкером и образуют структуру c мотивом «крылатая спираль - поворот- спираль» (winged helix-turn-helix) [26]. Область линкера вносит свой вклад во взаимодействие двух доменов белка OmpR. В экспериментах с изменением аминокислотного состава линкера или увеличением/укорочением его длины функция белка OmpR изменялась [32].
Белок OmpR имеет гомологию по всей своей длине с другими белками семейства транскрипционных ре-
гуляторов, такими как PhoB, ArcA, PhoM-ORF2, VirG, PhoP и TctD.
Наиболее полно изученной у бактерий является TCS EnvZ/OmpR непатогенной Escherichia coli K12 на примере ее участия в регуляции экспрессии внешних мембранных белков OmpF и OmpC в ответ на изменения осмолярности в окружающей среде [26]. OmpC и OmpF - белки, образующие поры во внешней мембране, через которые осуществляется пассивная и неспецифическая диффузия низкомолекулярных гидрофильных веществ. Взаимодействие между белком OmpR и промоторами генов ompF и ompC достаточно полно изучено как in vitro с очищенным белком OmpR и промоторной ДНК, так и in vivo c помощью разных генетических подходов [33].
Белок OmpR связывается с ДНК как мономер, образуя затем симметричный или асимметричный ди-мер в зависимости от сайта связывания [32]. Фосфо-рилированный в Asp-55 OmpR сильно повышает свою способность связываться с сайтами С1, С2 и С3, находящимися рядом с промотором гена ompC, и сайтами F1, F2, F3 и F4, находящимися перед промотором гена ompF [32]. Сайты связывания образованы 20 п.о. каждый и содержат консенсусную последовательность. Две молекулы OmpR в каждом сайте связываются по способу «голова к хвосту». Первоначально происходит независимое связывание белка с сайтами F1 и C1, а затем OmpR-P кооперативно связывается с другими сайтами. При низкой осмолярности OmpR-P связывается с С1 -сайтом и кооперативно с сайтами F1, F2 и отчасти с F3, что ведет к экспрессии только гена ompF. При высокой осмолярности концентрация OmpR-P возрастает, что позволяет ему связаться также с сайтами С2, С3 и F4, сайтом-репрессором экспрессии гена ompF. В результате индуцируется экспрессия гена ompC, а экспрессия гена ompF подавляется. Белок OmpR-P, таким образом, участвует как в позитивной, так и в негативной регуляции экспрессии этих генов.
У представителей семейства Enterobacteriaceae, таких как Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Enterobacter cloa-ceae и Shigella flexnerii, белки TCS отличаются высокой степенью консервативности. Они имеют общие мотивы последовательностей, особенно среди аминокислотных остатков, локализованных вблизи или вокруг активных сайтов [33], а в случае регуляторов ответа обладают высокой степенью структурной гомологии [34].
Полученные в последние годы данные показали, что система EnvZ/OmpR является глобальным регулятором по крайней мере 125 генов, включающих и гены малых РНК (small RNAs), у Escherichia coli в ответ на неизвестные сигналы [35, 36], и 224 генов, экспрессия которых повреждается мутацией в гене ompR, у Yersinia pestis [37], при этом часть генов регулируется позитивно, а часть - негативно. Регуляция осуществляется прямым и непрямым способами. Белок OmpR участвует в контроле как генов «домашнего хозяйства», так и генов вирулентности, у представителей самых разных видов бактерий. Регуляция осуществляется прямым и непрямым способами. Показано, что повреждение системы EnvZ/OmpR в результате мутации у S. flexneri ведет к уменьшению ее вирулентности в результате снижения экспрессии генов вирулентности. Однако вирулентность мутанта может быть восстановлена при наличии мультикопий-ности гена ompC, экспрессируемого в этом мутанте, т. е. основной вклад системы EnvZ/OmpR в вирулентность Shigella spp. определяется неизвестной ролью белка OmpC [38].
Другим примером непрямого участия этой системы может служить регуляция образования биопленки и экспрессия генов фимбрий у дикого штамма E. coli, связанная с участием других регуляторов, в частности системы CpxA/CpxR, активируемой, как и EnvZ/OmpR, условиями высокой осмолярности среды [17].
Гены и функции, регулируемые при участии OmpR
Транскриптомный анализ делеционного мутанта envZ/ompR E.coli обнаружил радикальные изменения в транскрипции большого числа генов по сравнению с изогенным штаммом дикого типа. Делеция envZ/ompR приводит к изменению транскрипции 125 генов, причем 71 ген индуцируется, а 54 подавляются [19]. Кроме генов-поринов наружной мембраны ompF и ompC, у делеционного мутанта нарушена, в частности, экспрессия генов биосинтеза цистеина и изолейцина, а также энтерохелина - белка, участвующего в ассимиляции железа. Нарушения правильной регуляции этих процессов могут быть причиной замедленного роста: время удвоения делеционного мутанта envZ/ompR в LB при 37оС составляет 35 мин по сравнению с 27 мин для дикого типа. Неизвестно, все ли изменения транскрипции являются прямым следствием дефекта регулятора OmpR, поскольку нарушение транспорта при отсутствии основных поринов наружной мембраны может также являться причиной нарушения регуляции.
Известно, что белок OmpR играет значительную роль в контроле выражения факторов вирулентности у патогенных бактерий. В частности, у иерсиний био-
химический и генетический анализы показали, что двухкомпонентная система EnvZ/OmpR имеет те же механизмы и действует в целом так же, как и у E.coli: OmpR является глобальным регулятором у Y.pestis и Y.enterocolitica и регулирует синтез поринов. Однако главное отличие состоит в том, что ген главного регулятора биогенеза жгутиков flhDC у иерсиний регулируется белком OmpR позитивно, тогда как у E.coli OmpR является репрессором flhDC [39]. Образование биопленок иерсиниями также позитивно регулируется OmpR [40]. Оказалось, что OmpR-мутант Y.enterocolitica O8 аттенуирован в модели иерсиниоза у мышей [41]. Этот факт обратил внимание исследователей на изучение связи между сенсорно-киназной системой EnvZ/OmpR и выражением генов вирулентности. Белок OmpR так же, как у E.coli, участвует в адаптации бактерий Y.enterocolitica к высокой осмолярности, окислительному стрессу и низким рН [40], а также необходим для выживания иерсиний в макрофагах. Протеомный анализ мутанта OmpR Y.pseudotuberculosis в сравнении со штаммом дикого типа YpIII при различных рН обнаружил, что белки синтеза уреазы являются основными мишенями позитивной регуляции белком OmpR. OmpR связывается с регуляторными областями полицистронных оперо-нов ureABC, ureEF и ureGD, что говорит о прямом участии OmpR в регуляции экспрессии уреазы [42]. Уреаза является важным фактором вирулентности иерсиний, она обеспечивает устойчивость к кислотам, что позволяет бактериям выживать в кислой среде желудочно-кишечного тракта.
