Дослідження асоціацій мікроорганізмів урогенітального тракту жінок за допомогою ПЛР в реальному часі Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© 'Ядерна А. Г., 'Голодок Л. П., 2Хлопова О. В., 'Вшнков А. I. УДК 579.61:616-078

'Ядерна А. Г., 'Голодок Л. П., 2Хлопова О. В., 1Вiннiков А. I.

ДОСЛ1ДЖЕННЯ АСОЦ1АЦ1Й М1КРООРГАН1ЗМ1В УРОГЕН1ТАЛЬНОГО ТРАКТУ Ж1НОК ЗА ДОПОМОГОЮ ПЛР В РЕАЛЬНОМУ ЧАС1

1Днiпропетровський нацiональний унiверситет iм. Олеся Гончара (м. Днiпропетровськ) ^агностичний центр медичноГ академГГ (м. Днiпропетровськ)

nastinka_bysinka@mail.ru

Роботу було виконано у межах держбюджетно! теми №1-294-15, що виконуеться на кафедр1 м1кро-бюлоги, в1русологИ та б1отехнологИ Дыпропетров-ського нацюналыного ун1верситету 1м. Олеся Гончара, № державно! реестрацп 011511002385.

Вступ. Останн1м часом, все бтыше уваги при-д1ляеться м1кроекологИ жшочого уроген1талыного тракту. П1двищений 1нтерес до дано! м1кроекосис-теми в значнм м1р1 пояснюетыся тим, що ролы ево-люц1йно сформованих м1кробних популяцм б1отопу п1хви полягае не ттыки у п1дтримц1 колон1зац1йно! резистентност1 сечостатево! системи, а й у форму-ванн1 м1кроеколог1чного здоров'я новонароджених, а отже I популяци в цтому. Таким чином, ж1нка вщ-грае велику ролы у формуванн1 майбутныого, а отже в ц1лому кожного з нас [5,6]. Вапналыно-цервкалына м1крофлора е природним ф1з1олог1чним бар'ером, який забезпечуе стмкюты уроген1талыного тракту до росту I розмноження р1зних Ыфекцмних агент1в. Основу захисту екосистеми урогенггалыного тракту ж1нок створюе резидентна м1крофлора - лактоба-цил. Сыогодн1 будь-який вар1ант порушення вап-налыного бютопу сл1д розглядати як дисб1оз. Дисбаланс бюти уроген1талыного тракту ж1нок представляе порушення к1лык1сно-як1сних взаемин резидентних м1кроорган1зм1в - сапроф1тних та умовно-патоген-них, що населяюты сечову систему в норм1. Порушення м1кробюлопчного балансу статевих орган1в стае одн1ею з причин ранныого переривання вапт-ност1, передчасних полог1в, безпл1ддя, Ыфекцмних захворюваны статевих орган1в. При цыому в бты-шост1 випадк1в ця хвороба проявляетыся незначною м1рою, проте може стати причиною розвитку ряду серйозних запалыних захворюваны ж1ночо! статево! сфери 1нфекц1йного характеру [2,7].

Метою роботи було вивчення складу нормалы-но! м1крофлори репродуктивного тракту жшок, а також анал1з асоц1ац1й м1кроорган1зм1в урогеы-талыного тракту при дисбютичних порушеннях.

Завданнями роботи було дослщити видовий спектр вид1лених м1кроорган1зм1в та провести по-р1внялыний анал1з частоти виявлення умовно-пато-генних штам1в, видтених з уроген1талыного тракту ж1нок р1зних в1кових груп.

Об'ект i методи дослщження. Об'ектом досл1-дження було вивчення складу м1крофлори та анал1з складу асоц1ац1й м1кроорган1зм1в уроген1талыного тракту ж1нок. Робота проводилася на баз1 Д1агнос-

тичного центру Днтропетровсько'! медично'| ака-демп, м. Днiпропетровськ в бактерюлопчнм лабо-paTopiï. Для проведення дослав на першому eTani дослщження обстежено 100 жiнок вiком вщ 18 до 55 рокiв. Для бактерюскотчного та бактерюлопчно-го дослiджeння за загальноприйнятою методикою проводився зaбiр видтень i3 повeрхнi шийки матки, цервкального каналу та пiхви. Основним живильним середовищем для висiву бiологiчного мaтeрiaлу - 5% кров'яний агар. Додатково використан сeлeктивнi живильнi середовища: середовище Ендо, серед-овище Сабуро та жовтково-сольовий агар). На на-ступному етап дослiджeнь для проведення aнaлiзу складу aсоцiaцiй мiкрооргaнiзмiв при дисбютичних порушеннях обстежено 200 жЫок за допомогою ПЛР у реальному чаЫ, що дозволяе отримувати якiсну i кiлькiсну оцiнку вaгiнaльного мiкробiоцeнозу та про-водити адекватну eтiотропну терапю дисбiозiв. Ма-тeрiaлом для дослщження методом ПЛР у реальному час служить зiшкрiб eпiтeлiaльних клiтин (задньобо-ковой звiд пiхви). Клiнiчний мaтeрiaл отримують одно-разовим стерильним Ыструментом типу «Cytobrush». Отриманий клiнiчний зразок помщають в пробiрку типу «Еппендорф», що мiстить транспортне серед-овище.

Результати дослщжень та ïx обговорення.

На першому eтaпi дослiджeнь вивчений мiкробний пейзаж урогeнiтaльного тракту жiнок рiзних вко-вих груп. При обстеженн усiх пaцiенток видiлeно 62 штами умовно-патогених мiкрооргaнiзмiв. Мiкро-бiологiчний мониторинг умовно-патогених мiкрооргa-нiзмiв (рис. 1) - збудниюв iнфeкцiй урогeнiтaльного тракту жЫок показав, що нaйчaстiшe видтяли, якi iдeнтифiкувaли як Ureaplasma spp. - 33,87%. Долева частка видтених бактерм виду Mycoplasma hominis була набагато меншою - 9,68%. ^м уреоплазм i мкоплазм в якост можливих умовних пaтогeнiв в 20,97% випадюв виступали дрiжeподiбнi гриби виду Candida albicans.

Серед грамнегативних мiкрооргaнiзмiв роди-ни Enterobacteriaceae домiнувaли iзоляти виду Escherihia coli (17,74%). В окремих випадках видтяли ентеробактерп видiв Klebsiella pneumoniae (8,06%), Proteus mirabilis (1,61%).

Серед представниюв грам позитивних мiкро-оргaнiзмiв бiльшу долеву частку складали штами St. рyogenes - 4,84, a S. aureus викликали порушення у 3,23 %.

St. pyogenes 4,84% Proteus mirabilis Klebsiela 1,61 pneumonie 8,06%

Escherihia coli 17,74%

Candida albicans 20,97%

S.

Ureaplasma spp.

33,87%

Mycoplasma hominis 9,68%

Рис. 1. Частота видшення умовно-патогених MÎKpoopraHÎ3MÎB з урогенiтального тракту жшок

Для проведення аналiзу динамiки змш MiKpo6Horo пейзажу урогенгтальноУ системи дослщжуваних пащ-енток умовно роздiлили на 3 bîkobî групи (табл. 1).

У жшок вком вiд 18 до 25 роюв найчастiше вияв-лялись мiкроорганiзми вiднесенi до виду Ureaplasma spp. (41,66%) i Mycoplasma hominis (16,67%), i лише по 4,17% видтених культур вiднесли до виду S. aureus та Proteus mirabilis.

Вщ пацieнток вiком 26-40 роюв в найбiльшiй юль-кост видiляли клiнiчнi штами, якi щентиф^вали як: Ureaplasma spp. (27,27%), Candida albicans (27,27%) i Klebsiella pneumoniae (15,16%). Але з вком рiвень естрогену та юльюсть лактобацил знижуеться, що зумовлюе поступове зрушення рН до нейтрального, зменшення юлькост дрiжджеподiбних грибiв i контанамiнацiï мiкроорганiзмами кишковоУ групи. Внаcлiдок цього у вковм групi 41-55 рокiв в най-бiльшiй кiлькоcтi видiлялиcь мiкроорганiзми видiв Ureaplasma spp. (40%), Mycoplasma hominis (20%), Escherihia coli (20%) та Candida albicans (20%).