Белок OmpR негативно регулирует инвазин - важный фактор адгезии и инвазии, локализованный во внешней мембране иерсиний, который отвечает за проникновение бактерий в клетки кишечного эпителия хозяина [43]. Однако делеционный мутант ompR, проявляющий повышенную экспрессию инвазина, обладает пониженной способностью к инвазии, по-видимому, из-за дефекта других OmpR--регулируемых факторов, обеспечивающих адгезию [40]. Инвазин экспрессируется в разной степени в зависимости от фазы роста и температуры, и его экспрессия регулируется несколькими белками-регуляторами, помимо OmpR.
По-видимому, у Y.pseudotuberculosis альтернативный сигма-фактор РНК-полимеразы, оЕ, обеспечивающий ответ бактерии на стресс клеточной оболочки (cell envelope stress), участвует в осуществлении па-тогенности. Дефект сигнального пути оЕ вызывает нарушение функции ССТТ (системы секреции 3-го типа) in vitro [44]. ССТТ позволяет доставлять белки-эффекторы из бактерий непосредственно в цитоплазму клетки хозяина. В то же время известно, что активность оЕ у E.coli подвержена влиянию экспрессии белков наружной мембраны, в том числе OmpC [45]. Таким образом, двухкомпонентная система EnvZ/OmpR опосредованно может оказывать влияние на функцию ССТТ и, следовательно, вирулентность Y.pseudotuberculosis.
Исследования, проведенные на различных серо-варах сальмонелл, также продемонстрировали роль двухкомпонентной системы EnvZ/OmpR в экспрессии вирулентности и способности формировать биопленки. G.D.Pullinger и соавт. [46.] изучали роль двухком-
понентных сенсорно-киназных систем в патогенно-сти S.enterica серовар Dublin, которая вызывает системные заболевания у крупного рогатого скота. Были сконструированы инсерционные мутанты сальмонелл, дефектные по каждой из 31 сенсорно-киназных систем, с молекулярными метками, которые можно было различать с помощью гибридизации. Смесью этих мутантов вместе с контрольным вирулентным штаммом заражали телят per os и интравенозно и затем определяли соотношение мутантов в различных органах. Оказалось, что мутанты envZ подверглись значительной негативной селекции во всех исследованных тканях при оральном заражении наряду с мутантами barA, phoQ, ssrA и qseC.
У S.enterica серовар Pullorum, патогенной для кур и человека, делеция ompR также приводила к атте-нюации сальмонелл штамма S6702, вирулентного для цыплят. Из 8 исследованных генов (ompR, rpoS, rfaG, rfbH, rhlE, metE, spiA и steB) только мутация в ompR приводила к полной утрате способности продуцировать curly и формировать биопленки. Мутации в других генах обладали небольшим эффектом [47].
Продемонстрировано участие ompR в регуляции экспрессии Vi-полисахарида, капсулярного антигена, играющего роль в вирулентности S.typhi [48]. Деле-ционные мутанты ompR не только продуцировали меньше поринов OmpC и OmpF, но и не агглютинировали с сывороткой к Vi-антигену. Более того, уровень синтеза Pi-полисахарида оказался чувствительным к концентрации NaCl в ростовой среде.
Влияние дефекта сенсорно-киназной системы EnvZ/OmpR на вирулентность, в частности, у сальмонелл, объясняется тем, что она участвует в позитивной регуляции островов патогенности SPI-1 и SPI-2. Острова патогенности 1 и 2 кодируют гены ССТТ, их эффекторов и регуляторов. Экспрессия SPI-1 обеспечивает проникновение бактерий в энтероциты и развитие гастроэнтерита, в то время как SPI-2 необходим для размножения сальмонелл в макрофагах и, таким образом, для генерализации инфекции. Острова пато-генности сальмонелл отличаются от остального генома по составу Г-Ц и, по-видимому, были приобретены путем горизонтального переноса. Они имеют свои системы регуляции транскрипции (SPI-1 регулируется генами hil, а SPI-2 кодирует двухкомпонентную систему SsrA/SsrB, однако в геноме сальмонелл они оказались еще и под контролем хозяйских сенсорно-киназных систем, в частности EnvZ/OmpR и PhoP/Q. Показано, что у мутантов S.enterica серовар typhimu-rium, дефектных по EnvZ, в 3,5 раза снижена экспрессия гена hilA, кодирующего активатор транскрипции генов SPI-1. Система PhoP/Q также участвует в регуляции генов SPI-1 через влияние на экспрессию HilA, однако ее влияние негативно [49].
Белок OmpR участвует в активации ssrA/B-регулона, включающего гены острова патогенности 2 (SPI-2). Белок SsrA является сенсорной киназой, SsrB - белок-регулятор, и вместе они регулируют гены острова патогенности 2, а также большое число генов вне этого острова патогенности, кодирующих эффекторы ССТТ-2. Х. Xu и М. Hensel [51] анализировали экспрессию многих генов ssrA/B--регулона у мутантов, дефектных по двухкомпонентной системе EnvZ/OmpR и ряду других регуляторов. Оказалось, что экспрес-
сия этих генов в высокой степени зависит от регулятора SsrB, но также необходимы системы EnvZ/OmpR и PhoP/Q. В регуляторных участках генов ssrA и ssrB обнаружены сайты связывания для фосфорилирован-ного белка OmpR [50].