Таблиця 1.

Склад видшено'Г м1крофлори урогештального тракту ж1нок р1зних в1кових груп

Вид м1кроорга-шзму Частота видшення клЫчних штам1в м1кроорган1зм1в,%

1група 18-25 рок1в II група 26-40 рок1в III 41 -55 рок1в

n=24 % n=33 % n=5 %

Escherihia coli 3 12.50 7 21.21 1 20

Klebsiella pneumoniae 0 0 5 15.16 0 0

Proteus mirabilis 1 4.17 0 0 0 0

S. aureus 1 4.17 1 3.03 0 0

St. рyogenes 2 8.33 1 3.03 0 0

Ureaplasma spp. 10 41.66 9 27.27 2 40

Mycoplasma hominis 4 16.67 1 3.03 1 20

Candida albicans 3 12.5 9 27.27 1 20

На наступному етапi дослiджень провели де-тальнiший аналiз складу мiкрофлори 200 жiнок репродуктивного вiку за допомогою ПЛР у реальному час1, що дозволяв отримувати як яюсну, так \ юльюсну оцшку вапнального мкробюценозу та проводити адекватну етютропну терапю дис-бюз1в. На рис. 2 представлен! дан1 про частоту виявлення асоц1ацм мкроорган1зм1в у юлькост1 бтьше 104.

3 рис. 2 видно, що у бшы±юст1 випадюв дис-бактерюзи мають пол1мкробну етюлопю, тобто характерне одночасне виявлення асоц1аци мкро-орган1зм1в. У нашому дослщжены показано, що для ряду зразюв (50/25%) визначено стан норми. За результатами аналiзу 150 решти зразкiв визначено дисбактерiоз. При цьому монозбудни-ки виявлено у 65 (32,5%) зразюв. Моноiнфекцi,i представлен гарднерельозом, що складае 18% i кандидозом - 14,5%. Для шших 85 (42,5%) зраз-кiв бюлопчного матерiалу виявлено асоцiацiI мкро-органiзмiв. Порiвнюючи отриманi результати з да-ними лiтератури можна зробити висновок, що такий високий рiвень асо^ацм у жiнок репродуктивного вiку при дисбютичних порушеннях обумовлено здат-нютю мiкроорганiзмiв до плiвкоутворення [2].

Асо^ацм мiкроорганiзмiв при дисбiозi виявлено у 85% жшок, яких було подтено на 3 групи: 18-25 роюв, 26-40 роюв, 41-45 роюв (табл. 2).

Таблиця 2.

Частота виявлення асощацш мiкроорганiзмiв урогештального тракту жшок рiзних вшових груп

BiKOBa група 18-25 рок1в 26-40 рок1в 41 -55 рок1в

Склад зовшшнш Частота виявлення,абс/%

Candida spp., Gardnerela vaginalis/ Prevotella bivia/ Porhynomonas spp. 15/65,22 6/26,09 2/8,69

Gardnerela vaginalis/ Prevotella bivia/Porhyno-monas spp., Eubacte-rium spp., Candida spp. 11/68,75 4/25 1/6,25

Gardnerela vaginalis/ Prevotella bivia/Porhyno-monas spp., Eubacteri-um spp.,Megasphera spp./ Veilonella spp./ Dialister spp. 4/28,57 8/57,14 2/14,29

Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Eu-bacterium spp., Megas-phera spp./Veilonella spp./ Dialister spp. 5/41,67 5/41,67 2/16,66

Enterobacteriaceae, Gardnerela vaginalis/ Prevotella bivia/Porhynomonas spp., Eubacterium spp. 3/33,33 4/44,45 2/22,22

Streptococcus spp.,Staphylo-coccus spp. 3/50 2/33,33 1/16,67

Eubacterium spp., Enterobacteriaceae, Clostridium spp. 1/20 1/0 3/60

Асощацт 5 4,5% Асощацт 4_ 6%

Асощацт 3 7%

Асощацт 2 8% Асощацт 11,5%

Асощацт 6

Асощацт 7

2,5%

Нормоценоз 25%

Кандид%з

14,5

%

Гарднерельоз 18%

Рис. 2. Частота виявлення мшробних асоцiацiй при дисбiотичних порушеннях урогенiтального тракту у жшок

Примггка: Асоц|ац|я 1: Candida spp., Gardnerela vaginalis/Prevotella bivia/ Porphyromonas spp.; Асоц1ацт 2: Gardnerela vaginalis/ Prevotella bivia/Por-phyromonas spp., Eubacterium spp., Candida spp.; Асоц1ацт 3: Gardnerela vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp.,Megasphera spp./Veilonella spp./Dialister spp.; Асоц1ацт 4: Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Eubacterium spp., Megasphera spp./Veilonella spp./Dialister spp.; Асоц1ацт 5: Enterobacteriaceae, Gardnerela vaginalis/Prevotella bivia/ Porphyromonas spp., Eubacterium spp.; Асоц1ацт 6: Streptococcus spp., Staphylococcus spp.; Асоц1ацт 7: Eubacterium spp., Enterobacteriaceae, Clostridium spp.

В pi3HMX вкових групах динамка зус^чаемосп кожно! асощацп MkpoopraHi3MiB мала певн вщмш-HOCTi, яю, вiрогiдно, можна пояснити гормонозалеж-ними змшами впродовж життя (перiод менструацп, менопаузи, вагiтнiсть), що суттево впливають на якiсний та кiлькiсний склад асо^ацм пiхвовоI мкро-флори. Найбтыша кiлькiсть асоцiацiй мкрооргаыз-мiв зустрiчаласы у жiнок репродуктивного вiку, серед яких переважали: Candida spp., Gardnerela vaginalis/ Prevotella bivia/Porphyromonas spp. i Gardnerela vaginalis/ Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Candida spp.

Висновки

1. Встановлено, що до складу мкрофлори уроге-нггалыного тракту, дослщжуваних жшок, що зверну-

лися до Дiагностичного центру медично! академй' м. Днтропетровськ 2015 року, входять умовно-патогены мкроорганмзми, яю вщносяться до род1в Ureaplasma spp. (33,87%), Mycoplasma hominis (9,68%), Candida (20,97%), Escherichia (17,74%), Klebsiella (8,06%), Proteus (1,61%), Streptococcus (4,84%), Staphylococcus (3,23%).

2. Проведено пор1вняльний анал1з часто-ти видтення умовно-патогенних мкроорга-Hi3MiB у жшок р1зних вкових груп: найбтьша юлькють ктмычних штам1в видтялася у жшок вком 26-40 poKiB, яю щентифкували як: Ureaplasma spp. (27,27%), Candida albicans (27,27%), Escherihia coli (21,21%), Klebsiella pneumoniae (15,16%) i по 3,03% S. aureus, St. pyogenes, Mycoplasma hominis.

3. За допомогою ПЛР у реальному час дослщили частоту виявлення мкробних асо-^ацм при дисбютичних порушеннях уроге-нггалыного тракту у жiнок. Показано, що для ряду зразюв (25%) визначено стан норми. За результатами аналiзу решти зразкiв (75%) визначено дисбактерюз. При цыому моно-збудники виявлено у 32,5% зразюв. Моно-шфекци представленi гарднерелыозом, що складае 18% i кандидозом - 14,5%. Для Ыших

42,5% зразкiв бiологiчного матерiалу виявлено асоцiацiI мiкроорганiзмiв, серед яких переважали: Candida spp., Gardnerela vaginalis/ Prevotella bivia/ Porphyromonas spp. i Gardnerela vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Candida spp.