Роль системы EnvZ/OmpR в регуляции образования биопленок
Двухкомпонентная система регуляции EnvZ/OmpR участвует в контроле процесса образования биопленок, вызывая в условиях низкой осмолярности окружающей среды активацию или подавление активностей генов, контролирующих образование внеклеточных структур - жгутиков и фимбрий (для E. coli - тонких агрегативных структур, получивших название curly, и фимбрий I типа) - способствующих прикреплению клеток бактерий к различным поверхностям (адгезии), межклеточному взаимодействию и тем самым формированию биопленок. Такие поверхностные образования позволяют бактериям достичь наиболее благоприятного местоположения и участвовать в I стадии образования биопленок - обратимом прикреплении к поверхностям. Они также играют роль в колонизации эпителия и сохраняются в матриксе биопленок [51].
Главным регулятором биогенеза жгутиков у E.coli является оперон flhDC, реагирующий на различные сигналы внешней среды - температуру [52], осмотическое давление [53], рН [54], концентрацию источников углерода - катаболитных репрессоров [55], и ряд низкомолекулярных соединений, в том числе ацетат и пропионат [56].
В регуляторной области оперона flhDC обнаружены сайты связывания для регуляторов транскрипции
- H-NS [57], фосфорилированного OmpR [53], регулятора системы кворум сенсинг QseB [58] и ряда других [59]. Кроме того, на уровне транскрипции flhDC регулируется шаперонами DnaK, DnaJ и GrpE [60], а также белком DnaA и транскрипционным фактором HdfR [62].Часть этих регуляторов негативны, в том числе OmpR. Белок FlhDC участвует в регуляции трех оперонов биосинтеза жгутиков - fliA, fliL и fliB, активируя их транскрипцию.
Тонкие агрегативные фимбрии (curly) способствуют образованию биопленок, осуществляя первоначальное взаимодействие бактерий с поверхностью, а затем взаимодействие бактерий между собой [62]. Сигналы среды, регулирующие экспрессию их генов,
- это температура, концентрация железа, голодание, осмотическое давление и рН. По крайней мере 8 регуляторов влияют на экспрессию генов curly: 3 двухком-понентные системы - EnvZ/OmpR [39], RcsDB [63], и CpxAR [64], а также 4 других регулятора (CRP,H-NS, MlrA и FlhDC) [65-68].
Гены, кодирующие биосинтез curly, организованы в 2 оперона, csgDEFG и csgBA транскрибируемые дивергентно, и разделены регуляторным участком из 515 п.н. Гены csgA и csgB кодируют субъединицы фимбрий, csgG — липопротеин наружной мембраны, необходимый для секреции белков фимбрий, а белок CsgD является регулятором транскрипции гена csgB. Фосфорилированный белок OmpR действует как активатор и как репрессор гена csgD и является репрессором гена csgB [69]. Более того, сайты связы-
вания негативного регулятора гена csgD, фосфори-лированного белка CpxR, перекрываются с сайтами связывания белка OmpR - позитивного регулятора, причем оба регулятора связываются с этими сайтами одновременно [64]. В условиях низкой осмоляр-ности система EnvZ/OmpR активирует транскрипцию гена csgD, что приводит к активации оперонов csgBA и csgDEFG и усиленной экспрессии curly. Таким образом, экспрессия curly является результатом взаимодействия разных регуляторных систем.
Фимбрии I типа обеспечивают связывание с ман-нозосодержащими рецепторами и способствуют прикреплению бактерий к эпителию и инвазии при инфекциях мочевых путей [70].
Структурные гены фимбрий I типа (fimA-fimH) организованы в один оперон, регуляция которого контролируется инвертирующимся элементом размером 314 п.н., расположенным перед геном fimA и фланкированным инвертированными повторами. Инверсия осуществляется при участии двух рекомбиназ, FimE и FimB [71], и регулируется по крайней мере 6 глобальными регуляторами. Двухкомпонентная система EnvZ/OmpR играет негативную роль в экспрессии fim-оперона.
Таким образом, система регуляции бактерий EnvZ/OmpR участвует в регуляции экспрессии жгутиков, curly и фимбрий I типа у E.coli, действуя в зависимости от условий среды, участия других систем регуляции, стадий образования биопленок негативным или позитивным образом. В результате сложного взаимодействия различных регуляторных систем осуществляется правильная смена экспрессии разных генов внеклеточных органелл.
Система PhoQ/PhoP
Двухкомпонентная система регуляции PhoQ/ PhoP патогенных бактерий, таких как Salmonella enterica, Yersinia pestis, Y. enterocolitica, E. coli sp., Neisseria meningitidшs и ряда других, реагирует на низкие концентрации ионов Mg2+ в окружающей среде и регулирует экспрессию многих генов, необходимых для роста бактерий в этих условиях, и, что более важно, экспрессию генов вирулентности [72-75].
Сенсорную функцию в этой системе выполняет белок PhoQ, реагирующий на внеклеточную концентрацию Mg2+. Как в случае белка EnvZ, PhoQ обладает киназной (аутокиназной и фосфотрансферазной) и фосфатазной активностями. Он является белком внутренней мембраны и содержит две трансмембранные области - периплазматическую из 146 аминокислотных остатков и цитоплазматический домен с двумя субдоменами. Один из них содержит консервативный гистидиновый остаток (His277), являющийся сайтом PhoQ фосфорилирования, другой обладает фосфа-тазной активностью и участвует в связывании с АТФ [73]. Низкая концентрация ионов магния активирует аутофосфорилирование белка PhoQ в консервативном гистидиновом остатке и служит сигналом для запуска фосфорилирования белка PhoP в консервативном аспартатном остатке. Фосфорилированный белок PhoP-P получает возможность связываться с промоторами генов-мишеней, активируя или репрессируя их транскрипцию.
Гены, непосредственно контролируемые этим бел-
ком, часто отличаются структурой своих промоторов, что определяет различные уровни экспрессии и кинетику в ответ на сигналы, получаемые при снижении концентрации Mg2+. Доказано, что система PhoQ/PhoP играет роль в адаптации грамотрица-тельных бактерий к позвоночным, беспозвоночным и растительным хозяевам [76, 77]. По-видимому, система PhoQ/PhoP позволяет бактериям определить, что они находятся внутри эукариотической клетки, так как концентрация магния там ниже, чем во внеклеточных жидкостях. Гомологи системы PhoQ/PhoP широко распространены среди как патогенных, так и непатогенных бактерий, однако PhoP-регулоны различных представителей семейства Enterobacteriaceae совпадают лишь частично [78, 79]. Кроме низкой концентрации ионов Mg2+ и Ca2+, эту сенсорно-киназную систему активируют низкие рН и катионные антимикробные пептиды [80, 81].