Перспективи подальших дослщжень

Отриманнi резулытати свiдчаты про появу нових асо^ацм мiкроорганiзмiв, що призводяты до дис-бiотичних порушены мкрофлори урогенггалыного тракту жiнок. Це вказуе на необхщнюты проведення постмного монiторингу антибютикорезистентнос-тi збудникiв дисбiозiв пiхви жiнок для вибору опти-малыних схем антибiотикотерапiI з урахуванням бюлопчних властивостей окремих штамiв-збудникiв дисбаланЫв.

Лiтература

. Авакян Г. С. Особенности анаэробной микрофлоры влагалища у женщин с невынашиванием беременности, перенесших хронические вульвовагиниты в детском возрасте / Г. С. Авакян, Р. А. Абрамян, Н. Р.Саркисян. Сб. науч. трудов IV Всероссийской конференции по детской и подростковой гинекологии: Современные профилактические, диагностические и терапевтические технологии в клинике гинекологии. М. - 2000. - 107 с.

. Бюлопчш властивост бактерш роду Staphylococcus, видшених вщ пащен^в Дшпропетровсько'У клЫчно'У лкарш iм. I. I. Мечнкова / Ю. Ю. Нкулша, К. В. Лаврентьева, Н. В. Черевач [и др.] // Вюник Дшпропетровського ушверситету. Бюлопя. Медицина. - 2011. - Вип. 2, Т.1. - С. 101-106.

. Боровкова Е. И. Микрофлора половых путей у женщин репродуктивного возроста / Е. И. Боровкова, И. С. Сидорова // Практическая медицина. - Москва. - 2007. - 80 с.

. Подольський В. В. 1нфекцмно - запальш процеси жшочих статевих оргашв та Ух лкування антигено-токсичними препаратами / В. В. Подольський, В. Л. Дронова, М. А.Латишева // Методичш рекомбшацп. - КиУв. - 2006. - 34 с.

. Прилепская В. Н. Особенности инфекционных процессов отдельных половых путей женщин репродуктивного возраста / В. Н. Прилепская // Акушерство и гинекология. - 2003. - С. 2-5.

. An altered immunity hypothesis for the development of symptomatic bacterial vaginosis / S. S. Witkin, I. M. Linhares, P. Giraldo, W. J. Ledger // Clin. Infect. Dis. - 2007. - Vol. 44, N 4. - P. 554-557.

. Prevalence of Bacterial Vaginosis and Vaginal Flora Changes in Peri- and Postmenopausal Women / Cauci S., Driussi S., De Santo D. [et al.] // Journal of Clinical Microbiology - 2002, 40(6), 2147-2152.

. St John E. Bacterial vaginosis and host immunity / E. St John, D. Mares, G. T. Spear // Curr. HIV/AIDS Rep. - 2007. - Vol. 4, №1. -P. 22-28.

УДК 579.61:616-078

ДОСЛ1ДЖЕННЯ АСОЦ1АЦ1Й М1КРООРГАН1ЗМ1В УРОГЕН1ТАЛЬНОГО ТРАКТУ Ж1НОК ЗА ДОПОМО-ГОЮ ПЛР В РЕАЛЬНОМУ ЧАС1

Ядерна А. Г., Голодок Л. П., Хлопова О. В., Вшшков А. I.

Резюме. Визначено видовий спектр збудниюв дисбiотичних порушень урогенггального тракту у жiнок. Показано, що для ряду зразкiв (25%) визначено стан норми. За результатами аналiзу решти зразкiв (75%) визначено дисбактерюз. При цыому монозбудники виявлено у 32,5%. Для Ыших 42,5% зразюв бiологiчного матерiалу виявлено асощацп мiкроорганiзмiв, серед яких переважали: Candida spp., Gardnerela vaginalis/Prevotella bivia/ Porphyromonas spp. i Gardnerela vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Candida spp.

Ключовi слова: збудники дисбютичних порушены урогеытального тракту, моноЫфекцп, асоцiацiI мiкро-органiзмiв.

УДК 579.61:616-078

ИССЛЕДОВАНИЕ АССОЦИАЦИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРАКТА ЖЕНЩИН С ПОМОЩЬЮ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

Ядерная А. Г., Голодок Л. П., Хлопова Е. В., Винников А. И.