Белок PhoP по своей структурной организации относится к семейству белков OmpR/PhoP, самому большому структурному семейству, включающему приблизительно 30% всех белков, регуляторов ответа TCS. Члены семейства обычно состоят из двух доменов, соединенных гибким линкером: N-терминального домена «рессивера» и С- терминального ДНК-свя-зывающего домена. Для регуляторов ответа семейства OmpR/PhoB характерным является присутствие структурного мотива альфа4- бета5-альфа5 домена рессивера, пластичная поверхность которого важна для димеризации и последующего связывания белка с ДНК. Предполагается, что бактериальная вирулентность может подавляться при нарушении PhoQ/PhoP сигнального пути, если какое-то вещество сможет специфически связываться с указанным мотивом.
Влияние системы PhoQ/PhoP на вирулентность бактерий и формирование биопленок
Сигнальная система PhoQ/PhoP играет важную роль как в регуляции вирулентности, так и в обеспечении выживаемости бактерий S. enterica serovar typhimurium, Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis в макрофагах (цит. по [15]) и, кроме того, в случае Y. pestis - в полиморфноядерных лейкоцитах [15].
Потеря PhoP у сальмонелл и других патогенных бактерий приводит к аттенюации, поскольку в число PhoP-активируемых генов входят факторы вирулентности, которые сообщают резистентность к компонентам врожденного иммунного ответа - антимикробным пептидам и макрофагам - и позволяют бактериям выживать внутри фагосомы [82, 83]. Большинство промоторов сальмонелл, увеличивающих свою активность во время инфекции хозяйских клеток, находятся под контролем системы PhoQ/ PhoP. С помощью IVET (In vivo Expression Technology) было обнаружено, что 7 из 8 промоторов сальмонелл, активных в макрофагах и эпителиальных клетках, зависят от phoP [84]. PhoP-зависимые гены, определяющие вирулентность сальмонелл, приобретены путем горизонтального переноса и, по-видимому, оказались под контролем этой системы для правильной экспрессии генов вирулентности в нужном месте и в нужное время. Гены, активируемые PhoP (ССТТ-2), в соответствии с этим предположением должны индуцироваться при низких кон-
центрациях Mg2+ in vitro и внутри хозяйских клеток in vivo. Репрессируемые PhoP гены (ССТТ-1) будут выражаться вне клеток, где концентрация Mg2+ высока, таким образом, способствуя проникновению в клетки хозяина [85].
Система PhoQ/PhoP регулирует вирулентность P. aeruginosa. МутацияphoQ в 10 000 раз сокращает высев мутантных бактерий, смешанных 1:1 с диким типом, из легких крыс при 7-дневной хронической инфекции и уменьшает цитотоксичность по отношению к человеческим клеткам эпителия бронхов [86]. PhoQ/PhoP регулирует устойчивость псевдомонад к полимиксину В и катионным антимикробным пептидам, усиливая экспрессию оперона arnBCADTEF в ответ на низкие концентрации магния. Этот оперон кодирует цепь ферментов, модифицирующих липид А липополисахари-да, добавляя к нему 4-аминоарабинозу, что уменьшает общий отрицательный заряд липополисахарида, ослабляя его взаимодействие с поликатионными антибиотиками [87].
Однако между PhoQ/PhoP сальмонелл и псевдомонад есть фундаментальные различия: резистентность к катионным пептидам индуцируется у P.aeruginosa при низких концентрациях магния, а у S. typhimurium - при высоких. По-разному эти бактерии реагируют на катионные пептиды и pH. PhoQ сальмонелл может как фосфорилировать (активировать), так и дефос-форилировать (репрессировать) PhoP, в то время как PhoQ псевдомонад, по-видимому, регулирует PhoP в основном путем дефосфорилирования [86]. Несмотря на присутствие системы PhoQ/PhoP у многих бактерий, ее функционирование и строение регуло-нов могут быть различными, что отражает различия в их образе жизни. Сальмонеллы являются факультативно внутриклеточными патогенами, в то время как Pseudomonas - преимущественно внеклеточный патоген. Другие внеклеточные патогены, Neisseria meningitidis и Erwinia carotovora (патоген растений), также имеют гомологи системы PhoQ/PhoP, которые регулируют их вирулентность, и для менингококка показано, что эта TCS активируется в ответ на контакт с клеткой хозяина [88, 89].
Полиморфизм системы PhoQ/PhoP еще больше проявляется в ее участии в формировании биопленок. У псевдомонад мутации phoQ и phoP влияют на подвижность бактерий за счет пилей IV типа, что в свою очередь отражается на способности образовывать биопленки, и могут влиять на формирование биопленок через систему кворум сенсинг (QS). Однако мутации phoP и phoQ могут приводить к противоположным результатам, действовать по-разному при высоких и низких концентрациях магния и у разных видов, и даже штаммов бактерий [86, 90].
Участие системы PhoQ/PhoP в формировании биопленок и ее роль в трансмиссии инфекции доказаны для Y. pestis. Мутанты phoP обладают пониженной способностью формировать биопленки в переднем отделе желудка блохи. Бактерии дикого типа образуют массивные биопленки, которые закупоривают пищевод блохи и при укусе попадают в кровь млекопитающего. Таким образом, мутанты phoP, нормально размножаясь в организме блохи, оказываются менее трансмиссивными [91].
Использование двухкомпонентных систем
регуляции бактерий в качестве мишеней при поиске новых антибактериальных препаратов
Быстрое распространение множественной устойчивости к антибиотикам, включая вновь открываемые, создало острую необходимость разработки новых лекарственных препаратов с разными механизмами действия, не приводящими к появлению резистентности у бактерий. Одна из перспективных моделей в исследованиях такого рода предполагает поиск ингибиторов двухкомпонентных систем регуляции бактерий, действие которых охватывает многие функции бактериальных клеток, от регуляции метаболизма до более специализированных, таких как контроль вирулентности и способности к образованию биопленок. Все вышесказанное позволяет рассматривать системы EnvZ/OmpR и PhoQ/PhoP как привлекательные мишени для поиска ингибиторов, которые могли бы повлиять на способность бактерий формировать биопленки и на их вирулентность. В настоящее время уже проводятся исследования с использованием белков семейства PhoQ/PhoP в качестве мишеней для поиска новых лекарственных препаратов, подавляющих вирулентность ряда патогенных бактерий [72], и уже получен ряд соединений, нарушающих образование комплекса & еМепса PhoP-ДНК, необходимого для регуляции экспрессии генов, связанных с бактериальной вирулентностью.
Использование компонентов сигнальных систем в качестве мишеней для их ингибирования может привести к созданию нового класса антибактериальных агентов. Использование таких мишеней имеет большое преимущество по сравнению с использованием мишеней для известных антибиотиков, так как развитие резистентности к препаратам-ингибиторам, а также негативное влияние на нормальную микрофлору человека менее вероятны. Роль ТСБ в регуляции био-пленкообразования и поддержании структуры делает их привлекательной потенциальной моделью для поиска ингибиторов процесса формирования биопленок патогенными бактериями. Возможными мишенями для внедрения в двухкомпонентные системы регуляции могут быть сигналы аутофосфорилирования, ауто-фосфорилирование сенсорной киназы, перенос фосфата с фосфорилированной сенсорной киназы на регулятор ответа, дефосфорилирование сенсорной киназы и связывание с промотором регулируемого гена [92, 93]. Если молекула-ингибитор попадает в активный сайт двухкомпонентной системы, который является общим для нескольких ТС&, то тогда возможно ингибирование многих двухкомпонентных систем в бактериях одного вида. Для двухкомпонентных систем, имеющих высокую степень гомологии среди грамотрицательных или грамположительных бактериальных видов, один и тот же ингибитор может обладать широким спектром действия, если он повреждает общий для всех систем сайт [94]. Ингибитор, который специфически воздействует на сайт взаимодействия между фосфорилируемым регулятором ответа и промотором регулируемого гена, должен селективно подавлять экспрессию этого гена у определенного вида бактерий. Для поиска ингибиторов биопленкообразования все высказанные положения особенно важны, так как известно, что биопленки, образуемые микроорганизмами при формировании хронического очага инфекции, как правило, состоят из
представителей разных видов. Таким образом, с теоретической точки зрения ингибиторы могут в своей активности быть как экстремально специфичными для одного вида бактерий, так и обладать широким спектром действия сразу для нескольких видов бактерий.
К настоящему времени уже есть несколько примеров различных ингибиторов TSC. Первые синтетические ингибиторы были найдены для модулирования TSC системы AlgR2/AlgRl, которая регулирует продукцию альгината - фактора вирулентности P aeruginosa, экспрессирующегося в легких пациентов с кистозным фиброзом при инфекциях [95]. Методом microarray было показано, что изотиазолон и имидазол подавляют активацию промотора гена algD, участвующего в контроле синтеза альгината, причем ни одно из этих соединений не подавляет рост клеток псевдомонад. Изотиазолоны оказывают значительный эффект на аутофосфорилирование AlgR2 (гистидинкиназы), но не подавляют связывание AlgRl (регулятор ответа) с промотором algD. Серия структурно родственных имидазолу соединений, как показано, является ингибиторами четырех гистидинкиназ, а именно, EnvZ, PhoQ, BvgS EvgS [96]. В этом случае прототипы этих соединений подавляют рост таких бактерий, как окса-циллинрезистентные S.aureus, пенициллинрезистент-ные S.pneumoniae при минимальной ингибирующщей концентрации 0,39-3,12 мкг/мл.
Было показано, что как гистидинкиназа, так и регулятор ответа TCS могут поражаться и малыми молекулами [97]. Вокмицин C - известный ингибитор гистидинкиназы, который был обнаружен методом скрининга ингибиторов WalK гистидинкиназы у B. subtilis, ингибирует аутофосфорилирование WalK как у Bacillus subtilis, так и у S. aureus. Вокмицин C поражает консервативный каталитический домен WalK и поэтому был отнесен к ингибиторам, обладающим активностью в отношении различных гисти-динкиназ. Одним из таких примеров является орто-лог WalK - VicRK TCS у S.mutans, который участвует в процессе сахарозозависимого биопленкообразования. Вокмицин C, как было показано, ингибирует in vitro аутофосфорилирующую активность очищенного Vi-cRK с достаточно высокой активностью. Добавление вокмицина C в концентрациях ниже минимальной ин-гибирующей концентрации приводит к образованию неполноценной биопленки и к редукции ее объема, что свидетельствует о возможности поражения TCS малыми молекулами с целью подавления образования биопленок [98]. Вторичный бактериальный метаболит каролактон-54 воздействует на жизнеспособность биопленок S.mutans в наномолярных концентрациях [99]. Это соединение имеет очень слабый эффект на рост планктонных бактерий, но убивает бактерии, которые живут в состоянии биопленки. Как было показано, каролактон действует на экспрессию 6 различных TCS в клетках биопленок S.mutans: CiaRH, VicKRX, RelRS, SMU.1037c/1038c, SMU.659/660, ComDE [100]. Методом microarray-анализа идентифицировано, что у известных генов, контролируемых системой VicR и ComDE значительно снижена экспрессия при обработке каролактоном. И хотя это соединение не действует на рост планктонных клеток, т. е. его эффект не связан с микробиоцидным механизмом, способность каролактона изменять способность к образованию
биопленки представляет собой альтернативную стратегию для контроля образования биопленок малыми молекулами и демонстрирует возможность использовать повреждения (вмешательства) в TCS как средство для контроля бактериальных биопленок.
В последние годы была сформулирована концепция поиска антимикробных препаратов, получившая название «Мишень-направленный (таргетный) поиск лекарственных препаратов» [12, 101]. Она состоит из нескольких ключевых этапов. Первым и самым важным этапом является поиск мишени, на которую будет направлено действие создаваемого препарата. В случае антибактериальных препаратов мишенями могут быть как бактериальные факторы патогенности, так и эука-риотические белки, которые необходимы патогену для реализации инфекционного процесса. Для выбора мишени используются накопленные данные о механизмах инфекционного процесса определенного возбудителя.