Резюме. Определен видовой спектр возбудителей дисбиотических нарушений урогениталыного тракта у женщин. Показано, что для ряда образцов (25%) определено состояние нормы. По результатам анализа остальных образцов (75%) определен дисбактериоз. При этом моновозбудителей выявлено у 32,5% образцов. Для других 42,5% образцов биологического материала выявлены ассоциации микроорганизмов, среди которых преобладали: Candida spp., Gardnerela vaginalis/ Prevotella bivia/Porphyromonas spp. и Gardnerela vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Candida spp.

Ключевые слова: возбудители дисбиотических нарушений урогенитального тракта, моноинфекции, ассоциации микроорганизмов.

UDC 579.61:616-078

THE STUDY OF MICROBIAL ASSOCIATIONS IN THE UROGENITAL TRACT OF WOMEN USING REAL-TIME PCR

Yaderna A. H., Golodok L. P., Khlopova O. V., Vinnikov A. I.

Abstract. Vaginal-cervical microflora is a natural physiological barrier that ensures stability of the urogenital tract to the growth and reproduction of various infectious agents. Today, any violation of vaginal biotope should be considered as dysbiosis. The imbalance of the biota of the female urogenital tract is a violation of the quantitative-qualitative relationships of resident saprophytic and conditionally pathogenic microorganisms that inhabit the normal urinary system.

The aim of this work was to study the composition of the normal microflora of the reproductive tract of women, as well as to analyze the microbial associations of the urogenital tract in dvsbiotic disorders.

The object of this study was to examine the composition of the microflora and the composition of microbial associations in the urogenital tract of women. The work was carried out on the basis of the Diagnostic Center of Dni-propetrovsk Medical Academy, Dnipropetrovsk in the bacteriological laboratory. For conducting experiments at the first stage of the stud 100 women aged 18 to 55 years were examined. As a result of the examination of all patients 62 strains of conditionally pathogenic microorganisms have been allocated. The microbiological monitoring of conditionally pathogenic microorganisms - pathogens of the female urogenital tract showed that most of the microorganisms isolated were identified as Ureaplasma spp. - 33,87%. The percentage share of the isolated bacteria of the species Mycoplasma hominis was much less - 9,68%. In addition to ureaplasmas and mycoplasmas it was found that yeastlike fungi species Candida albicans acted as possible conditional pathogens in 20,97% of the cases. Among gramnegative bacteria of the family Enterobacteriaceae dominated the isolates of the species Escherihia coli (17,74%). Among the representatives of gram-positive microorganisms of greatest percentage share belonged to the strains of St. рyogenes - 4,84,while S. aureus caused violations of 3.23 %.

To analyze the dynamics of the microbial landscape changes in the urogenital system of the patients the women examined were divided into 3 age groups. In women aged 18 to 25 years the microorganisms related to the species Ureaplasma spp. (41,66%) and Mycoplasma hominis (16,67%) were found more often.

In patients aged 26-40 years the greatest number of isolated clinical strains were identified as Ureaplasma spp. (27,27%), Candida albicans (27,27%) and Klebsiella pneumoniae (15,16%). In the age group from 41 to 55 years the microorganisms allocated in the greatest numbers were those of the species Ureaplasma spp. (40%), Mycoplasma hominis (20%), Escherihia coli (20%) and Candida albicans (20%).

In the next phase of the research there was conducted a more detailed analysis of the microflora composition of 200 women of reproductive age using real-time PCR, which allows to obtain both qualitative and quantitative assessment of vaginal microbiocenosis. It is shown that for a number of samples (25%) the state of norm has been identified. According to the analysis of the remaining samples (75%) a dysbiosis has been found. Mono pathogens have been identified in 32,5% of the samples. In other 42,5%o of the samples of biological material there have been identified associations of microorganisms, among which prevailed: Candida spp., Gardnerela vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp. and Gardnerela vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp. Eubacterium spp., Candida spp.

Keywords: bacterial vaainosis, candidiasis, monoinfections, microbial associations.

Рецензент - проф. Лихолат Ю. В.

Стаття надшшла 02.11.2015 року