Вторым этапом этой методологии является выбор химического вещества - структурного прототипа будущего лекарства, который может быть как продуктом химического синтеза, так и природным веществом [102]. Поиск специфических ингибиторов выбранных мишеней осуществляется с помощью метода виртуального скрининга, если известна третичная структура белка-мишени, или экспериментального скрининга с использованием библиотек химических соединений и биологических систем тестирования активности потенциального ингибитора. На последующих этапах этой сложной методологии соединения, отобранные как кандидаты-ингибиторы со специфической активностью, испытыва-ются в различных репортерных тестах, биологических моделях инфекционного процесса на эукариотических клеточных линиях и экспериментальных животных.
Наши исследования в данной области связаны с поиском средств борьбы с возбудителями тяжелых хронических инфекций дыхательных путей у людей с наследственным заболеванием «кистозный фиброз» и тяжелых инфекций мочевыводящих путей при мочекаменной болезни - бактериями Pseudomonas aruginosa и Burkholderia cepacia. Нами получен мутант B.cepacia, мутация в гене ompR у которого приводила к потере способности формировать биопленки и соответственно к быстрому выведению клеток мутантного штамма из организма зараженных животных [103]. Как описано выше, белок OmpR, представляет собой транскрипционный регулятор, под контролем которого осуществляется экспрессия многих генов, и с помощью сравнительного протеомного анализа мы предполагаем установить, нарушение экспрессии какого OmpR-зависимого гена в мутанте приводит к нарушению процесса биоплен-кообразования. И поскольку мишенями в поиске новых препаратов могут быть не только основные компоненты TCS, мы будем использовать в качестве мишеней для направленного поиска химических веществ - потенциальных ингибиторов процесса формирования биопленок - белки, экспрессия которых нарушена в результате мутации в гене ompR. Для этого будут осуществлены поиск, выбор и молекулярно-генетическая характеристика соответствующих белков-мишеней для виртуального поиска химических соединений - структурных прототипов будущих лекарственных средств для борьбы с инфекциями, обусловленными способностью бактерий формировать биопленки.
Сведения об авторах:
Тиганова Ирина Глебовна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. ФГБУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи;
Ильина Тамилла Сергеевна - доктор биол. наук, проф., вед науч.сотр. того же института;
Романова Юлия Михайловна - доктор биол. наук, проф., вед научн. сотрудник того же института; e-mail: genes2007@yandex.ru.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ильина Т.С. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012; 4: 3-13.
2. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Sciense. 1999, 284: 318-22.
3. Donlan R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg. Infect. Dis. 2002; 8: 1-20.
4. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Генетика. 2004; 40(11): 1445-6.
5. Романова Ю.М., Диденко Л.В., Толордава Э.Р., Гинцбург А.Л. Вестник РАМН. 2011; 10: 31-9.
6. Тиганова И.Г.,Романова Ю.М., Галкина С.И. и др. Медицинский алфавит. Эпидемиология и санитария. 2009; 15: 22-6.
7. Диденко Л.В. , Толордава Э.Р., Боровая Т.Г. и др. Урология. 2012; 3: 22-8.
8. Tetz G.V., Artemenko N.K., Tetz V.V. Antimicrob. Agents Chemother. 2009; 53(3): 1204-9.
9. Степанова Т.В., Романова Ю.М., Алексеева Н.В.и др. Медицинский алфавит. Лаборатория. 2010; 1: 21-27.
10. Хмель И.А., Метлицкая А.З. Молекулярная биология. 2006; 40(2): 195-210.
11. Worthington R.J., Richards J.J., Melander Ch. Org. Biomol. Chem. 2012; 10: 7457-74.
12. Карягина-Жулина А.С., Зигангирова Н.А., Гришин А.В. Вестник РАМН. 2011; 10: 22-8.
13. West A.H., Stock A.M. Trends Biochem. Sci., 2001; 26: 369-76.
14. Flamez C., Ricard I., Arafah S. et al. Int. J. Med. Microbiol. 2008; 298(3-4): 193-207.
15. O'Loughlin J. L., Spinner J.L., Minich S.A., Kobayashi S.D. Infect. Immune. 2010; 78(2): 773-82.
16. Grabenstein J.P.,Marceau M., Pujol C. et al. Infect. Immun. 2004; 72: 4973-84.
17. Tobe T. In: Utsumi R., ed. Bacterial signal transduction: networks and drug targets. Springer; 2008: 189-99.
18. Forst S.A., Roberts D.L. Res. Microbiol. 1994; 145: 363-73.
19. Oshima T.,Aiba H., MasudaY.et al. Mol. Microbiol. 2002; 46(1): 281-91.
20. YangY.,Inouye M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991; 88: 11057-61.
21. Yang Y., Inouye M. J. Mol. Biol. 1993; 231: 335-42.
22. YoshidaT., Cai Sh. J., Inouye M. Mol. Microbiol. 2002; 46(5): 1283-94.
23. Qin L., Yoshida T., Inouye M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001; 78: 908-13.
24. Shin S., Park C. J. Bacteriol. 1995; 177: 4696-702.
25. Hall M.N., Silhavy T.J. J. Mol. Biol. 1981; 151: 1-15.
26. Cai S.J., Inouye M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 2415-6.
27. Park H., Saha S.K., Inouye M. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1998; 95: 6778-32.
28. Qin L., Datta R., Kurokawa H. et al. Mol. Microbiol. 2000; 36: 24-32.
29. Zhu Y., Qin L., Yoshida T., Inouye M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97: 7808-13.
30. Kato M., Aiba H., Tate S. et al. FEBS Lett. 1989; 249: 168-72.
31. Tate S., Kato M., Nishimura Y. et al. FEBS Lett. 1988; 242: 27-30.
32. Rhee J E., Sheng W., Morgan L.K. et al. J. Biol. Chem. 2008; 283(13): 8664-77.
33. Stock J.B., Ninfe A.J., Stock A.M. Microbiol. Mol. Boil. Rev. 1989; 53(4): 450-90.
34. Barrett J.F., Hoch J.A. Antimicrob. Agents. Chemother. 1998; 42(7): 1629-36.
35. Oshima T., Aiba H., Masuda Y. et al. Mol. Microbiol. 2002. Vol. 46. P. 281-91.
36. Quillier M., Gottesman S. Mol. Microbiol. 2006; 59: 231-47.
37. Gao H., Zhang Y., Han Y. et al. BMC Microbiol. 2011; 11: 39-46.
38. Bernardini M. L., Sanna M.G., Fontaine A. et al. Infect. Immun.
1993; 61: 3625-35.
39. Prigent-Combaret C., Brombacher E., Vidal O. et al. J. Bacteriol. 2001; 183: 7213-23.
40. Raczkowska A., Skorek K., Brzostkowska M. et al. FEMS Microbiol. Lett. 2011; 321(1): 43-9.
41. Dorrell N., Li S.R., Everest P.H. et al. FEMS Microbiol. Lett. 1998; 165(1): 145-51.
42. Hu Y.,Wang Y., Ding L. et al. Microbiol. 2009; 155: 3622-31.
43. Brostek K., Raezkowska A., Zacada A. FEMS Microbiol. Lett. 2003; 228(2): 265-71.
44. Carlsson K.E., Liu J., Edqvist P. J., Francis M.S. Infect. Immun. 2007; 75: 3913-24.
45. Mecsas J., Rouviere P.E., Ericson J.W. et al. Genes & Dev. 1993; 7: 2618-28.
46. Pullinger G.D., van Diemen P.M., Dziva F., Stevens M.P. Microbiol. 2010; 156: 3108-22.
47. Lu Y., Chen S., Dong H. et al. Avian Dis. 2012; 56(1): 134-43.
48. Pickard D., Li J., Roberts M. et al. Infect. Immun. 1994; 62: 3984-93.
49. Golubeva Y.A., Sadik A.Y., Ellenmeier J.R., Slauch J.M. Genetics. 2012; 190: 79-90.
50. Xu X., Hensel M. Infect. Immune. 2010; 78: 49-58.
51. Диденко Л.В., Андреевская С.Г., ТИганова И.Г. и др. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2009; 3: 44.
52. Adler J., Templeton B. Microbiol. 1996; 46: 173-84.
53. Shin S., Park C. J. Bacteriol. 1995; 177: 4696-702.
54. Soutourina O.A., Krin E., Laurent-Winter C. et al. Microbiol. 2002; 148: 1543-51.
55. Yokota T., Gots J.S. J. Bacteriol. 1970; 103: 513-6.
56. Polen T., Rittmann D.,Wendisch V.F., Sahm H. Appl. Environ. Microbiol. 2003; 69: 1759-74.
57. Soutourina O., Kolb A., Krin E. et al. J. Bacteriol. 1999; 181: 7500-8.
58. Clarke M.B., Sperandio V. Mol. Microbial. 2005; 57(6): 1734-49.
59. Francez-Charlot A.,Laugel B., Van Gemert A. et al. // Mol. Microbiol. 2003. Vol.49 (3). P. 823-832.
60. Shi W.,Zhou Y., Wild J. et al. J. Bacteriol. 1992; 174: 6256-63.
61. Ko M., Park Ch. J. Bacteriol. 2000; 182: 4670-72.
62. Olsen A., Jonsson А., Normark S. Nature. 1989; 138(62): 652-5.
63. Ferrieres I., Clarc D.J. Mol. Microbiol. 2003; 50(5): 1665-82.
64. Jubelin G., Vianney A. Beloin Ch. et al. J. Bacteriol. 2005; 187: 2038-49.
65. Zheng D., Constantinidou Ch., Hobman J.I.,Munchin S.D. Nucleic Acids Res. 2004; 32: 5874-93.
66. Arnqvist A., Olsen A..,Normark S. Mol. Microbiol. 1994; 13(6): 1021-32.
67. Brown P.K., Dozois C.M., Nickerson C.A. et al. Mol. Microbiol. 2001; 41(2): 149-63.
68. Pruss B.M., Liu X., Hendrickson W., Matsumura P. FEMS Micro-biol. Lett. 2001; 197(1): 91-7.
69. Ogasawara H., Yamamoto K., Ishihama A. J. Bacteriol. 2011; 193: 2587-97.
70. Martinez J.J., Mulvey M.A., Schilling J.D. et al. EMBO J. 2000; 19(2): 2803-12.
71. Klemm P. EMBO J. 1986; 5(6): 1389-93.
72. Miller S.I., Mekalanos J.J. J. Bacteriol. 1990; 172: 2485-90.
73. Tang Y.T., Gao R., Havranek E. et al. Chem. Biol. Drug Des. 2012; 79(6): 1007-17.
74. Kato A., Groisman E.A. In: Utsumi R., ed. Bacterial signal transduction: networks and drug targets. Springer. 2008; 7-36.
75. Fass E., Groisman E.A. Curr.Opin. Microbiol. 2009; 12(2): 199204.
76. Llama-Palacious Derzelle S.,Turlin E., Duchaud E. et al. J. Bacteriol. 2004; 186; 1270-9.
77. A., Lopez-Solanilla E., Poza-Carrion C. et al. Mol. Microbiol. 2003; 49: 347-57.
78. Monsieurs P., De Keersmaecker S., Navarre W.W. et al. J. Mol. Evol. 2005; 60: 462-74.
79. Perez J.C., Shin D., Zwir I. et al. J. PloS Genet. 2009; 5: e1000428.
80. Bader M.W., Sanowar S., Daley M.E. et al. Cell. 2005; 22: 461-72.
81. Prost L.R., Daley M.E., LeSage V. et al. Mol. Cell. 2007; 26: 165-74.
82. Fields P.I., Groisman E.A., Heffron F. Science. 1989; 243: 1059-62.
83. Grabenstein J.P., Fukuto H.S., Palmer L.E., Bliska J.B. Infect. Immun. 2006; 74: 3727-41.
84. Heithoff D.M., Conner C.P., Hentschel U. et al. J. Bacterial. 1999; 181: 799-807.
85. Groisman E.A. J. Bacteriol. 2001; 183(6): 1835-42.
86. Gooderham J., Gellatly S.L., Sanschagrin F. et al. Microbiol. 2009; 155: 699-711.
87. McPhee J.B., Lewenza S., Hancock R.E. Mol. Microbiol. 2003; 50(1): 205-17.
88. Flego D., Marits R., Eriksson A.R. et al. Mol. Plant Microbe Interact. 2000; 13: 430-38.
89. Jamet A., Rousseau C., Monfort J.-B. et al. Microbiol. 2009; 155: 2288-95.
90. Qing Y., Gao W., Wu X.-G., Zhang L.-Q. Microbiol. 2009; 155: 124-33.
91. Rebeil R., Jarrett C.O., Driver J.D. et al. J. Bacteriol. 2013; 195: 1920-30.
92. Roychoudhury S., Zeilinski N.A., Ninfa A.J. et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; 89: 2659-63.
93. Stock J.B., Surette M.G., Levit M., Park P. In: Hoch J.A., Silhavy T.J., eds. Two component signal transduction. Washington D.C.: ASM Press; 1995; 25-51.
94. Volz K. Ibid. 53-64.
95. Roychoudhurry S., Zielinski N.A., Ninfa A.J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; 90: 965-9.
96. Yamamoto K., Kitayama T., Ishida N. et al. Biosci.Biotechnol. Biochem. 2000: 64: 912-23.
97. Belchtva A., Golemi-Kotra D. J.Biol. Chem. 2008; 283: 12354-64.
98. Eguchi Y., Kabo N., Igarashi M., Utsumi R. Antimicrob. Agents Chemother. 2011; 55: 1475-84.
99. Kunze B., Reck A., Dotsch A., Lemne A., Schummer S., Irshick H., Steinmetz H., Wagner-Dobler I., BMC Microbiol. 2010; 10: 199.
100. Reck M., Rutz K., Kunze D. et al. J.Bacteriol. 2011; 193: 56925706.
101. Cedelski L. et al Nat. Rev. Microbiol. 2008; 6(1): 17-27.
102. Barrett J.F., Isaacson R.E. In: Bristol J.A., ed. Annual reports in medicinal chemistry SanDiego: Academic Press, Inc.; 1998: 11-118.
© КО УДК
Тандемно организованные повторы рибосомной ДНК образуют так называемые ядрышковые организаторы (ЯО). В то же время многие рДНК-подобные сегменты могут обнаруживаться и на (ЯО)- хромосомах. Было показано, что кроме биогенеза рибосом ядрышко обеспечивает большое число функций, таких как регуляция клеточного цикла, ответ на стрессы, регуляция транскрипции, что часто ведет к запуску клеточных каскадов. Механизм появления рДНК-подобных сегментов (ЯО)- на хромосомах пока не исследован и открыт для различного рода предположений. Около трети доменов, ассоциированных с ядрышком, связано с классом повторов $ШЕА4/и, гомогенными последовательностями и тандемными повторами. Возможно, относительное положение хромосом и ядрышка может способствовать или препятствовать взаимодействию хромосом с кластерами рДНК. В более ранних работах мы изучали вариабельность двух крупных повторов в центральной части рМГС, LR1 и LR2, сходных ~ на 90%, расположенных на расстоянии нескольких сотен п.н. друг от друга. В настоящей работе проведен поиск LR1-LR2-подобных сегментов на других хромосомах, охарактеризованы их концевые участки вблизи точек разрыва, а также области генома, в которые встраиваются LR1-LR2-подобные участки. Ключевые слова: человек; рДНК; рМГС; обмен участками между хромосомами; потенциальные точки разрыва в рМГС.
103. Романова Ю.М., Тиганова И.Г., Хмель И.А. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011; 3: 3-10.
Поступила 03.12.13
DOUBLE-COMPONENT BACTERIAL REGULATION SYSTEMS AS A TARGET FOR SEARCHING NEW ANTIMICROBIAL AGENTS
Tiganova I. G, Il'inaT. S, Romanova Yu. M.
Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia
A review of the literature data concerning double-component bacterial regulation systems was given. The observed data concern: a) structural and functional organization based on the example of systems of the family OmpR (EnvZ/OmpR, PhoQ/PhoP), which regulate a number of processes providing adaptation to stress conditions in the environment and host body providing the virulence and biofilm formation, the cause of different human chronic infections; b) the genes and functions regulated by the double-components systems, based on the example of EnvZ/OmpR system, especially OmpR protein, and PhoQ/PhoP system. The possibilities for the searching of the double-component system protein inhibitors and their role in depressing pathogenic bacteria virulence were discussed. Key words: target for searching new antimicrobial agents; double-component regulation systems; biofilms.
Рибосома является одной из самых древних и важных органелл клетки, сохранившей общие черты организации у всех ныне живущих организмов. Гены, ответственные за синтез нуклеиновых кислот и белков, формирующих рибосому, и обслуживающие процесс их работы, созревание продуктов транскрипции и переход зрелых продуктов в активное состояние, образуют крупнейший полигенный комплекс, от согласованной работы которого зависит жизнеспособность отдельных клеток и всего организма в целом. Недавно было показано, что, кроме биогенеза рибосом, ядрышко обеспечивает большое число функций, таких как регуляция клеточного цикла, ответ на стрессы и т.д. [1-3].
Рибосомная ДНК (рДНК) в геномах всех позвоночных существует в форме множественных дискретных кластеров. Тандемно организованные повторы рДНК образуют так называемые ядрышковые организаторы (ЯО), специфические области, служащие основой для формирования ядрышек в телофазе митоза. В геноме
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ШЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Куприянова Н.С., Нечволодов К.К., Корсуненко А.В.
АНАЛИЗ ФРАГМЕНТОВ РИБОСОМНОГО МЕЖГЕННОГО СПЕЙСЕРА ЧЕЛОВЕКА, ОБНАРУЖЕННЫХ НА ХРОМОСОМАХ, НЕ СОДЕРЖАЩИХ ЯДРЫШКОВЫЕ
ОРГАНИЗАТОРЫ
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук,
ул. Ляпунова, 34/5, Москва
